Name: neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

ניסויי ביטוי, טיהור והתגבשות חלבונים נערכו במרכז לביולוגיה מולקולרית מבנית (CSMB), מתקן מחקר ביולוגי וסביבתי של משרד האנרגיה האמריקאי במעבדה הלאומית Oak Ridge. נתוני עקיפה של נויטרונים נאספו ב- BL-11B MaNDi במקור הנויטרונים של Spallation (SNS) ב- ORNL בחסות חטיבת מתקני המשתמש המדעי, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסית, משרד האנרגיה של ארה"ב. המחברים מודים לברנדן סאליבן על הסיוע בהפחתת נתונים. נתוני עקיפה של קרני רנטגן נאספו במתקני המרכז לחדשנות מולקולרית לחינוך, טכנולוגיה ומחקר (METRIC) באוניברסיטת צפון קרוליינה, הנתמכת על ידי מדינת צפון קרוליינה. GCS מכיר בתמיכה בין היתר מקרן המחקר הלאומית (NRF), דרום אפריקה ותוכנית הזדמנויות לתארים מתקדמים (GO!) ב- ORNL. FM מודה בתמיכת משרד החקלאות ניפ"א האץ' 211001.

למחברים אין מה לחשוף.

קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים היא טכניקה רגישה ביותר לבדיקת מצבי פרוטוניציה וכיוון מולקולות מים בחלבונים. מידע זה שופך אור על מנגנונים קטליטיים של חלבונים מכיוון ששינויים באינטראקציות פרוטוניציה ומימן הם לעתים קרובות מרכזיים בכימיה של אנזימים10. קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים, אם כי טכניקה אינפורמטיבית, יש מספר גורמים שיש לקחת בחשבון לפני תכנון לערוך ניסוי עקיפה נויטרונים, כלומר:
<ol><li>הדרישה לגבישי חלבון גדולים לאיסוף נתונים.</li>
	<li>תכונות הפיזור של מימן ואלמנטים אחרים, כגון יונים מתכת.</li>
	<li>התיישנות בתוכנה לעידון מבנה ובניית מודלים בעת עבודה עם דוגמאות מפורקות.</li>
</ol>קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים היא טכניקה מוגבלת בשטף. בניגוד ערכות נתונים עקיפה רנטגן, R-factors גבוה יותר ושלמות נמוכה יותר, יתירות ויחסי אות לרעש צפויים עבור ערכות נתונים נויטרונים בשל המגבלות הטבועות בטכניקה (שטף מוגבל, מעין לאואה, אורכי גל ארוכים יותר). איסוף נתונים של מסגרת אחת הוא בדרך כלל 12 - 18 שעות. הצלחה של ניסוי תלויה מאוד בגודל מדגם ואיכות עם גבישים של 0.1 mm3 לעתים קרובות להיות הדרישה המינימלית3. עקיפה של נויטרונים דורשת ייצור של כמויות גדולות של חלבון כדי להגדיר טיפות התגבשות הנעות בין 10 ל 800 μL. ניתן להעריך את הנפח המינימלי לגידול גבישים גדולים מספיק באמצעות מחשבון נפח בהתחשב בפרמטרים של הגביש והדגימה (https://neutrons.ornl.gov/imagine). צמיחה של גבישים גדולים הושגה באופן הנפוץ ביותר על ידי דיפוזיה אדים3. התגבשות טיפה תלויה מאפשרת צמיחה של גבישים בטיפות גדולות הנעות בין 10-25 μL, בעוד טיפות גדולות יותר הנעות עד ~ 50 μL ניתן להגדיר באמצעות ציוד טיפת ישיבה זמין מסחרית14,54. צלחות זכוכית סיליקון תשע היטב ניתן להשתמש כדי להגדיר טיפות גדולות מאוד, עם נפחים עד 800 μL. צלחות זכוכית אלה ממוקמות ב"קופסאות כריך "הזמינות מסחרית מ-Hampton Research. טכניקות התגבשות נוספות כוללות התגבשות אצווה, שבה הגבול של גודל טיפה מוכתב על ידי הכלי. ניסוי התגבשות אצווה שהוקם יכול לנוע בין מיקרוליטרים למיליליטרים55. התגבשות יכולה להתבצע גם באמצעות טכניקת הדיאליזה שבה החלבון משוויב עם המשקעים באמצעות קרום דיאליזה או על ידי דיפוזיה נגד לאורך שיפוע ריכוז משקעים או באמצעות תקע נקבובי כגון agarose56,57. זריעה מציעה חלופה נוספת להשגת גבישים של הנפח הרצוי. מיקרו ומקרו-שיתוף הועסקו בהצלחה לצמיחת גבישים גדולה, כולל גביש גדול של NcLPMO9D45. ידע מסוים בדיאגרמת שלב החלבון, כולל השפעת הטמפרטורה על המסיסות, מסייע בצמיחת גבישים גדולה.
