Name: neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Proteinuttrykk, rensing og krystalliseringseksperimenter ble utført ved Center for Structural Molecular Biology (CSMB), et amerikansk institutt for energibiologisk og miljømessig forskningsbrukeranlegg ved Oak Ridge National Laboratory. Nøytrondiffraksjonsdata ble samlet inn ved BL-11B MaNDi ved Spallation Neutron Source (SNS) ved ORNL som er sponset av Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Forfatterne takker Brendan Sullivan for hjelp med datareduksjon. Røntgendiffraksjonsdata ble samlet inn ved METRIC-anleggene (Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center) ved North Carolina State University, som støttes av delstaten North Carolina. GCS anerkjenner delvis støtte fra National Research Foundation (NRF), Sør-Afrika og Graduate Opportunities (GO!)-programmet ved ORNL. FM erkjenner støtte fra USDA NIFA Hatch 211001.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Nøytronproteinkrystallografi er en svært følsom teknikk for å sondere protonasjonstilstander og vannmolekylorientering i proteiner. Denne informasjonen kaster lys over proteinkatalytiske mekanismer siden endringer i protonering og hydrogenbindingsinteraksjoner ofte er sentrale for enzymkjemi10. Nøytronproteinkrystallografi, om enn en informativ teknikk, har en rekke faktorer som bør tas i betraktning før du planlegger å gjennomføre et nøytrondiffraksjonseksperiment, nemlig:
<ol><li>Kravet til store proteinkrystaller for datainnsamling.</li>
	<li>Spredningsegenskapene til hydrogen og andre elementer, for eksempel metallioner.</li>
	<li>Begrensninger i strukturforbedrings- og modellbyggingsprogramvaren når du arbeider med deutererte prøver.</li>
</ol>Nøytronproteinkrystallografi er en fluksbegrenset teknikk. I motsetning til røntgendiffraksjonsdatasett forventes høyere R-faktorer og lavere fullstendighet, redundans- og signal-til-støy-forhold for nøytrondatasett på grunn av teknikkens iboende begrensninger (flux begrenset, kvasi-Laue, lengre bølgelengder). Datainnsamling av en enkelt ramme er vanligvis 12 - 18 timer. Suksessen til et eksperiment er svært avhengig av prøvestørrelse og kvalitet med krystaller på 0,1 mm3 som ofte er minimumskravet3. Nøytrondiffraksjon krever produksjon av store mengder protein for å sette opp krystalliseringsdråper fra 10 til 800 μL. Minimumsvolumet for dyrking av tilstrekkelig store krystaller kan estimeres ved hjelp av en volumkalkulator gitt krystall- og prøveparametrene (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Vekst av store krystaller har mest utbredt blitt oppnådd ved dampdiffusjon3. Hengende dråpekrystallisering tillater vekst av krystaller i store dråper fra 10-25 μL, mens større dråper som spenner opp til ~ 50 μL kan settes opp ved hjelp av kommersielt tilgjengelig sittedråpeutstyr14,54. Silikoniserte nibrønns glassplater kan brukes til å sette opp svært store dråper, med volumer opp til 800 μL. Disse glassplatene er plassert i "sandwichbokser" kommersielt tilgjengelig fra Hampton Research. Ytterligere krystalliseringsteknikker inkluderer batchkrystallisering, der grensen for dråpestørrelsen dikterer av fartøyet. Batch krystallisering eksperiment satt opp kan variere fra mikroliter til milliliter55. Krystallisering kan også utføres ved hjelp av dialyseteknikken der proteinet likevektes med utfellingsmiddelet via en dialysemembran eller ved motspredning langs en utfellende konsentrasjonsgradient eller gjennom en porøs plugg som agarose56,57. Såing tilbyr et annet alternativ for å oppnå krystaller av ønsket volum. Mikro- og makroseeding har blitt brukt for stor krystallvekst, inkludert stor krystall av NcLPMO9D45. Noe kunnskap om proteinfasediagrammet, inkludert påvirkning av temperatur på løselighet, bidrar til stor krystallvekst.
