Name: neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Eiwitexpressie, zuivering en kristallisatie-experimenten werden uitgevoerd in het Center for Structural Molecular Biology (CSMB), een U.S. Department of Energy Biological and Environmental Research User Facility in Oak Ridge National Laboratory. Neutronendiffractiegegevens werden verzameld bij BL-11B MaNDi bij de Spallation Neutron Source (SNS) bij ORNL, die wordt gesponsord door de Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. De auteurs bedanken Brendan Sullivan voor hulp bij datareductie. Röntgendiffractiegegevens werden verzameld in de faciliteiten van het Molecular Education, Technology and Research Innovation Center (METRIC) aan de North Carolina State University, die wordt ondersteund door de staat North Carolina. GCS erkent mede de steun van de National Research Foundation (NRF), Zuid-Afrika en het Graduate Opportunities (GO!) programma bij ORNL. FM erkent de steun van USDA NIFA Hatch 211001.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Neutroneneiwitkristallografie is een zeer gevoelige techniek om protonatietoestanden en watermolecuuloriëntatie in eiwitten te onderzoeken. Deze informatie werpt licht op eiwitkatalytische mechanismen, omdat veranderingen in protonatie- en waterstofbindingsinteracties vaak centraal staan in de enzymchemie10. Neutroneneiwitkristallografie, hoewel een informatieve techniek, heeft een aantal factoren waarmee rekening moet worden gehouden voordat u van plan bent een neutronendiffractie-experiment uit te voeren, namelijk:
<ol><li>De behoefte aan grote eiwitkristallen voor het verzamelen van gegevens.</li>
	<li>De verstrooiingseigenschappen van waterstof en andere elementen, zoals metaalionen.</li>
	<li>Beperkingen in de structuurverfijning en modelbouwsoftware bij het werken met gedeutereerde monsters.</li>
</ol>Neutroneneiwitkristallografie is een fluxbeperkte techniek. In tegenstelling tot röntgendiffractie datasets worden hogere R-factoren en lagere volledigheid, redundantie en signaal-ruisverhoudingen verwacht voor neutronen datasets vanwege de inherente beperkingen van de techniek (flux limited, quasi-Laue, langere golflengten). Het verzamelen van gegevens van een enkel frame duurt meestal 12 - 18 uur. Het succes van een experiment is sterk afhankelijk van de monstergrootte en -kwaliteit, waarbij kristallen van 0,1 mm3 vaak de minimumvereiste zijn3. Neutronendiffractie vereist de productie van grote hoeveelheden eiwit om kristallisatiedruppels op te zetten, variërend van 10 tot 800 μL. Het minimale volume voor het kweken van voldoende grote kristallen kan worden geschat met behulp van een volumecalculator op basis van de kristal- en monsterparameters (https://neutrons.ornl.gov/imagine). De groei van grote kristallen is het meest tot stand gekomen door dampdiffusie3. Hangende druppelkristallisatie maakt de groei van kristallen in grote druppels variërend van 10-25 μL mogelijk, terwijl grotere druppels tot ~ 50 μL kunnen worden ingesteld met behulp van in de handel verkrijgbare zitdruppelapparatuur14,54. Gesiliconiseerde glasplaten met negen putten kunnen worden gebruikt om zeer grote druppels op te zetten, met volumes tot 800 μL. Deze glazen platen worden geplaatst in "sandwichboxen" die in de handel verkrijgbaar zijn bij Hampton Research. Verdere kristallisatietechnieken omvatten batchkristallisatie, waarbij de limiet van de druppelgrootte wordt bepaald door het vat. Het opzetten van batchkristallisatie-experimenten kan variëren van microliter tot milliliter55. Kristallisatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van de dialysetechniek waarbij het eiwit in evenwicht wordt gebracht met het neerslag via een dialysemembraan of door tegendiffusie langs een precipitantconcentratiegradiënt of door een poreuze plug zoals agarose56,57. Zaaien biedt een ander alternatief om kristallen van het gewenste volume te verkrijgen. Micro- en macroseeding zijn met succes gebruikt voor grote kristalgroei, waaronder groot kristal van NcLPMO9D45. Enige kennis van het eiwitfasediagram, inclusief de invloed van temperatuur op de oplosbaarheid, helpt bij grote kristalgroei.
Bij het plannen van een neutronendiffractie-experiment is optimalisatie van het eiwitpreparaat om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren tijdens het verzamelen van diffractiegegevens essentieel7. Om dichtheidsannulering en hoge onsamenhangende verstrooiing veroorzaakt door H-atomen te omzeilen, kunnen neutronen-SLD-kaarten worden verbeterd door H-atomen uit te wisselen voor zijn isotoop D, die een positieve coherente verstrooiingslengte en lage onsamenhangende verstrooiingslengte bezit. Om dit te bereiken, wordt dampuitwisseling van het gehydrogeneerde eiwitkristal tegen gedeutereerde kristallisatiebuffer uitgevoerd. Dit zorgt voor H/D-uitwisseling van oplosmiddelmoleculen en het labiele, titreerbare eiwit