Name: neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'ndaki ABD Enerji Bakanlığı Biyolojik ve Çevresel Araştırma Kullanıcı Tesisi olan Yapısal Moleküler Biyoloji Merkezi'nde (CSMB) protein ekspresyasyonu, saflaştırma ve kristalizasyon deneyleri yapıldı. Nötron kırınım verileri BL-11B MaNDi'de, ABD Enerji Bakanlığı Temel Enerji Bilimleri Ofisi Bilimsel Kullanıcı Tesisleri Bölümü tarafından desteklenen ORNL'deki Spallation Nötron Kaynağı'nda (SNS) toplanmıştır. Yazarlar Brendan Sullivan'a veri azaltma konusundaki yardımları için teşekkür ediyorlar. X-ışını kırınım verileri, Kuzey Carolina Eyaleti tarafından desteklenen North Carolina State Üniversitesi Moleküler Eğitim, Teknoloji ve Araştırma İnovasyon Merkezi (METRIC) tesislerinde toplanmıştır. GCS, kısmen Ulusal Araştırma Vakfı (NRF), Güney Afrika ve ORNL'deki Lisansüstü Fırsatlar (GO!) programından destek kabul eder. FM, USDA NIFA Hatch 211001 desteğini kabul ediyor.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nötron proteini kristalografisi, proteinlerde protonasyon durumlarını ve su molekülü yönelimini araştırmak için oldukça hassas bir tekniktir. Bu bilgi protein katalitik mekanizmalarına ışık tutar, çünkü protonasyon ve hidrojen bağlanma etkileşimlerindeki değişiklikler genellikle enzim kimyası için merkezidir10. Nötron proteini kristalografisi, bilgilendirici bir teknik olsa da, nötron kırınım deneyi yapmayı planlamadan önce dikkate alınması gereken bir dizi faktöre sahiptir, yani:
<ol><li>Veri toplama için büyük protein kristalleri gereksinimi.</li>
	<li>Hidrojenin ve metal iyonları gibi diğer elementlerin saçılma özellikleri.</li>
	<li>Kısırlaştırılmış örneklerle çalışırken yapı iyileştirme ve model oluşturma yazılımındaki sınırlamalar.</li>
</ol>Nötron proteini kristalografisi akı sınırlı bir tekniktir. X-ışını kırınım veri kümelerinin aksine, nötron veri kümeleri için doğal sınırlamalar (akı sınırlı, yarı Laue, daha uzun dalga boyları) nedeniyle nötron veri kümeleri için daha yüksek R faktörleri ve daha düşük tamlık, artıklık ve sinyal-gürültü oranları beklenmektedir. Tek bir çerçevenin veri toplaması genellikle 12 - 18 saattir. Bir deneyin başarısı, genellikle minimum gereksinim olan 0,1 mm3 kristallerle numune boyutuna ve kalitesine oldukça bağlıdır3. Nötron kırınımı, 10 ila 800 μL arasında değişen kristalizasyon damlaları kurmak için büyük miktarlarda protein üretimi gerektirir. Yeterince büyük kristaller yetiştirmek için minimum hacim, kristal ve numune parametreleri (https://neutrons.ornl.gov/imagine) verilen bir Hacim Hesaplayıcısı kullanılarak tahmin edilebilir. Büyük kristallerin büyümesi en yaygın olarak buhar difüzyonu ile gerçeklenmiştir3. Asılı damla kristalizasyonu, kristallerin 10-25 μL arasında değişen büyük damlalarda büyümesine izin verirken, ~ 50 μL'ye kadar değişen daha büyük damlalar ticari olarak mevcut oturma damlası ekipmanı14,54 kullanılarak ayarlanabilir. Silikonize dokuz kuyulu cam plakalar, 800 μL'ye kadar hacimlerle çok büyük damlalar kurmak için kullanılabilir. Bu cam tabaklar, Hampton Research'ün ticari olarak kullanabileceği "sandviç kutularına" yerleştirilir. Diğer kristalizasyon teknikleri, damla boyutunun sınırının gemi tarafından dikte edildiği toplu kristalizasyonu içerir. Toplu kristalizasyon deneyi kurulumu mikrolitrelerden mililitrelere kadar değişebilir55. Kristalizasyon, proteinin bir diyaliz zarı aracılığıyla çökelti ile denge edildiği diyaliz tekniği kullanılarak veya çökelti konsantrasyon gradyanı boyunca veya agarose56,57 gibi gözenekli bir tıkaç aracılığıyla karşı difüzyon ile de gerçekleştirilebilir. Tohumlama, istenen hacimde kristaller elde etmek için başka bir alternatif sunar. Mikro ve macroseeding, NcLPMO9D45'in büyük kristali de dahil olmak üzere büyük kristal büyümesi için başarıyla edilmiştir. Sıcaklığın çözünürlük üzerindeki etkisi de dahil olmak üzere protein faz diyagramı hakkında bazı bilgiler, büyük kristal büyümesine yardımcı oluyor.