Når du planlegger et nøytrondiffraksjonseksperiment, er optimalisering av proteinpreparatet for å maksimere signal-til-støy-forholdet under diffraksjonsdatainnsamling viktig7. For å omgå tetthetsreduksjon og høy usammenhengende spredning forårsaket av H-atomer, kan nøytron SLD-kart forbedres ved å bytte H-atomer for isotop D, som har en positiv sammenhengende spredningslengde og lav usammenhengende spredningslengde. For å oppnå dette utføres damputveksling av hydrogenert proteinkrystall mot deutert krystalliseringsbuffer. Dette sikrer H/D utveksling av løsningsmiddelmolekyler og det labile, titratable proteinet H atomer23. Damputveksling utføres ved å montere den hydrogenerte krystallen i en kvarts kapillær med D2O-basert, deuterert krystalliseringsbuffer "plugger", og den representerer en effektiv, skånsom teknikk som oftest brukes14,23,35. Utvekslingen kan ta flere uker, og krever helst at den deutererte bufferen endres ofte for å sikre maksimal H/D-utveksling. H/D-utveksling kan også utføres ved å suge krystallen direkte i deutert buffer. For å unngå å plassere krystallen under stress på grunn av D2O-eksponering, bør bløtleggingsprosessen utføres gradvis ved å øke D2O: H2O-forholdet gradvis58. I tillegg til dette kan krystallisering av hydrogenert protein også utføres i deutert buffer for H / D-utveksling på labile H-steder22,59. Det skal imidlertid bemerkes at D2O-basert buffer har en effekt på proteinløselighet som krever ytterligere justering av de kjente H2O-baserte forholdene3,59. D2O-baserte buffere er også observert for å føre til mindre krystaller i noen tilfeller59. Full utveksling av titratable og karbonbundne H-atomer til D kan oppnås ved å uttrykke proteiner i deutererte medier for å generere en perdeutert prøve20. De resulterende nøytron SLD-kartene til den perdeutererte prøven vil bli betydelig forbedret, og viser ikke lenger tetthetsreduksjonen til den hydrogenerte prøvemotparten. Dette er gunstig når du karakteriserer H / D bundet på ikke-utskiftbare steder i et protein eller kofaktor. Uttrykk for perdeutert protein er imidlertid både høyt i pris og lavt utbytte60. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) tilbyr et deuteringsanlegg for brukere som ønsker å generere en perdeutert prøve (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Perdeutert uttrykk utføres vanligvis i en bioreaktor på 1 L-skalaen som gir ~ 50 mg renset protein61.
Etter innsamling av nøytrondiffraksjonsdata utføres raffinement og interaktiv modellbygging. Raffinement kan kjøres ved hjelp av flere programvarepakker, inkludert phenix.refine, nCNS eller SHELXL28,31,32,33. Phenix-pakken er den mest brukte programvaren for raffinering av nøytrondiffraksjonsdata i forbindelse med Coot som brukes til å bygge modellen manuelt fra nøytron SLD-kartene34. Selv om både Phenix og Coot tillater behandling av nøytrondiffraksjonsdata, kan de mangle visse funksjoner som er nødvendige for å behandle idiosynkrasi forbundet med nøytrondata og deuterte prøver. Coot inneholder for eksempel ikke geometrioptimalisering for deutererte rester, noe som kan føre til komplikasjoner under modellbygging siden funksjonen "Real Space Refine" resulterer i "eksploderende" rester (tilleggs figur 26)62. Dette kan løses ved å generere selvbeherskelsesfiler for alle de deutererte rester. Dette er imidlertid en intensiv prosess, og slike biblioteker er for tiden ikke offentlig tilgjengelige. Ved forbedringer i Phenix vil utskiftbare H/D-lokaliteter i utgangspunktet bli satt til 0,50 belegg for H og D. Etter hvert som forbedringer utføres, vil belegget til H og D bli raffinert i henhold til nøytron SLD-kartene. Under interaktiv modellbygging er forskjellstetthet Fo-Fc-kart svært informative når det gjelder å vurdere H / D-belegg. Kart kan brukes til å bestemme hvilke steder som har høyt D-belegg, noe som er spesielt informativt på det aktive stedet der protonasjonstilstander er katalytisk relevante63. Tvetydige situasjoner oppstår imidlertid når H:D belegget er nær 0.70:0.30, noe som resulterer i fullstendig signalavbestilling i nøytron SLD-kart64. Det bør også tas i betraktning at kvasi-Laue nøytrondatasett ofte har fullstendighet rundt 80%, noe som er lavere enn de rutinemessig observerte ≥ 98% for røntgendiffraksjonsdata. Ved raffinering av nøytrondiffraksjonsdata i Phenix beregnes derfor de manglende observerte amplitudene (Fo) fra modellen for å fullføre refleksjonslisten, og introduserer dermed modellbias. For å ta høyde for denne potensielle skjevheten bør "no_fill" kart undersøkes under interaktiv modellbygging i motsetning til "fylte" kart.