H-atomen23. Dampuitwisseling wordt uitgevoerd door het gehydrogeneerde kristal in een kwartscapillair te monteren met op D2O gebaseerde, gedeutereerde kristallisatiebuffer "pluggen" en het vertegenwoordigt een effectieve, zachte techniek die meestal wordt toegepast14,23,35. De uitwisseling kan enkele weken duren en vereist bij voorkeur dat de gedeutereerde buffer regelmatig wordt gewijzigd om een maximale H / D-uitwisseling te garanderen. H/D-uitwisseling kan ook worden uitgevoerd door het kristal direct in de gedeutereerde buffer te weken. Om te voorkomen dat het kristal onder druk komt te staan als gevolg van D2O-blootstelling, moet het inweekproces geleidelijk worden uitgevoerd door de D2O: H2O-verhouding geleidelijk te verhogen58. Daarnaast kan kristallisatie van gehydrogeneerd eiwit ook worden uitgevoerd in gedeutereerde buffer voor H/D-uitwisseling op labiele H-locaties22,59. Er moet echter worden opgemerkt dat op D2O gebaseerde buffer een effect heeft op de oplosbaarheid van eiwitten, waardoor verdere aanpassing van de bekende op H2O gebaseerde omstandigheden vereist3,59. D2O-gebaseerde buffers zijn ook waargenomen om in sommige gevallen tot kleinere kristallen te leiden59. Volledige uitwisseling van titreerbare en koolstofgebonden H-atomen naar D kan worden bereikt door eiwitten in gedeutereerde media tot expressie te brengen om een geperfectioneerd monster te genereren20. De resulterende neutronen-SLD-kaarten van het geperfectioneerde monster zullen aanzienlijk worden verbeterd, waardoor niet langer de dichtheidsanschakeling van de gehydrogeneerde monstertegenhanger wordt weergegeven. Dit is gunstig bij het karakteriseren van H / D gebonden op niet-uitwisselbare plaatsen in een eiwit of cofactor. De expressie van geperfectioneerd eiwit is echter zowel duur als laag in opbrengst60. Het Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) biedt een deuteratiefaciliteit voor gebruikers die een geperfectioneerd monster (https://www.ornl.gov/facility/csmb) willen genereren. Geperfectioneerde expressie wordt meestal uitgevoerd in een bioreactor op de schaal van 1 L die ~ 50 mg gezuiverd eiwit61 oplevert.
Na het verzamelen van neutronendiffractiegegevens wordt verfijning en interactieve modelbouw uitgevoerd. Refinement kan worden uitgevoerd met behulp van meerdere softwaresuites, waaronder phenix.refine, nCNS of SHELXL28,31,32,33. De Phenix-suite is de meest gebruikte software voor verfijning van neutronendiffractiegegevens in combinatie met Coot, die wordt gebruikt om het model handmatig te bouwen op basis van de neutronen-SLD-kaarten34. Hoewel zowel Phenix als Coot de verwerking van neutronendiffractiegegevens mogelijk maken, kunnen ze bepaalde functies missen die nodig zijn om de eigenaardigheden te verwerken die verband houden met neutronengegevens en gedeutereerde monsters. Coot bevat bijvoorbeeld geen geometrie-optimalisatie voor gedeutereerde residuen, wat kan leiden tot complicaties tijdens het bouwen van het model, omdat de functie "Real Space Refine" resulteert in "exploderende" residuen (aanvullende figuur 26)62. Dit kan worden opgelost door beveiligingsbestanden te genereren voor alle gedeutereerde residuen. Dit is echter een intensief proces en dergelijke bibliotheken zijn momenteel niet openbaar beschikbaar. Bij het uitvoeren van verfijningen in Phenix worden in eerste instantie verwisselbare H / D-sites ingesteld op 0,50 bezetting voor H en D. Naarmate verfijningen worden uitgevoerd, zal de bezetting van H en D worden verfijnd volgens de neutronen-SLD-kaarten. Tijdens interactieve modelbouw zijn Fo-Fc-kaarten met verschildichtheid zeer informatief bij het beoordelen van H / D-bezettingen. Kaarten kunnen worden gebruikt om te bepalen welke sites een hoge D-bezetting hebben, wat met name informatief is op de actieve site waar protonatietoestanden katalytisch relevant zijn63. Dubbelzinnige situaties doen zich echter voor wanneer de H:D bezetting is dicht bij 0.70:0.30 wat resulteert in volledige signaalannulering in neutronen SLD kaarten64. Er moet ook rekening mee worden gehouden dat quasi-Laue neutronengegevenssets vaak een volledigheid hebben van ongeveer 80%, wat lager is dan de routinematig waargenomen ≥ 98% voor röntgendiffractiegegevens. Bij het verfijnen van neutronendiffractiegegevens in Phenix worden daarom de ontbrekende waargenomen amplitudes (Fo) berekend uit het model om de reflectielijst te voltooien, waardoor modelbias wordt geïntroduceerd. Om rekening te houden met deze mogelijke vertekening moeten "no_fill" -kaarten worden onderzocht tijdens interactieve modelbouw in tegenstelling tot "gevulde" kaarten.