Nötron kırınım deneyi planlarken, kırınım veri toplama sırasında sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için protein hazırlığının optimizasyonu esastır7. H atomlarının neden olduğu yoğunluk iptalini ve yüksek tutarsız saçılmaları atlatmak için nötron SLD haritaları, pozitif tutarlı saçılma uzunluğuna ve düşük tutarsız saçılma uzunluğuna sahip olan Izotop D'siyle H atomları değiş tokuş edilerek geliştirilebilir. Bunu başarmak için hidrojenize protein kristalinin döterlenmiş kristalleşme tamponuna karşı buhar değişimi gerçekleştirilir. Bu, çözücü moleküllerin ve labile, titrilebilir protein H atomlarının H/ D değişimini sağlar23. Buhar değişimi, hidrojenize kristalin D2O bazlı, döterlenmiş kristalleşme tamponu "fişleri" ile bir kuvars kılcal damara monte edilmesiyle gerçekleştirilir ve en sık uygulanan etkili, nazik bir tekniği temsil eder14,23,35. Değişim birkaç hafta sürebilir ve tercihen maksimum H/D değişimini sağlamak için deuterated arabelleğin sık sık değiştirilmesini gerektirir. H/D değişimi, kristalin doğrudan sönmüş tampona batırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. D2O maruziyeti nedeniyle kristalin stres altında kalmasını önlemek için, emme işlemi D2O:H2O oranının artarak kademeli olarak gerçekleştirilmesi gerekir58. Buna ek olarak, hidrojenize proteinin kristalizasyonu labile H bölgelerinde H/D değişimi için döterlenmiş tamponda da yapılabilir22,59. Bununla birlikte, D2O tabanlı tamponun bilinen H2O tabanlı koşulların daha fazla ayarlandırılmasını gerektiren protein çözünürlüğü üzerinde bir etkisi olduğu belirtilmelidir3,59. D2O bazlı tamponların da bazı durumlarda daha küçük kristallere yol açacağı gözlenmiştir59. Titretilebilir ve karbona bağlı H atomlarının D ile tam değişimi, perdeuterated bir örnek oluşturmak için kısırlaştırılmış ortamdaki proteinlerin ifade edilmesiyle elde edilebilir20. Perdeuterated numunenin elde edilen nötron SLD haritaları önemli ölçüde iyileştirilecek ve artık hidrojene numune muadili yoğunluk iptalini görüntülemeyecektir. Bu, bir protein veya kofaktörde değiş tokuş edilemeyen bölgelere bağlı H / D'yi karakterize ederken faydalıdır. Bununla birlikte, perdeuterated proteinin ekspresy ekspresy ifadesi hem maliyeti yüksektir hem de verimi düşüktür60. Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı (ORNL) Yapısal Moleküler Biyoloji Merkezi (CSMB), perdeuterated örnek (https://www.ornl.gov/facility/csmb) oluşturmak isteyen kullanıcılar için bir döterasyon olanağı sunmaktadır. Perdeuterated ekspresyon tipik olarak 1 L ölçeğinde bir biyoreaktörde gerçekleştirilir ve ~50 mg saflaştırılmış protein61 verir.