Brukere kan velge å utføre en felles røntgen/nøytrondataforedling av strukturen, eller en nøytrondata bare raffinement. Visualisering av nøytron SLD-kart, spesielt ved lavere oppløsning, kan i utgangspunktet være urovekkende, spesielt for et hydrogenert protein der H fortsatt er til stede på ikke-utskiftbare steder til tross for H / D damputveksling. Dette resulterer i kastrontetthet kart kanselleringer, noe som gir inntrykk av diskontinuerlige kart65,66. Innsamling av et tilsvarende røntgendatasett kompletterer med fordel disse kanselleringene i en felles raffinement (figur 13A og figur 13B). En leddraffineringsstrategi innebærer vanligvis å raffinere protein-ryggraden koordinater mot røntgendataene, mens nøytrondiffraksjonsdataene brukes til å avgrense posisjonen og belegget til H / D-atomene på utskiftbare steder28. Siden innføring av felles H/D-belegg på utskiftbare steder øker antall parametere som raffineres, øker en felles forbedring med røntgendata også data-til-parameter-forholdet. En felles raffinement krever at et tilsvarende røntgendatasett samles inn ved samme temperatur på samme krystall eller en krystall som vokser under samme forhold. For nøytrondiffraksjonsdata som samles inn ved romtemperatur (300 K), bør det tilsvarende røntgendatasettet samles inn ved romtemperatur ved hjelp av en datainnsamlingsstrategi med lav dose for å begrense strålingsskade. Perdeutererte prøver gir derimot forbedrede og kontinuerlige nøytron SLD-kart siden de ikke har samme størrelsesorden for H / D-signalreduksjon. Nøytronspredningslengden på visse elementer, inkludert metaller og svovel, gjør dem imidlertid dårlig synlige i nøytron SLD-kart, selv om proteinet har blitt perdeutert (figur 13C-F)18. Hvis et metall må karakteriseres, er det best å bruke røntgendiffraksjon i en felles raffinement eller bruke spektroskopiske teknikker for å utfylle diffraksjonseksperimenter. Nøytronbaserte dataforbedringer utføres ofte når nøytrondatasettet har høy oppløsning eller hvis et perdeutert protein ble brukt. I tillegg er nøytron-bare dataraffinering spesielt nyttig hvis et protein som er svært følsomt for strålingsskader studeres, siden en røntgen avledet struktur kan ha strålingsinduserte gjenstander. Hvis en nøytron-data-bare raffinement skal utføres, må det fastslås om det tilsvarende nøytrondatasettet har tilstrekkelig fullstendighet og oppløsning.
ORNL tilbyr to fasiliteter for innsamling av nøytrondiffraksjonsdata: IMAGINE-strålelinjen ved HFIR samt MaNDi-strålelinjen på SNS36,67. Mens begge instrumentene gir effektive midler for å samle inn et nøytrondiffraksjonsdatasett som bruker lignende prinsipper, har hvert instrument unike spesifikasjoner som bør tas i betraktning når du søker om stråletid. IMAGINE samler inn kvasi-Laue-data og er optimalisert for datainnsamling av romtemperatur på krystaller med enhetsceller opp til ~100 Å. MaNDi kan brukes til innsamling av romtemperatur og kryotemperaturdata ved bruk av TOF-Laue-innsamling på krystaller med enhetsceller opp til ~ 300 Å. Før du samler et komplett datasett, utføres en test på krystallen for å evaluere kvaliteten på det oppnådde diffraksjonsmønsteret der krystallen blir utsatt for nøytronstrålen for en enkelt ramme. Hvis krystallen er av tilstrekkelig kvalitet, vil et fullstendig nøytrondiffraksjonsdatasett bli samlet inn, indeksert, integrert, skalert og fusjonert i en prosess som er analog med røntgendatabehandling. IMAGINE benytter seg av Lauegen og Lscale og MaNDi benytter Mantid-pakken og benytter tredimensjonal profiltilpasning48,50,51,68,69,70. Forskere som blir brukere ved et av disse anleggene vil få et datasett i MTZ- eller HKL-format for videre analyse.
Nøytrondiffraksjon er en ikke-destruktiv, svært følsom teknikk for å undersøke protonasjonstilstanden og hydrogenbindingsinteraksjoner av biologiske makromolekyler. Det er spesielt nyttig for fotofølsomme proteiner og metalloproteiner. Flere hensyn til teknikken samt behandlingen av dataene må tas i betraktning før du utfører et eksperiment, men utfallet gir resultater som kan gi verdifull innsikt i den katalytiske mekanismen til proteinet av interesse. Nøytronproteinkrystallografi utfyller beregningsstudier, strukturelle, biokjemiske og spektroskopiske studier, noe som gjør det til et verdifullt verktøy i biologens verktøykasse av teknikker som brukes til å karakterisere biologiske makromolekyler.