Gebruikers kunnen ervoor kiezen om een gezamenlijke röntgen- / neutronengegevensverfijning van hun structuur uit te voeren, of een verfijning van alleen neutronengegevens. Het visualiseren van neutronen SLD-kaarten, met name bij een lagere resolutie, kan in eerste instantie verontrustend zijn, vooral voor een gehydrogeneerd eiwit waarin H nog steeds aanwezig is op niet-uitwisselbare locaties ondanks H / D-dampuitwisseling. Dit resulteert in annuleringen van neutronendichtheidskaarten, waardoor de indruk wordt gewekt van discontinue kaarten65,66. Het verzamelen van een overeenkomstige röntgendataset vult deze annuleringen op een voordelige manier aan in een gezamenlijke verfijning (figuur 13A en figuur 13B). Een gezamenlijke verfijningsstrategie omvat meestal het verfijnen van de eiwitbackbonecoördinaten ten opzichte van de röntgengegevens, terwijl de neutronendiffractiegegevens worden gebruikt om de positie en bezetting van de H / D-atomen op uitwisselbare locaties te verfijnen28. Aangezien de introductie van gezamenlijke H/D-bezetting op uitwisselbare locaties het aantal parameters verhoogt dat wordt verfijnd, verhoogt een gezamenlijke verfijning met röntgengegevens ook de data-tot-parameterverhouding. Een gezamenlijke verfijning vereist dat een overeenkomstige röntgendataset bij dezelfde temperatuur wordt verzameld op hetzelfde kristal of een kristal dat onder dezelfde omstandigheden is gekweekt. Voor neutronendiffractiegegevens die bij kamertemperatuur (300K) worden verzameld, moet de overeenkomstige röntgengegevensset bij kamertemperatuur worden verzameld met behulp van een strategie voor het verzamelen van gegevens met een lage dosis om stralingsschade te beperken. Geperuteerde monsters daarentegen bieden verbeterde en continue neutronen SLD-kaarten, omdat ze niet dezelfde grootte van H / D-signaalannulering bezitten. De neutronenverstrooiingslengte van bepaalde elementen, waaronder metalen en zwavel, maakt ze echter slecht zichtbaar in neutronen-SLD-kaarten, zelfs als het eiwit is geperfectioneerd (figuur 13C-F)18. Als een metaal moet worden gekarakteriseerd, is het het beste om röntgendiffractie te gebruiken in een gezamenlijke verfijning of spectroscopische technieken toe te passen om diffractie-experimenten aan te vullen. Neutronen-only data verfijningen worden vaak uitgevoerd wanneer de neutronen dataset een hoge resolutie heeft of als een geperfectioneerd eiwit werd gebruikt. Bovendien is de verfijning van gegevens over alleen neutronen bijzonder nuttig als een eiwit dat zeer gevoelig is voor stralingsschade wordt bestudeerd, omdat een van röntgenstraling afgeleide structuur stralingsgeïnduceerde artefacten kan bezitten. Om een verfijning van alleen neutronengegevens uit te voeren, moet worden nagegaan of de overeenkomstige neutronendataset voldoende volledigheid en resolutie heeft.
ORNL biedt twee faciliteiten voor het verzamelen van neutronendiffractiegegevens: de IMAGINE-bundellijn bij de HFIR en de MaNDi-bundellijn bij de SNS36,67. Hoewel beide instrumenten effectieve middelen bieden voor het verzamelen van een neutronendiffractiedataset met vergelijkbare principes, heeft elk instrument unieke specificaties waarmee rekening moet worden gehouden bij het aanvragen van bundeltijd. IMAGINE verzamelt quasi-Laue-gegevens en is geoptimaliseerd voor het verzamelen van kamertemperatuurgegevens over kristallen met eenheidscellen tot ~ 100 Å. MaNDi kan worden gebruikt voor het verzamelen van kamertemperatuur- en cryotemperatuurgegevens met behulp van TOF-Laue-verzameling op kristallen met eenheidscellen tot ~ 300 Å. Voorafgaand aan het verzamelen van een volledige dataset, wordt een test uitgevoerd op het kristal om de kwaliteit van het verkregen diffractiepatroon te evalueren waarin het kristal wordt blootgesteld aan de neutronenbundel voor een enkel frame. Als het kristal van voldoende kwaliteit is, zal een volledige neutronendiffractie-dataset worden verzameld, geïndexeerd, geïntegreerd, geschaald en samengevoegd in een proces dat analoog is aan röntgengegevensverwerking. IMAGINE maakt gebruik van Lauegen en Lscale en MaNDi maakt gebruik van het Mantid-pakket en maakt gebruik van driedimensionale profielfitting48,50,51,68,69,70. Wetenschappers die gebruikers worden in een van deze faciliteiten zullen worden voorzien van een dataset in MTZ- of HKL-formaat voor verdere analyse.
Neutronendiffractie is een niet-destructieve, zeer gevoelige techniek voor het onderzoeken van de protonatietoestand en waterstofbruginteracties van biologische macromoleculen. Het is vooral nuttig voor fotogevoelige eiwitten en metalloproteïnen. Verschillende overwegingen met betrekking tot de techniek en de verwerking van de gegevens moeten in aanmerking worden genomen voordat een experiment wordt uitgevoerd, maar de uitkomst levert resultaten op die waardevol inzicht kunnen geven in het katalytische mechanisme van het eiwit van belang. Neutroneneiwitkristallografie vormt een aanvulling op computationele, structurele, biochemische en spectroscopische studies, waardoor het een waardevol hulpmiddel is in de toolbox van de bioloog met technieken die worden gebruikt om biologische macromoleculen te karakteriseren.