Nötron kırınım verilerinin toplanmasının ardından arıtma ve interaktif model oluşturma işlemi gerçekleştirilir. İyileştirme, phenix.refine, nCNS veya SHELXL28,31,32,33 dahil olmak üzere birden fazla yazılım paketi kullanılarak çalıştırılabilir. Phenix paketi, modeli nötron SLD haritalarından manuel olarak oluşturmak için kullanılan Coot ile birlikte nötron kırınım verilerinin iyileştirilmesi için en yaygın kullanılan yazılımdır34. Hem Phenix hem de Coot nötron kırınım verilerinin işlenmesine izin verse de, nötron verileri ve kısırlaştırılmış örneklerle ilişkili özellikleri işlemek için gerekli bazı özelliklerden yoksun olabilirler. Örneğin, Coot, "Gerçek Uzay Rafine Etme" özelliği "patlayan" kalıntılarla sonuçladığı için model oluşturma sırasında komplikasyonlara yol açabilecek, kısırlaştırılmış kalıntılar için geometri optimizasyonu içermez (Ek Şekil 26)62. Bu, tüm kısırlaştırılmış kalıntılar için kısıtlama dosyaları oluşturularak çözülebilir. Ancak, bu yoğun bir işlemdir ve bu tür kitaplıklar şu anda herkese açık değildir. Phenix'te iyileştirmeler yapılırken, değiştirilebilir H/D siteleri başlangıçta H ve D için 0,50 doluluk olarak ayarlanacaktır. Arıtmalar yapıldıkça, H ve D'nin doluluğu nötron SLD haritalarına göre iyileştirilecektir. İnteraktif model oluşturma sırasında, fark yoğunluğu Fo-Fc haritaları H / D doluluklarını değerlendirmede çok bilgilendiricidir. Haritalar, hangi sitelerin yüksek D doluluğuna sahip olduğunu belirlemek için kullanılabilir, bu da özellikle protonasyon durumlarının katalitik olarak ilgili olduğu aktif sitede bilgilendiricidir63. Belirsiz durumlar ortaya çıkar, ancak, H:D doluluk 0.70:0.30'a yakındır ve bu da nötron SLD haritalarında tam sinyal iptali ile sonuçlanır64. Ayrıca, yarı Laue nötron veri setlerinin genellikle X-ışını kırınım verileri için rutin olarak gözlenenden ≥% 98'den daha düşük olan% 80 civarında bütünlüğe sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Phenix nötron kırınım verileri iyileştirilirken, eksik gözlemlenen genlikler (Fo) bu nedenle yansıma listesini tamamlamak için modelden hesaplanır, böylece model önyargısı ortaya çıkarır. Bu potansiyel önyargıyı hesaba katmak için "no_fill" haritaları , "doldurulmuş" haritaların aksine etkileşimli model oluşturma sırasında incelenmelidir.