Nøytron makromolekylær krystallografi er en teknikk som gir et unikt vindu inn i strukturen og underliggende kjemi av proteiner. Konseptuelt lik røntgendiffraksjon, gir nøytrondiffraksjon atomistiske detaljer om makromolekylær struktur, men samspillet mellom nøytroner med kjerner muliggjør lokalisering av lysatomer, ofte vanskelig å oppdage med røntgendiffraksjon1. Under røntgendiffraksjon sprer røntgenstråler seg fra elektronskyen, noe som gjør lysatomer som hydrogen (H) dårlig synlige i elektrontetthetskart som ikke har nær sub-Ångström oppløsning2. I motsetning er spredningsintensiteten til nøytroner avhengig av komplekse interaksjoner med kjernen, med isotoper av samme element som viser forskjellige spredningslengder. Derfor har lysatomer og deres isotoper, som hydrogen (1H) og deuterium (2H eller D), sammenlignbar synlighet med ryggradskarbon-, nitrogen- og oksygenatomer i nøytronspredningslengdetetthetskart (SLD). Videre, siden størrelsen på nøytronspredning er uavhengig av antall elektroner, er spredning fra lyselementer ikke skjult av tunge elementer når de er i nærheten av hverandre, som det observeres i røntgenspredning. Den forbedrede synligheten av H og dens isotop D ved bruk av nøytrondiffraksjon gir verdifull informasjon om protonasjonstilstanden til katalytisk viktige rester, kofaktorer og ligander og hjelper orienteringen av vannmolekyler, og avslører viktig informasjon om katalytiske mekanismer og proteinkjemi3. Nøytrondiffraksjon gir også fordelen av å være en ikke-destruktiv teknikk, spesielt egnet til biologiske prøver som er følsomme for ionisering som proteiner med metallsentre eller lysfølsomme redoks kofaktorer2. Hovedfokuset i denne artikkelen er å gi en oversikt over arbeidsflyten for å oppnå en høykvalitets nøytronproteinkrystallstruktur. Vi henviser den interesserte leseren til Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 og O'Dell et al.3 for en utmerket oversikt over nøytronproteindiffraksjon og Ashkar et al.7 for videre anvendelser av nøytronspredning.
Nøytroner genereres hovedsakelig under kjernefysiske reaksjoner som bruker en av to prosesser: kjernefysisk fisjon ved reaktorkilder eller spallasjon ved akseleratorbaserte kilder8. Reaktorkilder gir en kontinuerlig nøytronstråle ved å bruke kjernefysisk fisjon av 235U-isotopen, mens spallasjons nøytronkilder produserer en pulserende nøytronstråle ved å bombardere et mål, for eksempel et flytende metall som kvikksølv, med protoner9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) i Oak Ridge, Tennessee, er vert for både en steady-state nøytronkilde ved High Flux Isotope Reactor (HFIR) og en 60 Hz pulsert kilde ved Spallation Neutron Source (SNS). IMAGINE-strålelinjen, som ligger ved HFIR, er et nøytrondiffraktomometer optimalisert for biologiske makromolekyler (tilleggs figur 1)10. IMAGINE bruker en nøytronbildeplatedetektor til å måle kvasi-Laue-data ved hjelp av en smal båndovergang i området 2,8 – 4,5 Å fra enkeltkrystaller med enhetscellekanter <150 Å. Macromolecular Neutron Diffractometer (MaNDi), som ligger ved SNS, er et tidsforløp (TOF) Laue nøytrondiffraktomometer utstyrt med en sfærisk detektormatriseramme (DAF) (supplerende figur 2)11. MaNDi måler data fra enkeltkrystaller med enhetscellekanter i området 10 – 300 Å ved å bruke en justerbar 2 Å-bølgelengdebåndbredde mellom 2,0 – 6,0 Å12.
Prosessen med å generere nøytroner er svært energiintensiv, noe som resulterer i relativt svake nøytronstråleflukser når de kontrasteres til røntgenstråleflukser ved synkrotronkilder13. For å sikre tilstrekkelige signal-til-støy-forhold under datainnsamling, er det nødvendig å dyrke krystaller av passende størrelse og kvalitet14. Vanligvis er det nødvendig med krystaller med volumer > 0,1 mm3 for å samle inn data med tilstrekkelig statistikk15. I tillegg til lavere fluxer må iboende egenskaper ved samspillet mellom nøytroner og prøvekjerner tas i betraktning16. Spredningslengden på nøytroner er forskjellig for isotoper av samme element, en egenskap som med fordel kan utnyttes i små vinkel nøytronspredning (SANS) for å maskere eller markere regioner i en prøve - en prosess kjent som kontrastmatching17. I diffraksjonseksperimenter kan den negative sammenhengende nøytronspredningslengden på H (-3,741 fm for 1H) føre til kansellering av nøytronspredningstetthetskartfunksjoner siden den sammenhengende nøytronspredningslengden til andre biologisk relevante atomer, inkludert karbon (6.6511 fm for 12C), nitrogen (9.37 fm for 14N), oksygen (5.803 fm for 16O), fosfor (5,13 fm for 31P) og svovel (2,804 fm for 32S), er positive (tabell 1)12,14. Videre øker den store usammenhengende spredningslengden på H (25.274 fm), bakgrunnen under datainnsamlingen, hemmer kvaliteten på datasettet og kompromitterer dataoppløsningen7. For å omgå disse begrensningene introdusert av H er det nødvendig, for nøytrondiffraksjon, å bytte H for isotopdeuterium, 2H (D), som har en positiv sammenhengende nøytronspredningslengde (6.671 fm) og betydelig lavere usammenhengende spredningslengde (4.04 fm)19. Dette kan oppnås ved perdeuterasjon, en prosess der proteinet uttrykkes av organismer dyrket i fullt deuterte medier som sikrer fullstendig innlemmelse av D på H-steder20. Det er også mulig å delvis deuterate protein ved å erstatte H med D utelukkende på utskiftbare steder (titratable grupper) mens de ikke-utskiftbare karbonbundne stedene forblir hydrogenert21. Dette kan oppnås ved vekst av hydrogenerte proteinkrystaller i deuterated moderluten22. Vanligvis utføres imidlertid H/D-utveksling av hydrogenerte proteiner ved damputveksling etter vekst av passende store krystaller i H2O-basert buffer23. I slike tilfeller er krystaller montert i en kvarts kapillær og damp-likevektet med en D20-basert moderluten.