בעת תכנון ניסוי עקיפה של נויטרונים, אופטימיזציה של הכנת החלבון כדי למקסם את יחס האות לרעש במהלך איסוף נתוני עקיפה היא חיונית7. כדי לעקוף את ביטול הצפיפות ופיזור לא ברור גבוה שנגרם על ידי אטומי H, ניתן לשפר את מפות ה- SLD של הנויטרונים על ידי החלפת אטומי H עבור האיזוטופ D שלה, בעל אורך פיזור קוהרנטי חיובי ואורך פיזור לא ברור נמוך. כדי להשיג זאת, מתבצע חילופי אדים של גביש חלבון מוקשה נגד חיץ התגבשות מפורק. זה מבטיח חילופי H/D של מולקולות ממס ואת מעבדה, חלבון ניתר H אטומים23. החלפת אדים מתבצעת על ידי הרכבת הגביש המימן נימי קוורץ עם חיץ התגבשות מבוסס D2O, deuteated "תקעים" והוא מייצג טכניקה יעילה ועדינה כי הוא מיושם לרוב14,23,35. ההחלפה יכולה להימשך מספר שבועות ועדיף לדרוש את המאגר deuterated להיות שונה לעתים קרובות כדי להבטיח חילופי H / D מרבי. החלפת H/D יכולה להתבצע גם על ידי השריה ישירה של הגביש במאגר טבול. כדי למנוע הצבת הגביש תחת לחץ עקב חשיפה D2O, תהליך השרייה צריך להתבצע בהדרגה על ידי הגדלת בהדרגה יחס D2O:H2O58. בנוסף לכך, התגבשות של חלבון מוקשה יכולה להתבצע גם במאגר deuteated עבור חילופי H /D באתרי H labile22,59. יש לציין, עם זאת, כי חוצץ מבוסס D2O יש השפעה על מסיסות חלבון הדורש התאמה נוספת של התנאים הידועים מבוססי H2O3,59. מאגרים מבוססי D2O נצפו גם להוביל גבישים קטנים יותר במקרים מסוימים59. החלפה מלאה של אטומי H חדירים ופחמן ל- D ניתן להשיג על ידי הבעת חלבונים במדיה deuterated כדי ליצור מדגם perdeuterated20. מפות הנויטרונים SLD המתקבלות של המדגם המתכלה ישתפרו באופן משמעותי, ולא יציגו עוד את ביטול הצפיפות של המקבילה המדגם מוקשה. זה מועיל בעת אפיון H/D מחויב באתרים שאינם ניתנים להחלפה בחלבון או קופקטור. עם זאת, ביטוי של חלבון perdeuterated הוא גם גבוה בעלות נמוך בתשואה60. המרכז הלאומי לביולוגיה מולקולרית מבנית (CSMB) מציע מתקן תיוג למשתמשים המבקשים ליצור דגימה מתכלית (https://www.ornl.gov/facility/csmb). ביטוי מתכלה מבוצע בדרך כלל ביו-ריאקטור בסולם של 1 ליטר המניב ~ 50 מ"ג של חלבון מטוהר61.
לאחר איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, שיפור ובניית מודל אינטראקטיבי מבוצע. עידון ניתן להפעיל באמצעות חבילות תוכנה מרובות כולל phenix.refine, nCNS או SHELXL28,31,32,33. חבילת פניקס היא התוכנה הנפוצה ביותר לחידוד נתוני עקיפה של נויטרונים בשילוב עם Coot אשר משמש לבנות באופן ידני את המודל מן מפות SLD נויטרונים34. למרות שני Phenix ו Coot לאפשר עיבוד של נתוני עקיפה נויטרונים, הם עשויים להיות חסרים תכונות מסוימות הדרושות כדי לעבד את idiosyncrasies הקשורים נתונים נויטרונים ודגימות deuterated. לדוגמה, קוט אינו מכיל אופטימיזציה גיאומטרית עבור שאריות deuterated, אשר יכול להוביל לסיבוכים במהלך בניית מודל מאז התכונה "נדל"ן שטח עידן" תוצאות "מתפוצץ" שאריות (איור משלים 26)62. ניתן לפתור זאת על-ידי יצירת קבצי ריסון עבור כל השאריות המנוטרלים. עם זאת, זהו תהליך אינטנסיבי וספריות כאלה אינן זמינות כעת לציבור. בעת ביצוע עידונים ב פניקס, אתרי H/D הניתנים להחלפה ייקבעו בתחילה כתפוסה של 0.50 עבור H ו- D. כאשר מתבצעים שיפורים, התפוסה של H ו- D תשוכלל על פי מפות הנייטרונים SLD. במהלך בניית מודל אינטראקטיבי, מפות Fo- Fc צפיפות הפרשים מאוד אינפורמטיביות בהערכת תפוסות H / D. ניתן להשתמש במפות כדי לקבוע אילו אתרים הם בעלי תפוסת D גבוהה, שהיא אינפורמטיבית במיוחד באתר הפעיל שבו מצבי פרוטוניציה רלוונטיים מבחינה קטליטית63. מצבים מעורפלים אכן מתעוררים, כאשר H:D התפוסה קרובה ל-0.70:0.30, מה שגורם לביטול אותות מוחלט במפות נויטרונים SLD64. כמו כן, יש לקחת בחשבון כי ערכות נתונים נויטרונים מעין לאואה לעתים קרובות יש שלמות סביב 80%, וזה נמוך יותר מאשר ≥ 98% עבור נתוני עקיפה קרני רנטגן. בעת זיקוק נתוני עקיפה של נויטרונים בפניקס, המשרעת הנצפת החסרה (Fo) מחושבת לפיכך מהמודל כדי להשלים את רשימת ההשתקפות, ובכך מציגה הטיית מודל. כדי להסביר את ההטיה הפוטנציאלית הזו יש לבחון מפות "no_fill" במהלך בניית מודל אינטראקטיבי בניגוד למפות "מלאות".