Neutronen macromoleculaire kristallografie is een techniek die een uniek venster biedt op de structuur en onderliggende chemie van eiwitten. Conceptueel vergelijkbaar met röntgendiffractie, biedt neutronendiffractie atomistische details van de macromoleculaire structuur, maar de interactie van neutronen met kernen maakt lokalisatie van lichtatomen mogelijk, vaak moeilijk te detecteren met röntgendiffractie1. Tijdens röntgendiffractie verstrooien röntgenstralen vanuit de elektronenwolk, waardoor lichtatomen zoals waterstof (H) slecht zichtbaar zijn in elektronendichtheidskaarten die geen resolutie in de buurt van sub-Ångström hebben2. De verstrooiingsintensiteit van neutronen hangt daarentegen af van complexe interacties met de kern, waarbij isotopen van hetzelfde element verschillende verstrooiingslengten vertonen. Daarom hebben lichte atomen en hun isotopen, zoals waterstof (1H) en deuterium (2H of D), een vergelijkbare zichtbaarheid als de ruggengraat koolstof-, stikstof- en zuurstofatomen in neutronenverstrooiingslengtedichtheid (SLD) kaarten. Bovendien, aangezien de grootte van neutronenverstrooiing onafhankelijk is van het aantal elektronen, wordt verstrooiing van lichte elementen niet verduisterd door zware elementen wanneer ze zich dicht bij elkaar bevinden, zoals wordt waargenomen bij röntgenverstrooiing. De verbeterde zichtbaarheid van H en zijn isotoop D bij het gebruik van neutronendiffractie levert waardevolle informatie op over de protonatietoestand van katalytisch belangrijke residuen, cofactoren en liganden en helpt de oriëntatie van watermoleculen, waardoor belangrijke informatie over katalytische mechanismen en eiwitchemie wordt onthuld3. Neutronendiffractie biedt ook het voordeel dat het een niet-destructieve techniek is, met name geschikt voor biologische monsters die gevoelig zijn voor ionisatie, zoals eiwitten met metaalcentra of lichtgevoelige redoxcofactoren2. De primaire focus van dit artikel is om een overzicht te geven van de workflow om een hoogwaardige neutroneneiwitkristalstructuur te verkrijgen. We verwijzen de geïnteresseerde lezer naar Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 en O'Dell et al.3 voor een uitstekend overzicht van neutroneneiwitdiffractie en Ashkar et al.7 voor verdere toepassingen van neutronenverstrooiing.
Neutronen worden voornamelijk gegenereerd tijdens kernreacties waarbij gebruik wordt gemaakt van een van de twee processen: kernsplijting bij reactorbronnen of spallation bij versnellerbronnen8. Reactorbronnen leveren een continue neutronenbundel door gebruik te maken van kernsplijting van de 235U-isotoop, terwijl spallation neutronenbronnen een gepulseerde neutronenbundel produceren door een doelwit, bijvoorbeeld een vloeibaar metaal zoals kwik, te bombarderen met protonen9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) in Oak Ridge, Tennessee, herbergt zowel een steady-state neutronenbron in de High Flux Isotope Reactor (HFIR) als een 60 Hz gepulseerde bron bij de Spallation Neutron Source (SNS). De IMAGINE-bundellijn, gelegen aan de HFIR, is een neutronendiffractometer geoptimaliseerd voor biologische macromoleculen (aanvullende figuur 1)10. IMAGINE maakt gebruik van een neutronenbeeldplaatdetector om quasi-Laue-gegevens te meten met behulp van een smalle banddoorgang in het bereik van 2,8 - 4,5 Å van enkele kristallen met eenheidscelranden <150 Å. De Macromolecular Neutron Diffractometer (MaNDi), gelegen op het SNS, is een time-of-flight (TOF) Laue neutronendiffractometer uitgerust met een sferisch detector array frame (DAF) (Aanvullende figuur 2)11. MaNDi meet gegevens van enkele kristallen met eenheidscelranden in het bereik van 10 - 300 Å door een instelbare 2 Å-golflengtebandbreedte tussen 2,0 - 6,0 Å12 te gebruiken.
Het proces van het genereren van neutronen is zeer energie-intensief, wat resulteert in relatief zwakke neutronenbundelfluxen in tegenstelling tot röntgenstraalfluxen bij synchrotronbronnen13. Om te zorgen voor voldoende signaal-ruisverhoudingen tijdens het verzamelen van gegevens, is het noodzakelijk om kristallen van geschikte grootte en kwaliteit te laten groeien14. Doorgaans zijn kristallen met volumes > 0,1 mm3 nodig om gegevens te verzamelen met adequate statistieken15. Naast lagere fluxen moet rekening worden gehouden met de inherente eigenschappen van de interactie tussen neutronen en de monsterkernen16. De verstrooiingslengte van neutronen verschilt voor isotopen van hetzelfde element, een eigenschap die voordelig kan worden gebruikt in small angle neutron scattering (SANS) om gebieden