De begrensede nøytronfluksene ved nøytronkilder resulterer i lengre datainnsamlingstider, alt fra dager til flere uker24. På ORNL bruker både IMAGINE og MaNDi et smalt bølgelengdebåndpass i 2–6 Å-serien for å optimalisere datainnsamlingen25. Data kan samles inn ved romtemperatur eller ved kryotemperatur. Kryodatainnsamling kan potensielt forbedre datakvaliteten og åpner muligheten for å fryse fange katalytiske mellomprodukter. Etter nøytrondiffraksjonsdata samles vanligvis et røntgendatasett på samme krystall ved samme temperatur eller på en krystall som vokser under identiske forhold26. Datainnsamling ved samme temperatur gjør det mulig å utføre strukturforbedring mot både røntgen- og nøytrondata, noe som forhindrer potensielle temperaturinduserte gjenstander som endringer i synligheten og posisjonen til farvann eller belegg av rester med alternative konformasjoner27. Ledd røntgen nøytron data raffinement øker data-til-parameter forholdet og gir fordelen av å tillate protein ryggraden koordinater å bli raffinert mot røntgendata, mens nøytron diffraksjon data brukes til å avgrense posisjonen til H / D atomer28. Dette er spesielt nyttig ved bruk av delvis deuterte prøver, hvor tetthetsreduksjon på grunn av H-atomer på ikke-utskiftbare steder på proteinet er til stede. Selv om antallet røntgenstrukturer langt overstiger antall nøytronstrukturer deponert i Protein Data Bank (PDB), har programvarepakker som opprinnelig ble designet for raffinering av røntgendata blitt utvidet til å omfatte nøytrondata også3,29,30. Etter datainnsamlingen kan modeller raffineres ved hjelp av raffineringspakker som phenix.refine, CNSsolve (nCNS) eller SHELXL28,31,32,33. Under raffineringsprosessen kan nøytronspredningstetthetskart visualiseres for manuell montering ved hjelp av COOT34. Etter strukturløsning kan koordinatene og nøytron- og/eller røntgendiffraksjonsdatafilene sendes til PDB, som vil validere og deponere modellen, noe som gjør den tilgjengelig for offentlig tilgang18,29,30.
Strukturell analyse av proteiner er en mangesidig tilnærming der mange teknikker brukes til å sondere deres funksjon og mekanisme35. Nøytronproteinkrystallografi gir verdifull kjemisk innsikt for å utvide og utfylle funn fra tilleggsstudier som røntgendiffraksjon, spektroskopi, kjernemagnetisk resonans (NMR) eller mikrokrystallelektrondiffraksjon (microED)36. Nøytronproteindiffraksjon er unikt posisjonert for å gi innsikt i enzymatiske mekanismer, siden H-atomer er sentrale i kjemien. Fraværet av strålingsskader forårsaket av nøytroner gjør dem til en sonde som er usedvanlig egnet til studiet av metalloproteiner37. Vi presenterer her et representativt eksempel på prosessen med nøytronproteindiffraksjon fra prøvepreparering til datainnsamling, raffinement og analyse (figur 1). Krystaller av tilstrekkelig størrelse for nøytrondiffraksjonsforsøk har blitt dyrket av metalloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D er et kobberholdig metalloprotein involvert i nedbrytning av rekalsitrantcellulose ved oksygenatominnsetting ved glykosidbindingen38,39. Det aktive nclpmo9d-anlegget inneholder et mononukleært kobbersenter innenfor en karakteristisk "histidin-støtte" sammensatt av N-terminal histidin og en annen bevart histidin (tilleggsfigur 3)40. N-terminalen for sopp-LPMOer er metylert, men den post-overgangsmodifiseringen oppstår ikke under rekombinant uttrykk i gjær. I hviletilstanden ncLPMO9D er kobbersenteret til stede i en Cu2+ oksidasjonstilstand og aktiveres ved enkelt elektronreduksjon til Cu1+, slik at molekylært oksygen kan bindes og aktiveres ved raskt å bli redusert til en superoksidart41,42. Den generelle NcLPMO9D-reaksjonen krever ytterligere tilsetning av ett elektron og to protoner for å danne det hydroksylerte polysakkaridproduktet43. Identiteten til de aktiverte oksygenartene som er ansvarlige for hydrogenatomabstraksjon (HAA) fra polysakkaridsubstratet er ikke identifisert, og intensive strukturelle og beregningsstudier pågår for tiden44,45. Gitt redokskjemien på det aktive nettstedet NcLPMO9D, er reduksjon av strålingsskader spesielt relevant. Vi illustrerer her romtemperatur og innsamling av kryotemperaturdata på NcLPMO9D-krystaller for å bestemme NcLPMO9D-strukturen i hviletilstanden og i den aktiverte reduserte formen, henholdsvis46. Det vil bli lagt vekt på proteinkrystallmontering, stråleinstrumentoppsett for datainnsamling, utarbeidelse av data- og koordinatfiler og raffineringstrinnene som er nødvendige for å modellere en atom nøytronstruktur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td>
			<td>DiaDent/DiaVet</td>
			<td>218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary wax</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.0.077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Version 0.8.9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalCap ALS</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-Tip Forceps</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>TW-CTF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &#181;m</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M5-L18SP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30266626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>M-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four Color Mounting Clay</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (T),</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td>
			<td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td>
			<td>XtaLAB Synergy-R</td>
			<td>Home source X-ray diffractometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Wand Straight</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &#8211; 20 &#181;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &#215; 96 pcs.)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.14-3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Tong 18 mm</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 0.1-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 10-100 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 20-200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR6-146</td>
			<td>Thin-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>GB-B3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>CV1012</td>
			<td>Thick-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich Box with cover</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax pen</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