משתמשים יכולים לבחור לבצע רנטגן משותף / נויטרונים עידון נתונים של המבנה שלהם, או עידון נתוני נויטרונים בלבד. הדמיית מפות SLD של נויטרונים, במיוחד ברזולוציה נמוכה יותר, עשויה להיות בתחילה מדאיגה במיוחד עבור חלבון מוקשה שבו H עדיין קיים באתרים שאינם ניתנים להחלפה למרות חילופי אדי H/ D. התוצאה היא ביטולי מפת צפיפות נויטרונים, מה שנותן רושם של מפות לא רציפות65,66. איסוף ערכת נתונים תואמת של קרני רנטגן משלים את הביטולים הללו בעידון משותף (איור 13A ואיור 13B). אסטרטגיית עידון משותף כוללת בדרך כלל עידון קואורדינטות עמוד השדרה של החלבון מול נתוני הרנטגן, בעוד נתוני עקיפה של הנויטרונים משמשים כדי לחדד את המיקום והתפוסה של אטומי H/D באתרים הניתנים להחלפה28. מאז כניסתו של תפוסת H /D משותף באתרים הניתנים להחלפה מגדיל את מספר הפרמטרים להיות מעודן, עידון משותף עם נתוני רנטגן גם מגדיל את יחס נתונים לפרמטר. עידון משותף דורש שסט נתונים רנטגן מתאים ייאסף באותה טמפרטורה על אותו גביש או גביש שגדל באותם תנאים. עבור נתוני עקיפה של נויטרונים שנאספו בטמפרטורת החדר (300K), יש לאסוף את ערכת הנתונים המתאימה של קרני הרנטגן בטמפרטורת החדר באמצעות אסטרטגיית איסוף נתונים במינון נמוך כדי להגביל את נזקי הקרינה. דגימות Perdeuteed, לעומת זאת, לספק מפות SLD נויטרונים משופרים ורציפים שכן אין להם את אותו סדר גודל של ביטול אותות H / D. עם זאת, אורך פיזור הנויטרונים של אלמנטים מסוימים, כולל מתכות וגופרית, הופך אותם לגלויים בצורה גרועה במפות נויטרונים SLD, גם אם החלבון נעשה ללא וודאות (איור 13C-F)18. אם מתכת צריכה להיות מאופיינת, עדיף להשתמש עקיפה רנטגן עידון משותף או ליישם טכניקות ספקטרוסקופיות כדי להשלים ניסויי עקיפה. שיפורי נתונים של נויטרונים בלבד מבוצעים לעתים קרובות כאשר ערכת הנתונים של הנויטרונים יש ברזולוציה גבוהה או אם נעשה שימוש בחלבון מת.... בנוסף, עידון נתונים נויטרונים בלבד שימושי במיוחד אם חלבון רגיש מאוד לנזק קרינה נחקר, שכן מבנה נגזר רנטגן עשוי להיות בעל חפצים הנגרמים על ידי קרינה. אם יש לבצע עידון של נתוני נויטרונים בלבד, יש לברר אם ערכת הנתונים של הנויטרונים המתאימה כוללת שלמות ורזולוציה מספקת.
ORNL מציעה שני מתקנים לאיסוף נתוני עקיפה של נויטרונים: קו הקרן IMAGINE ב- HFIR, כמו גם קו הקרן של MaNDi ב- SNS36,67. בעוד ששני המכשירים מספקים אמצעים יעילים לאיסוף ערכת נתונים של עקיפה של נויטרונים תוך שימוש בעקרונות דומים, לכל מכשיר יש מפרטים ייחודיים שיש לקחת בחשבון בעת הגשת בקשה לזמן קרן. IMAGINE אוספת נתוני מעין-לאואה ומותטבת לאיסוף נתוני טמפרטורת החדר בגבישים עם תאי יחידה עד כ- 100 Å. MaNDi יכול לשמש לאיסוף טמפרטורת החדר ונתונים בטמפרטורת הקפאה המעסיקים אוסף TOF-Laue על גבישים עם תאי יחידה עד ~ 300 Å. לפני איסוף ערכת נתונים מלאה, מתבצעת בדיקה על הגביש כדי להעריך את איכות תבנית ההשתרעות שבה הקריסטל חשוף לקרן הנויטרונים למסגרת אחת. אם הגביש באיכות מספקת, תיאסף ערכת נתונים מלאה של עקיפה של נויטרונים, תבוצע באינדקס, תשולב, תגדל ותמוזג בתהליך מקביל לעיבוד נתוני רנטגן. IMAGINE עושה שימוש בלאוג'ן וב-Lscale ו-MaNDi מנצלת את חבילת Mantid ומפעילה פרופיל תלת מימדי המתאים ל-48,50,51,68,69,70. מדענים שיהפכו למשתמשים באחד ממתקנים אלה יקבלו ערכת נתונים בפורמט MTZ או HKL לניתוח נוסף.
עקיפה של נויטרונים היא טכניקה לא הרסנית ורגישה מאוד לבדיקת מצב הפרוטוניציה ואינטראקציות קשר מימן של מקרומולקולות ביולוגיות. זה שימושי במיוחד עבור חלבונים רגישים לצילום ומטלופרוטאין. יש לקחת בחשבון מספר שיקולים לגבי הטכניקה כמו גם עיבוד הנתונים לפני ביצוע ניסוי, אולם התוצאה מניבה תוצאות שעשויות לתת תובנה חשובה על המנגנון הקטליטי של חלבון העניין. קריסטלוגרפיה של חלבון ניוטרון משלימה מחקרים חישוביים, מבניים, ביוכימיים וספקטרוסקופיים, מה שהופך אותו לכלי בעל ערך בארגז הכלים של הביולוגים של טכניקות המשמשות לאפיון מקרומולקולים ביולוגיים.

קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית של נויטרונים היא טכניקה המספקת חלון ייחודי למבנה ולכימיה הבסיסית של חלבונים. בדומה מבחינה רעיונית עקיפה של קרני רנטגן, עקיפה נויטרונית מספקת פרטים אטומיים של מבנה מקרומולקולרי, עם זאת, האינטראקציה של נייטרונים עם גרעינים מאפשרת לוקליזציה של אטומי אור, לעתים קרובות קשה לזהות עם עקיפה קרני רנטגן1. במהלך עקיפה של קרני רנטגן, קרני רנטגן מתפזרות מענן האלקטרונים, מה שהופך אטומי אור כגון מימן (H) לעין בצורה גרועה במפות צפיפות אלקטרונים שאין להן רזולוציה של תת-אנגסטרום2. לעומת זאת, עוצמת הפיזור של נייטרונים תלויה באינטראקציות מורכבות עם הגרעין, כאשר איזוטופים של אותו אלמנט מציגים אורכי פיזור שונים. לכן, אטומי אור ואיזוטופים שלהם, כגון מימן (1H) ודיוטריום (2H או D), יש ראות דומה פחמן עמוד השדרה, חנקן ואטומי חמצן במפות צפיפות אורך פיזור נויטרונים (SLD). יתר על כן, מאז סדר הגודל של פיזור נויטרונים אינו תלוי במספר האלקטרונים, פיזור מיסודות אור אינו מוסתר על ידי אלמנטים כבדים כאשר הם נמצאים קרוב זה לזה, כפי שנצפו בפיזור קרני רנטגן. הנראות המשופרת של H והאיזוטופ D שלה בעת שימוש עקיפה נויטרונית מספקת מידע רב ערך על מצב הפרוטוניציה של שאריות, קופקטורים וליגנדים חשובים מבחינה קטליטית ומסייעת לכיוון של מולקולות מים, וחושף מידע חשוב על מנגנונים קטליטיים וכימיה של חלבונים3. עקיפה של נויטרונים מציעה גם את היתרון בלהיות טכניקה לא הרסנית, המתאימה במיוחד לדגימות ביולוגיות רגישות ליינון כגון חלבונים עם מרכזי מתכת או קופקטורים אדומים רגישים לאור2. המוקד העיקרי של מאמר זה הוא לספק סקירה כללית של זרימת העבודה כדי להשיג מבנה גביש חלבון נויטרונים באיכות גבוהה. אנו מפנים את הקורא המעוניין לפודג'ארני ואח '4, בלייקלי5, בלייקלי ואח ' 6 ו- O'Dell et al.3 לקבלת סקירה מצוינת של עקיפה של חלבון נויטרונים ואשקר ואח '7 ליישומים נוספים של פיזור נויטרונים.
נייטרונים נוצרים בעיקר במהלך תגובות גרעיניות תוך שימוש באחד משני תהליכים: ביקוע גרעיני במקורות הכור או התכתשות במקורות מבוססי מאיץ8. מקורות הכור מספקים קרן נויטרונים רציפה על ידי שימוש ביקוע גרעיני של איזוטופ 235U בעוד מקורות נויטרונים spallation לייצר קרן נויטרונים פעמו על ידי הפצצת מטרה, למשל מתכת נוזלית כגון כספית, עם פרוטונים9. המעבדה הלאומית אוק רידג' (ORNL) באוק רידג', טנסי, מארחת הן מקור נויטרונים במצב יציב בכור האיזוטופ בשטף הגבוה (HFIR) והן מקור פעמו של 60 הרץ במקור הנויטרונים של ספאליציה (SNS). קו הקרן IMAGINE, הממוקם ב- HFIR, הוא דיפרקטומטר נויטרונים המותאם למקרומולקולים ביולוגיים (איור 1)10. IMAGINE משתמשת בגלאי לוחיות תמונה נויטרונים כדי למדוד נתוני מעין-לאואה באמצעות פס צר בטווח של 2.8 – 4.5 Å מגבישים בודדים עם קצוות תא יחידה <150 Å. דיפרקטומטר נויטרונים (MaNDi) הוא דיפרקטומטר נויטרונים (באנגלית: Macromolecular) הוא דיפרקטומטר נויטרונים של לאואה (TOF) המצויד במסגרת מערך גלאי כדורי (DAF) (איור 2)11. MaNDi מודד נתונים מגבישים בודדים עם קצוות תא יחידה בטווח של 10 - 300 Å על ידי שימוש 2 Å-אורך גל רוחב פס בין 2.0 - 6.0 Å12.
תהליך יצירת הנויטרונים הוא עתיר אנרגיה, וכתוצאה מכך שטפי קרן נויטרונים חלשים יחסית כאשר הם מנוגדים לשטף קרן הרנטגן במקורות סינכרוטרון13. כדי להבטיח יחסי אות לרעש מספיקים במהלך איסוף נתונים, יש צורך לגדל גבישים בגודל ובאיכות מתאימים14. בדרך כלל, גבישים עם נפחים > 0.1 mm3 נדרשים כדי לאסוף נתונים עם סטטיסטיקה נאותה15. בנוסף לשטף נמוך יותר, יש לקחת בחשבון תכונות אינהרנטיות של האינטראקציה בין נייטרונים לבין גרעיני המדגם16. אורך הפיזור של נייטרונים שונה עבור איזוטופים של אותו אלמנט, מאפיין אשר ניתן לנצל ביתרון בפיזור נייטרונים בזווית קטנה (SANS) כדי להסוות או להדגיש אזורים של מדגם - תהליך המכונה התאמת ניגודיות17. בניסויי עקיפה, אורך פיזור הנויטרונים השלילי קוהרנטי