van een monster te maskeren of te markeren - een proces dat bekend staat als contrastmatching17. In diffractie-experimenten kan de negatieve coherente neutronenverstrooiingslengte van H (-3,741 fm voor 1H) leiden tot annulering van neutronenverstrooiingsdichtheidskaartkenmerken, omdat de coherente neutronenverstrooiingslengten van andere biologisch relevante atomen, waaronder koolstof (6,6511 fm voor 12C), stikstof (9,37 fm voor 14N), zuurstof (5,803 fm voor 16O), fosfor (5,13 fm voor 31P) en zwavel (2,804 fm voor 32S) zijn positief (tabel 1)12,14. Bovendien verhoogt de grote onsamenhangende verstrooiingslengte van H (25.274 fm) de achtergrond tijdens het verzamelen van gegevens, waardoor de kwaliteit van de dataset wordt belemmerd en de gegevensresolutie in gevaar komt7. Om deze door H ingevoerde beperkingen te omzeilen, is het voor neutronendiffractie noodzakelijk om H in te ruilen voor zijn isotoopdeuterium, 2H(D), dat een positieve coherente neutronenverstrooiingslengte heeft (6,671 fm) en een aanzienlijk lagere onsamenhangende verstrooiingslengte (4,04 fm)19. Dit kan worden bereikt door perdeuteratie, een proces waarbij het eiwit wordt uitgedrukt door organismen die zijn gekweekt in volledig gedeutereerde media die zorgen voor volledige opname van D op H-locaties20. Het is ook mogelijk om eiwit gedeeltelijk te deutereren door H uitsluitend op de verwisselbare plaatsen (titreerbare groepen) door H te vervangen door D, terwijl de niet-uitwisselbare koolstofgebonden locaties gehydrogeneerd blijven21. Dit kan worden bereikt door groei van gehydrogeneerde eiwitkristallen in gedeutereerde moederloog22. Meestal wordt de H/D-uitwisseling van gehydrogeneerde eiwitten echter uitgevoerd door dampuitwisseling na groei van voldoende grote kristallen in H2O-gebaseerde buffer23. In dergelijke gevallen worden kristallen gemonteerd in een kwartscapillair en damp-gebalanceerd met een op D20 gebaseerde moederloog.
De beperkte neutronenfluxen bij neutronenbronnen resulteren in langere dataverzamelingstijden, variërend van dagen tot enkele weken24. Bij ORNL gebruiken zowel IMAGINE als MaNDi een smalle golflengtebandpass in het bereik van 2-6 Å om de gegevensverzameling te optimaliseren25. Gegevens kunnen worden verzameld bij kamertemperatuur of bij cryo-temperatuur. Cryo-dataverzameling kan de datakwaliteit mogelijk verbeteren en opent de mogelijkheid voor freeze-trapping katalytische tussenproducten. Na het verzamelen van neutronendiffractiegegevens wordt meestal een röntgendataset verzameld op hetzelfde kristal bij dezelfde temperatuur of op een kristal dat onder identieke omstandigheden is gekweekt26. Gegevensverzameling bij dezelfde temperatuur maakt het mogelijk om structuurverfijning uit te voeren tegen zowel röntgen- als neutronengegevens, waardoor mogelijke door de temperatuur geïnduceerde artefacten zoals veranderingen in de zichtbaarheid en positie van wateren of de bezetting van residuen met alternatieve conformaties worden voorkomen27. Gezamenlijke verfijning van röntgenneutronengegevens verhoogt de data-tot-parameterverhouding en biedt het voordeel dat de coördinaten van de eiwitruggegraat kunnen worden verfijnd ten opzichte van de röntgengegevens, terwijl de neutronendiffractiegegevens worden gebruikt om de positie van de H / D-atomen te verfijnen28. Dit is vooral handig bij het gebruik van gedeeltelijk gedeutereerde monsters, waarbij dichtheidssanering als gevolg van H-atomen op niet-uitwisselbare plaatsen op het eiwit aanwezig is. Hoewel het aantal röntgenstructuren veel groter is dan het aantal neutronenstructuren dat in de Protein Data Bank (PDB) is gedeponeerd, zijn softwarepakketten die oorspronkelijk waren ontworpen voor de verfijning van röntgengegevens uitgebreid met neutronengegevens3,29,30. Na gegevensverzameling kunnen modellen worden verfijnd met behulp van verfijningspakketten zoals phenix.refine, CNSsolve (nCNS) of SHELXL28,31,32,33. Tijdens het verfijningsproces kunnen neutronenverstrooiingsdichtheidskaarten worden gevisualiseerd voor handmatige aanpassing met behulp van COOT34. Na de structuuroplossing kunnen de coördinaten en de neutronen- en/of röntgendiffractiegegevensbestanden worden ingediend bij het VOB, dat het model zal valideren en deponeren, waardoor het beschikbaar wordt gesteld voor het publiek18,29,30.