Nøytronkrystallografi er en strukturell teknikk som gjør det mulig å bestemme hydrogenatomposisjoner innen biologiske makromolekyler, noe som gir mekanistisk viktig informasjon om protonasjons- og hydreringstilstander mens de ikke induserer strålingsskader. Røntgendiffraksjon gir derimot bare begrenset informasjon om posisjonen til lysatomer, og røntgenstrålen induserer raskt strålingsskader på lysfølsomme kofaktorer og metallsentre. Presentert her er arbeidsflyten ansatt for IMAGINE og MaNDi bjelker på Oak Ridge National Laboratory (ORNL) for å få en nøytron diffraksjon struktur når en protein krystall av passende størrelse (> 0,1 mm3) har blitt dyrket. Vi demonstrerer montering av hydrogenerte proteinkrystaller i kvarts kapillærer for nøytrondiffraksjonsdatainnsamling. Også presentert er damputvekslingsprosessen til de monterte krystallene med D2O-inneholdende buffer for å sikre utskifting av hydrogenatomer på utskiftbare steder med deuterium. Inkorporering av deuterium reduserer bakgrunnen som oppstår fra usammenhengende spredning av hydrogenatomer og forhindrer tetthetsreduksjon forårsaket av deres negative sammenhengende spredningslengde. Innsamlingsstrategier for prøvejustering og romtemperaturdata illustreres ved hjelp av kvasi-Laue-datainnsamling ved IMAGINE ved High Flux Isotope Reactor (HFIR). Videre demonstreres krystallmontering og rask frysing i flytende nitrogen for kryo-datainnsamling for å fange labile reaksjons-mellomprodukter på MaNDi-flytidsinstrumentet ved Spallation Neutron Source (SNS). Utarbeidelse av modellkoordinat- og diffraksjonsdatafiler og visualisering av nøytronspredningslengdetetthetskart (SLD) vil også bli adressert. Strukturforbedring mot kun nøytrondata eller mot felles røntgen-/nøytrondata for å oppnå en atomstruktur av proteinet av interesse vil endelig bli diskutert. Prosessen med å bestemme en nøytronstruktur vil bli demonstrert ved hjelp av krystaller av det lytiske polysakkaridmonoksygenase Neurospora crassa LPMO9D, et kobberholdig metalloprotein involvert i nedbrytning av rekalsykliske polysakkarider via oksidativ spalting av glykosidbindingen.