של H (-3.741 fm עבור 1H) יכול להוביל לביטול תכונות מפת פיזור הנויטרונים מאז אורך פיזור הנויטרונים קוהרנטי של אטומים רלוונטיים ביולוגית אחרים, כולל פחמן (6.6511 fm עבור 12C), חנקן (9.37 fm עבור 14N), חמצן (5.803 fm עבור 16O), זרחן (5.13 fm עבור 31P) וגופרית (2.804 fm עבור 32S), הם חיוביים (טבלה 1)12,14. יתר על כן, אורך הפיזור הגדול והמבולבל של H (25.274 fm), מגביר את הרקע במהלך איסוף הנתונים, פוגע באיכות ערכת הנתונים ומפגע ברזולוציית הנתונים7. כדי לעקוף את המגבלות הללו שהוכנסו על ידי H יש צורך, עבור עקיפה נייטרונית, להחליף H עבור דיוטריום איזוטופ שלה, 2H(D), אשר יש אורך פיזור נויטרונים קוהרנטי חיובי (6.671 fm) ואורך פיזור מבולבל נמוך משמעותית (4.04 fm)19. זה יכול להיות מושגת על ידי perdeuteration, תהליך שבו החלבון בא לידי ביטוי על ידי אורגניזמים גדלים במדיה deuterated לחלוטין להבטיח שילוב מלא של D באתרי H20. ניתן גם תיופח חלקית חלבון על ידי החלפת H עם D אך ורק באתרים הניתנים להחלפה (קבוצות titratable) בעוד האתרים שאינם ניתנים להחלפה פחמן מחויבים להישאר מוקשה21. זה יכול להיות מושגת על ידי צמיחה של גבישי חלבון מוקשה ליקר אמא deuterated22. עם זאת, בדרך כלל, חילופי H/D של חלבונים מוקשים מבוצעים על ידי חילופי אדים בעקבות צמיחה של גבישים גדולים כראוי ב- buffer23 מבוסס H2O. במקרים כאלה, גבישים מותקנים נימי קוורץ אדים-equilibed עם ליקר אם מבוסס D20.
שטפי הנויטרונים המוגבלים במקורות נויטרונים גורמים לזמנים ארוכים יותר של איסוף נתונים, החל מימים ועד מספר שבועות24. ב- ORNL, IMAGINE ו- MaNDi משתמשים במעבר פסים צר אורך גל בטווח 2-6 Å כדי לייעל את איסוף הנתונים25. ניתן לאסוף נתונים בטמפרטורת החדר או בטמפרטורת ההקפאה. איסוף נתוני Cryo יכול לשפר את איכות הנתונים ולפתוח את האפשרות ללכידת זרזים להקפאה. לאחר איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, ערכת נתונים של קרני רנטגן נאספה בדרך כלל על אותה גביש באותה טמפרטורה או על גבישי שגדל בתנאים זהים26. איסוף נתונים באותה טמפרטורה מאפשר לבצע עידון מבנה הן מול נתוני רנטגן והן מול נתוני נויטרונים, ומונע חפצים פוטנציאליים הנגרמים על ידי טמפרטורה כגון שינויים בנראות ובמיקום המים או תפוסת שאריות עם קונפורמציות חלופיות27. עידון נתוני נויטרונים של קרני רנטגן משותפות מגדיל את יחס הנתונים לפרמטר ומספק את היתרון של מתן אפשרות לעידון קואורדינטות עמוד השדרה של החלבון מול נתוני הרנטגן, בעוד נתוני עקיפה של הנויטרונים משמשים כדי לחדד את המיקום של אטומי H/D28. זה שימושי במיוחד בעת שימוש בדגימות מפורקות חלקית, שבו ביטול צפיפות עקב אטומי H באתרים שאינם ניתנים להחלפה על החלבון קיים. למרות שמספר מבני הרנטגן עולה בהרבה על מספר מבני הנויטרונים שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), חבילות תוכנה שתוכננו בתחילה לעידון נתוני רנטגן הורחבו כך שיכלול נתוני נויטרונים וכן 3,29,30. לאחר איסוף נתונים, ניתן למקד דגמים באמצעות חבילות עידון כגון phenix.refine, CNSsolve (nCNS) או SHELXL28,31,32,33. במהלך תהליך הזיכוך, ניתן לדמיין מפות צפיפות פיזור נויטרונים להתאמה ידנית באמצעות COOT34. פתרון המבנה הבא, ניתן להגיש ל- PDB את הקואורדינטות ואת קבצי נתוני עקיפה של נויטרונים ו/או רנטגן, אשר יאמת ויפקיד את הדגם, מה שהופך אותו לזמין לגישה ציבורית18,29,30.