Kullanıcılar, yapılarının ortak bir X-ışını/nötron veri iyileştirmesini veya yalnızca nötron verilerinin iyileştirilmesini gerçekleştirmeyi seçebilir. Nötron SLD haritalarını özellikle daha düşük çözünürlükte görselleştirmek, özellikle H/D buhar değişimine rağmen H'nin hala değişemeyen yerlerde bulunduğu hidrojenize bir protein için başlangıçta rahatsız edici olabilir. Bu, nötron yoğunluğu haritası iptalleriyle sonuçlanır ve süreksiz haritalar izlenimi verir65,66. karşılık gelen bir X-ray veri kümesinin toplanması, bu iptalleri ortak bir iyileştirmede avantajlı bir şekilde tamamlar (Şekil 13A ve Şekil 13B). Ortak iyileştirme stratejisi tipik olarak protein omurga koordinatlarının X-ışını verilerine karşı rafine edilmesini içerirken, nötron kırınım verileri değiştirilebilir sahalarda H/D atomlarının konumunu ve doluluğunu iyileştirmek için kullanılır28. Değiştirilebilir sahalarda ortak H/D doluluğunun getirilmesi rafine edilen parametrelerin sayısını artırdığından, X-ray verileriyle ortak bir iyileştirme de veri-parametre oranını artırır. Bir eklem iyileştirmesi, karşılık gelen bir X-ışını veri kümesinin aynı kristal veya aynı koşullar altında yetiştirilen bir kristal üzerinde aynı sıcaklıkta toplanmasını gerektirir. Oda sıcaklığında (300K) toplanan nötron kırınım verileri için, ilgili X-ışını veri kümesi, radyasyon hasarını sınırlamak için düşük doz veri toplama stratejisi kullanılarak oda sıcaklığında toplanmalıdır. Perdeuterated numuneler, aksine, aynı büyüklükte H/D sinyal iptali olmadığı için geliştirilmiş ve sürekli nötron SLD haritaları sağlar. Bununla birlikte, metaller ve kükürt de dahil olmak üzere belirli elementlerin nötron saçılma uzunluğu, protein perdeuterated olsa bile nötron SLD haritalarında zayıf görünür hale getirir (Şekil 13C-F)18. Bir metalin karakterize edilmesi gerekiyorsa, bir eklem iyileştirmesinde X-ışını kırınımını kullanmak veya kırınım deneylerini tamamlamak için spektroskopik teknikler uygulamak en iyisidir. Nötron veri kümesi yüksek çözünürlüğe sahip olduğunda veya perdeuterated protein kullanıldığında genellikle yalnızca nötron veri iyileştirmeleri gerçekleştirilir. Ek olarak, sadece nötron veri rafinajı, radyasyon hasarına karşı oldukça hassas bir protein üzerinde çalışılıyorsa özellikle yararlıdır, çünkü X-ışını türevi bir yapı radyasyon kaynaklı eserlere sahip olabilir. Yalnızca nötron verisi iyileştirmesi yapılacaksa, karşılık gelen nötron veri kümesinin yeterli eksiksizliğe ve çözünürlüğe sahip olup olmadığı tespit edilmelidir.
ORNL, nötron kırınım verilerinin toplanması için iki olanak sunar: HFIR'daki IMAGINE beamline ve SNS36,67'deki MaNDi kiriş hattı. Her iki cihaz da benzer ilkeleri kullanan bir nötron kırınım veri kümesi toplamak için etkili araçlar sağlarken, her enstrüman ışın süresi için başvururken dikkate alınması gereken benzersiz özelliklere sahiptir. IMAGINE, quasi-Laue verilerini toplar ve ~100 Å'ya kadar birim hücrelere sahip kristallerde oda sıcaklığı verisi toplanması için optimize edilmiştir. MaNDi, ~ 300 Å'ya kadar birim hücrelere sahip kristaller üzerinde TOF-Laue toplamayı kullanan oda sıcaklığı ve kriyo sıcaklığı verilerinin toplanması için kullanılabilir. Tam bir veri kümesini toplamadan önce, kristalin nötron ışınlarına tek bir kare için maruz kaldığı elde edilen kırınım deseninin kalitesini değerlendirmek için kristal üzerinde bir test yapılır. Kristal yeterli kalitedeyse, X-ray veri işlemeye benzer bir işlemde tam bir nötron kırınım veri kümesi toplanacak, dizine eklenecek, entegre edilecek, ölçeklendirilecek ve birleştirilecektir. IMAGINE Lauegen ve Lscale'den yararlanır ve MaNDi Mantid paketini kullanır ve üç boyutlu profil uydurması kullanır48,50,51,68,69,70. Bu tesislerden herhangi birine kullanıcı olan bilim insanlarına daha fazla analiz için MTZ veya HKL formatında bir veri kümesi sağlanacaktır.