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

Nøytronproteinkrystallografi er en strukturell teknikk som tillater lokalisering av hydrogenatomer, og dermed gir viktige mekanistiske detaljer om proteinfunksjon. Vi presenterer her arbeidsflyten for montering av en proteinkrystall, nøytrondiffraksjonsdatainnsamling, strukturraffinering og analyse av nøytronspredningslengdetetthetskartene.

Nøytronkrystallografi Datainnsamling og prosessering for modellering av hydrogenatomer i proteinstrukturer

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Analysere Protein Dynamics Bruke Hydrogen Exchange-massespektrometri

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Kritisk Nitrogen Processing for rensing av reaktiv porøse materialer

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

Funksjonalisering av enkelt vegger karbonnanorør med Thermo-reversible blokkopolymerer og Karakterisering av Small-vinkel nøytronspredning

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray Powder Diffraksjon i Conservation Science: Mot Rutine Crystal Structure Bestemmelse av korrosjonsprodukter på Heritage Kunstverk

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Meget Stabil, Funksjonell Hairy Nanopartikler og Biopolymere fra trefibrene: Mot bærekraftig Nanoteknologi

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic brikker for In Situ Crystal X-ray Diffraksjon og In Situ dynamisk lysspredning for føljetong krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

Eksperimentelle metoder for effektiv Solar hydrogen produksjon i mikrogravitasjon miljø

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...

Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

Syntese av metall nanopartikler støttet på karbon nanorør med dopet Co og N atomer og dets katalytiske applikasjoner i hydrogenproduksjon

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...

Hydrogen Production and Utilization in a Membrane Reactor

Hydrogenproduksjon og -utnyttelse i en membranreaktor

Industrial hydrogenation consumes ~11 Mt of fossil-derived H2 gas yearly. Our group invented a membrane reactor to bypass the need to use H2 gas for ...