ניתוח מבני של חלבונים הוא גישה רבת פנים שבה טכניקות רבות משמשות לבדיקת תפקודם ומנגנון 35. קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים מספקת תובנות כימיות חשובות כדי להרחיב ולהשלים ממצאים ממחקרים נוספים כגון עקיפה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או עקיפה של אלקטרונים מיקרו קריסטליים (microED)36. עקיפה של חלבון נויטרונים ממוקמת באופן ייחודי כדי לספק תובנות על מנגנונים אנזימטיים, שכן אטומי H הם מרכזיים בכימיה שלהם. היעדר נזקי קרינה הנגרמים על ידי נייטרונים להפוך אותם בדיקה מתאימה במיוחד לחקר metalloproteins37. אנו מציגים כאן דוגמה מייצגת לתהליך עקיפה של חלבון נויטרונים מהכנת מדגם ועד איסוף נתונים, עידון וניתוח נתונים (איור 1). גבישים בגודל מספיק לניסויי עקיפה של נויטרונים גדלו של מטאלופרוטאין נוירוספורה גסה LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D הוא מטאלופרוטאין המכיל נחושת המעורב בהשפלת תאית סרבן על ידי החדרת אטום חמצן בקשר הגליקוזידי38,39. האתר הפעיל NcLPMO9D מכיל מרכז נחושת מונונוקלארי בתוך "סד היסטידין" אופייני המורכב מהיסטידין N-terminal והיסטידין שמור שני (איור משלים 3)40. N-מסוף של LPMOs פטרייתי הוא מתיל אבל השינוי שלאחר המעבר אינו מתרחש במהלך ביטוי רקומביננטי בשמרים. במצב המנוחה NcLPMO9D, מרכז הנחושת נמצא במצב חמצון Cu2+ ומופעל על ידי הפחתת אלקטרון יחיד ל- Cu1+, ומאפשר לחמצן מולקולרי להיקשר ולהיות מופעל על ידי הפחתתו במהירות למין סופראוקסיד41,42. התגובה הכוללת NcLPMO9D דורש תוספת נוספת של אלקטרון אחד ושני פרוטונים כדי ליצור את המוצר פוליסכריד הידרוקסילאט43. זהותם של מיני החמצן הפעיל האחראים להפשטת אטום המימן (HAA) ממצע הפוליסכריד לא זוהתה ומחקרים מבניים וחישוביים אינטנסיביים נמשכים כיום 44,45. בהתחשב בכימיה redox באתר הפעיל NcLPMO9D, הקלה של נזק קרינה היא רלוונטית במיוחד. אנו ממחישים כאן טמפרטורת החדר ואיסוף נתונים בטמפרטורת הקפאה על גבישי NcLPMO9D כדי לקבוע את מבנה NcLPMO9D במצב המנוחה ובצורה המופחתת המופעלת, בהתאמה 46. יינתן דגש על הרכבה על גבישי חלבון, התקנת מכשיר קו קרן לאיסוף נתונים, הכנת הנתונים ותיאורת קבצים ושלבי העידון הדרושים למידול מבנה נויטרונים אטום.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td>
			<td>DiaDent/DiaVet</td>
			<td>218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary wax</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.0.077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Version 0.8.9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalCap ALS</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-Tip Forceps</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>TW-CTF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &#181;m</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M5-L18SP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30266626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>M-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four Color Mounting Clay</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (T),</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td>
			<td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td>
			<td>XtaLAB Synergy-R</td>
			<td>Home source X-ray diffractometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Wand Straight</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &#8211; 20 &#181;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &#215; 96 pcs.)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.14-3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Tong 18 mm</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 0.1-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 10-100 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 20-200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR6-146</td>
			<td>Thin-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>GB-B3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>CV1012</td>
			<td>Thick-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich Box with cover</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax pen</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