Nötron kırınımı, biyolojik makromoleküllerin protonasyon durumunu ve hidrojen bağı etkileşimlerini yok etmek için tahribatsız, son derece hassas bir tekniktir. Özellikle fotoğrafa duyarlı proteinler ve metalloproteinler için faydalıdır. Bir deney yapmadan önce teknik ve verilerin işlenmesi ile ilgili çeşitli hususlar dikkate alınmalıdır, ancak sonuç, ilgi proteininin katalitik mekanizması hakkında değerli bilgiler verebilecek sonuçlar verir. Nötron proteini kristalografisi hesaplamalı, yapısal, biyokimyasal ve spektroskopik çalışmaları tamamlayarak biyoloğun biyolojik makromolekülleri karakterize etmek için kullanılan teknikler araç kutusunda değerli bir araç haline getirir.

Nötron makromoleküler kristalografi, proteinlerin yapısına ve alttaki kimyasına benzersiz bir pencere sağlayan bir tekniktir. Kavramsal olarak X-ışını kırınımsına benzer şekilde, nötron kırınımı makromoleküler yapının atomik ayrıntılarını sağlar, ancak nötronların çekirdeklerle etkileşimi, genellikle X-ışını kırınımı ile tespit edilmesi zor olan ışık atomlarının lokalizasyonunu sağlar1. X-ışını kırınımı sırasında, X ışınları elektron bulutundan dağılır ve hidrojen (H) gibi ışık atomlarını Ångström çözünürlüğüne yakın olmayan elektron yoğunluk haritalarında zayıf görünür hale getirir2. Buna karşılık, nötronların saçılma yoğunluğu, aynı elemanın izotoplarının farklı saçılma uzunlukları göstermesiyle çekirdekle karmaşık etkileşimlere bağlıdır. Bu nedenle, ışık atomları ve hidrojen (1H) ve döteryum (2H veya D) gibi izotopları, nötron saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) haritalarındaki omurga karbon, azot ve oksijen atomlarıyla karşılaştırılabilir görünürlüğe sahiptir. Ayrıca, nötron saçılımının büyüklüğü elektron sayısından bağımsız olduğundan, ışık elementlerinden saçılma, X-ışını saçılmalarında da gözlendiği gibi, birbirlerine yakın olduklarında ağır elementler tarafından gizlenmez. Nötron kırınımı kullanırken H ve izotop D'nin gelişmiş görünürlüğü, katalitik olarak önemli kalıntıların, kofaktörlerin ve ligandların protonasyon durumu hakkında değerli bilgiler sağlar ve su moleküllerinin yönlendirilmesine yardımcı olarak katalitik mekanizmalar ve protein kimyası hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarır3. Nötron kırınımı ayrıca, özellikle metal merkezleri veya ışığa duyarlı redoks kofaktörleri gibi iyonlaşmaya duyarlı biyolojik örneklere uygun tahribatsız bir teknik olma avantajı sunar2. Bu makalenin ana odak noktası, yüksek kaliteli bir nötron proteini kristal yapısı elde etmek için iş akışına genel bir bakış sağlamaktır. Nötron protein kırınımının mükemmel bir genel görünümü için ilgili okuyucuyu Podjarny ve ark.4, Blakeley5, Blakeley ve ark.6 ve O'Dell ve diğerleri için ve nötron saçılımının daha fazla uygulaması için Ashkar ve ark.7'ye yönlendiriyoruz.