Structurele analyse van eiwitten is een veelzijdige benadering waarbij tal van technieken worden gebruikt om hun functie en mechanisme te onderzoeken35. Neutroneneiwitkristallografie biedt waardevolle chemische inzichten om bevindingen uit aanvullende studies zoals röntgendiffractie, spectroscopie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) of microkristalelektronendiffractie (microED) uit te breiden en aan te vullen36. Neutroneneiwitdiffractie is uniek gepositioneerd om inzicht te geven in enzymatische mechanismen, omdat H-atomen centraal staan in hun chemie. De afwezigheid van stralingsschade veroorzaakt door neutronen maakt ze tot een sonde die uitzonderlijk geschikt is voor de studie van metalloproteïnen37. We presenteren hier een representatief voorbeeld van het proces van neutroneneiwitdiffractie van monstervoorbereiding tot gegevensverzameling, verfijning en analyse (figuur 1). Kristallen van voldoende grootte voor neutronendiffractie-experimenten zijn gekweekt van het metalloproteïne Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D is een koperhoudend metalloproteïne dat betrokken is bij de afbraak van recalcitrante cellulose door het inbrengen van zuurstofatomen in de glycosidische binding38,39. De ncLPMO9D actieve site bevat een mononucleair kopercentrum binnen een karakteristieke "histidine-brace" bestaande uit de N-terminale histidine en een tweede geconserveerde histidine (aanvullende figuur 3)40. De N-terminal van schimmel-LPMOs is gemethyleerd, maar de post-overgangsmodificatie treedt niet op tijdens recombinante expressie in gist. In de NcLPMO9D-rusttoestand is het kopercentrum aanwezig in een Cu2+ oxidatietoestand en wordt geactiveerd door enkele elektronenreductie tot Cu1+, waardoor moleculaire zuurstof kan binden en geactiveerd kan worden door snel te worden gereduceerd tot een superoxidesoort41,42. De totale NcLPMO9D-reactie vereist verdere toevoeging van één elektron en twee protonen om het gehydroxyleerde polysaccharideproduct te vormen43. De identiteit van de geactiveerde zuurstofsoorten die verantwoordelijk zijn voor waterstofatoomabsorptie (HAA) uit het polysaccharidesubstraat is niet geïdentificeerd en intensieve structurele en computationele studies zijn momenteel aan de gang44,45. Gezien de redoxchemie op de actieve locatie van NcLPMO9D is beperking van stralingsschade bijzonder relevant. We illustreren hier de verzameling van kamertemperatuur- en cryotemperatuurgegevens over NcLPMO9D-kristallen om de NcLPMO9D-structuur te bepalen in respectievelijk de rusttoestand en in de geactiveerde gereduceerde vorm46. De nadruk zal worden gelegd op het monteren van eiwitkristallen, het opzetten van beamline-instrumenten voor gegevensverzameling, de voorbereiding van de gegevens- en coördinatenbestanden en de verfijningsstappen die nodig zijn om een neutronenstructuur met alle atomen te modelleren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td>
			<td>DiaDent/DiaVet</td>
			<td>218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary wax</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.0.077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Version 0.8.9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalCap ALS</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-Tip Forceps</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>TW-CTF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &#181;m</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M5-L18SP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30266626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>M-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four Color Mounting Clay</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (T),</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td>
			<td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td>
			<td>XtaLAB Synergy-R</td>
			<td>Home source X-ray diffractometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Wand Straight</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &#8211; 20 &#181;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &#215; 96 pcs.)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.14-3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Tong 18 mm</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 0.1-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 10-100 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 20-200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR6-146</td>
			<td>Thin-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>GB-B3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>CV1012</td>
			<td>Thick-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich Box with cover</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax pen</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