קריסטלוגרפיה של נויטרונים היא טכניקה מבנית המאפשרת קביעת עמדות אטום מימן בתוך מקרומולקולות ביולוגיות, מניבה מידע חשוב מבחינה מכנית על מצבי פרוטוניציה והידרציה מבלי לגרום לנזק לקרינה. עקיפה של קרני רנטגן, לעומת זאת, מספקת מידע מוגבל בלבד על מיקום אטומי האור וקרן הרנטגן גורמת במהירות לנזקי קרינה של קופקטורים רגישים לאור ומרכזי מתכת. מוצג כאן הוא זרימת העבודה המועסקת עבור קורות IMAGINE ו MaNDi במעבדה הלאומית Oak Ridge (ORNL) כדי לקבל מבנה עקיפה נויטרונים לאחר גבישי חלבון בגודל מתאים (> 0.1 מ"מ3) גדל. אנו מדגימים הרכבה של גבישי חלבון מוקשים בני נימי קוורץ לאיסוף נתוני עקיפה של נויטרונים. כמו כן מוצג תהליך החלפת האדים של גבישים רכובים עם חיץ המכיל D2O כדי להבטיח החלפה של אטומי מימן באתרים הניתנים להחלפה עם דיטריום. שילוב של דיטריום מפחית את הרקע הנובע מפיזור לא ברור של אטומי מימן ומונע ביטול צפיפות שנגרם על ידי אורך הפיזור השלילי שלהם קוהרנטי. יישור מדגם ואסטרטגיות איסוף נתוני טמפרטורת החדר מודגמים באמצעות איסוף נתונים מעין-לאואה ב- IMAGINE בכור האיזוטופים בשטף הגבוה (HFIR). יתר על כן, הרכבה גבישית ומקפיא מהיר בחנקן נוזלי לאיסוף נתוני קריו כדי ללכוד מתווכים תגובת מעבדה מודגמת במכשיר זמן הטיסה של MaNDi במקור הנויטרונים של Spallation (SNS). הכנת קבצי נתוני קואורדינטות עקיפה ודיקור המודל והדמיה של מפות צפיפות אורך פיזור הנויטרונים (SLD) יטופלו גם הם. עידון מבנה נגד נתוני נויטרונים בלבד או נגד נתוני רנטגן/נויטרונים משותפים כדי להשיג מבנה אטום של חלבון העניין יידונו סוף סוף. תהליך קביעת מבנה נויטרונים יודגם באמצעות גבישים של lytic פוליסכריד monooxygenase Neurospora crassa LPMO9D, מטאלופרוטאין המכיל נחושת המעורב בהשפלה של פוליסכרידים סרבנים באמצעות מחשוף חמצוני של הקשר הגליקוזידי.