Nötronlar öncelikle iki işlemden birini kullanan nükleer reaksiyonlar sırasında üretilir: reaktör kaynaklarında nükleer fisyon veya hızlandırıcı tabanlı kaynaklarda spallasyon8. Reaktör kaynakları , 235U izotopun nükleer fizyonunu kullanarak sürekli bir nötron ışını sağlarken, spallation nötron kaynakları bir hedefi, örneğin cıva gibi sıvı bir metali protons9 ile bombalayarak darbeli bir nötron ışını üretir. Oak Ridge, Tennessee'deki Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı (ORNL), Yüksek Akı Izotop Reaktörü'nde (HFIR) hem sabit bir nötron kaynağına hem de Spallation Nötron Kaynağı'nda (SNS) 60 Hz darbeli bir kaynağa ev sahipliği yapmaktadır. HFIR'da bulunan IMAGINE beamline, biyolojik makromoleküller için optimize edilmiş bir nötron difaraktometresidir (Ek Şekil 1)10. IMAGINE, birim hücre kenarları <150 şolan tek kristallerden 2,8 – 4,5 şaralığında dar bir bandpass kullanarak yarı Laue verilerini ölçmek için bir nötron görüntü plakası dedektörü kullanıyor. SNS'de bulunan Makromoleküler Nötron Difaraktometresi (MaNDi), küresel dedektör dizi çerçevesi (DAF) (Ek Şekil 2)11 ile donatılmış bir uçuş zamanı (TOF) Laue nötron difaraktometresidir. MaNDi, 2.0 – 6.0 Å12 arasında ayarlanabilir 2 şdalga boyu bant genişliği kullanarak 10 – 300 şaralığında birim hücre kenarlarına sahip tek kristallerden gelen verileri ölçer.
Nötron üretme süreci oldukça enerji yoğundur, bu da senkrotron kaynaklarında X-ışını ışını akılarının aksine nispeten zayıf nötron ışını akılarına neden olur13. Veri toplama sırasında yeterli sinyal-gürültü oranlarını sağlamak için uygun boyutta ve kalitede kristaller yetiştirmek gerekir14. Tipik olarak, yeterli istatistiklerle veri toplamak için hacimleri 0,1 mm3'> kristallere ihtiyaç vardır15. Daha düşük akılara ek olarak, nötronlar ve örnek çekirdekler arasındaki etkileşimin doğal özellikleri dikkate alınmalıdır16. Nötronların saçılma uzunluğu, aynı elemanın izotopları için farklılık gösterir, bir numunenin bölgelerini maskelamak veya vurgulamak için küçük açılı nötron saçılmada (SANS) avantajlı bir şekilde yararlanılabilen bir özelliktir - kontrast eşleştirme17 olarak bilinen bir işlem. Kırınım deneylerinde, H'nin negatif tutarlı nötron saçılma uzunluğu (-1H için-3.741 fm), nötron saçılma yoğunluk haritası özelliklerinin iptaline neden olabilir, çünkü diğer biyolojik olarak ilgili atomların tutarlı nötron saçılma uzunlukları, karbon (12C için 6.6511 fm), azot (14N için 9.37 fm), oksijen (16O için 5.803 fm), fosfor (31P için 5.13 fm) ve kükürt (32S için 2.804 fm), pozitiftir (Tablo 1)12,14. Ayrıca, H'nin (25.274 fm) büyük tutarsız saçılma uzunluğu, veri toplama sırasında arka planı artırarak veri kümesinin kalitesini engeller ve veri çözünürlüğünü tehlikeye atar7. H tarafından getirilen bu sınırlamaları atlatmak için, nötron kırınımı için, H'yi pozitif tutarlı nötron saçılma uzunluğuna (6.671 fm) ve önemli ölçüde daha düşük tutarsız saçılma uzunluğuna (4.04 fm)19 sahip izotop döteryumu, 2H(D) ile değiştirmek gerekir. Bu, proteinin tamamen döterlenmiş ortamda yetişen organizmalar tarafından ifade edildiği ve H sitelerinde D'nin tamamen birleştirilmesini sağlayan bir süreç olan perdeuterasyon ile elde edilebilir20. Proteini kısmen döterleme, H'yi sadece değiştirilebilir sahalarda (titretilebilir gruplar) D ile değiştirerek, değiştirilebilir olmayan karbona bağlı bölgeler hidrojene olarak kalırken kısmen deutere etmek de mümkündür21. Bu, döterlenmiş ana likörde hidrojenize protein kristallerinin büyümesiyle elde edilebilir22. Bununla birlikte, en yaygın olarak, hidrojenize proteinlerin H / D değişimi, H2O bazlı tampon23'te uygun büyük kristallerin büyümesini takiben buhar değişimi ile gerçekleştirilir. Bu gibi durumlarda, kristaller bir kuvars kılcal damara monte edilir ve D20 bazlı bir ana likör ile buharla dengelenir.