Neutronenkristallografie is een structurele techniek die het mogelijk maakt om waterstofatoomposities in biologische macromoleculen te bepalen, wat mechanistisch belangrijke informatie oplevert over protonatie- en hydratatietoestanden zonder stralingsschade te veroorzaken. Röntgendiffractie daarentegen geeft slechts beperkte informatie over de positie van lichtatomen en de röntgenstraal induceert snel stralingsschade van lichtgevoelige cofactoren en metaalcentra. Hier wordt de workflow gepresenteerd die wordt gebruikt voor de IMAGINE- en MaNDi-bundellijnen in het Oak Ridge National Laboratory (ORNL) om een neutronendiffractiestructuur te verkrijgen zodra een eiwitkristal van geschikte grootte (> 0,1 mm3) is gekweekt. We demonstreren de montage van gehydrogeneerde eiwitkristallen in kwartscapillairen voor het verzamelen van neutronendiffractiegegevens. Ook wordt het dampuitwisselingsproces van de gemonteerde kristallen met D2O-bevattende buffer gepresenteerd om te zorgen voor vervanging van waterstofatomen op verwisselbare locaties door deuterium. De opname van deuterium vermindert de achtergrond die ontstaat door de onsamenhangende verstrooiing van waterstofatomen en voorkomt dichtheidsannulering veroorzaakt door hun negatieve coherente verstrooiingslengte. Strategieën voor het uitlijnen van monsters en het verzamelen van kamertemperatuurgegevens worden geïllustreerd met behulp van quasi-Laue-gegevensverzameling bij IMAGINE in de Hoge Flux Isotope Reactor (HFIR). Bovendien wordt kristalmontage en snelle bevriezing in vloeibare stikstof voor cryo-gegevensverzameling om labiele reactietussenproducten te vangen gedemonstreerd op het MaNDi time-of-flight-instrument bij de Spallation Neutron Source (SNS). De voorbereiding van de modelcoördinaat- en diffractiegegevensbestanden en visualisatie van de neutronenverstrooiingslengtedichtheidskaarten (SLD) zullen ook aan bod komen. Structuurverfijning tegen neutronengegevens-only of tegen gezamenlijke röntgen- / neutronengegevens om een volledig atomaire structuur van het betreffende eiwit te verkrijgen, zal uiteindelijk worden besproken. Het proces van het bepalen van een neutronenstructuur zal worden gedemonstreerd met behulp van kristallen van de lytische polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa LPMO9D, een koperhoudend metalloproteïne dat betrokken is bij de afbraak van recalcitrante polysacchariden via oxidatieve splitsing van de glycosidische binding.