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים היא טכניקה מבנית המאפשרת לוקליזציה של אטומי מימן, ובכך מספקת פרטים מכניים חשובים של תפקוד החלבון. אנו מציגים כאן את זרימת העבודה להרכבה של גבישי חלבון, איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, עידון מבנה וניתוח של מפות צפיפות אורך הפיזור של הנויטרונים.

נויטרונים קריסטלוגרפיה איסוף ועיבוד נתונים למידול אטומי מימן במבני חלבון

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

עיבוד חנקן סופר קריטי עבור הטיהור של חומרים נקבוביים ריאקטיבי

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

Functionalization של ננו-צינורות פחמן חד-דופנות עם קופולימרים לחסום Thermo-הפיך אפיון על ידי פיזור קטן זווית ניוטרון

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

השתברות אבקת רנטגן שימור מדע: לקראת קביעת מבנה שיגרתית קריסטל של מוצרי קורוזיה על יצירות אמנות מורשה

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

מאוד יציבים, חלקיקים שעירים פונקציונליים Biopolymers סיבי עץ: לקראת ננוטכנולוגיה קיימא

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

ניסיוני שיטות ייצור יעיל מימן סולארית בסביבה מיקרוגרביטציה

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...

Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

סינתזה של ננו-חלקיקי מתכת הנתמכים על ננו-צינוריות פחמן עם אטומי Co ו-N מסוממים ויישומיה הקטליטיים בייצור מימן

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...

Hydrogen Production and Utilization in a Membrane Reactor

ייצור וניצול מימן בכור ממברנות

Industrial hydrogenation consumes ~11 Mt of fossil-derived H2 gas yearly. Our group invented a membrane reactor to bypass the need to use H2 gas for ...