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

Neutroneneiwitkristallografie is een structurele techniek die de lokalisatie van waterstofatomen mogelijk maakt, waardoor belangrijke mechanistische details van de eiwitfunctie worden verstrekt. We presenteren hier de workflow voor het monteren van een eiwitkristal, neutronendiffractiegegevensverzameling, structuurverfijning en analyse van de neutronenverstrooiingslengtedichtheidskaarten.

Neutronenkristallografie Gegevensverzameling en -verwerking voor het modelleren van waterstofatomen in eiwitstructuren

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Superkritische stikstof Verwerking voor de zuivering van reactieve poreuze materialen

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

Functionalisering van Enkelwandige koolstof nanobuisjes met Thermo-omkeerbare Block copolymeren en karakterisering door Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray poederdiffractie in Conservation Science: Towards Routine kristalstructuurbepaling van Corrosie Producten over Heritage Kunstobjecten

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Sterk Stabiel, Functioneel Hairy Nanodeeltjes en Biopolymeren uit houtvezels: Towards Sustainable Nanotechnologie

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

Experimentele methoden voor efficiënte productie van zonne-energie waterstof in de omgeving van microzwaartekracht

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...

Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

Synthese van metalen nanodeeltjes ondersteund op koolstofnanobuis met gedopeerde co- en N-atomen en de katalytische toepassingen ervan bij waterstofproductie

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...

Hydrogen Production and Utilization in a Membrane Reactor

Waterstofproductie en -gebruik in een membraanreactor

Industrial hydrogenation consumes ~11 Mt of fossil-derived H2 gas yearly. Our group invented a membrane reactor to bypass the need to use H2 gas for ...