Nötron kaynaklarındaki sınırlı nötron akıları, günler ile birkaç hafta arasında değişen daha uzun veri toplama sürelerine neden oluyor24. ORNL'de hem IMAGINE hem de MaNDi, veri toplamayı optimize etmek için 2-6 şaralığında dar bir dalga boyu bandpası kullanır25. Veriler oda sıcaklığında veya kriyo sıcaklığında toplanabilir. Kriyo-veri toplama potansiyel olarak veri kalitesini artırabilir ve dondurarak katalitik ara ürünler için olasılık açar. Nötron kırınım veri toplamayı takiben, bir X-ışını veri kümesi genellikle aynı sıcaklıkta aynı kristalde veya aynı koşullarda yetiştirilen bir kristal üzerinde toplanır26. Aynı sıcaklıkta veri toplama, hem X-ışını hem de nötron verilerine karşı yapı iyileştirmesi yapılmasına izin vererek, suların görünürlüğünde ve konumundaki değişiklikler veya alternatif konformasyonlarla kalıntıların doluluğu gibi potansiyel sıcaklık kaynaklı eserleri önler27. Ortak X-ışını nötron veri rafine etme veri-parametre oranını artırır ve protein omurga koordinatlarının X-ışını verilerine karşı rafine edilmesine izin verme avantajı sağlarken, nötron kırınım verileri H/D atomlarının konumunu iyileştirmek için kullanılır28. Bu, protein üzerinde değiş tokuş edilemeyen bölgelerde H atomları nedeniyle yoğunluk iptalinin mevcut olduğu kısmen deuterated örnekleri kullanırken özellikle yararlıdır. X-ışını yapılarının sayısı Protein Veri Bankası'nda (PDB) biriken nötron yapılarının sayısını çok aşsa da, başlangıçta X-ray verilerinin iyileştirilmesi için tasarlanan yazılım paketleri nötron verilerinin yanı sıra 3,29,30'u kapsayacak şekilde genişletilmiştir. Veri toplamayı takiben modeller phenix.refine, CNSsolve (nCNS) veya SHELXL28,31,32,33 gibi arıtma paketleri kullanılarak geliştirilebilir. Arıtma işlemi sırasında, nötron saçılma yoğunluk haritaları COOT34 kullanılarak manuel montaj için görselleştirilebilir. Yapı çözümünü takiben, koordinatlar ve nötron ve/veya X-ışını kırınım veri dosyaları, modeli doğrulayacak ve yatıracak olan PDB'ye gönderilebilir ve bu da genel erişime açık hale getirir18,29,30.
Proteinlerin yapısal analizi, işlevlerini ve mekanizmalarını araştırmak için çok sayıda tekniğin kullanıldığı çok yönlü bir yaklaşımdır35. Nötron proteini kristalografisi, X-ışını kırınımı, spektroskopi, nükleer manyetik rezonans (NMR) veya mikro kristal elektron kırınımı (microED)36 gibi ek çalışmalardan elde edilen bulguları genişletmek ve tamamlamak için değerli kimyasal içgörüler sağlar. Nötron protein kırınımı, enzimmatik mekanizmalar hakkında içgörüler sağlamak için benzersiz bir şekilde konumlandırılmıştır, çünkü H atomları kimyalarının merkezindedir. Nötronlar tarafından indüklenen radyasyon hasarının olmaması, onları metalloproteinlerin çalışmasına son derece uygun bir prob haline getirir37. Burada, numune hazırlamadan veri toplama, arıtma ve analize kadar nötron protein kırınımı sürecinin temsili bir örneğini sunuyoruz (Şekil 1). Metalloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D) nötron kırınım deneyleri için yeterli büyüklükte kristaller yetiştirilmiştir. Nc LPMO9D, glikosidik bağda oksijen atomu yerleştirilmesi ile recalcitrant selülozun bozulmasında rol oynayan bakır içeren bir metalloproteindir38,39. NcLPMO9D aktif bölgesi, N-terminal histidin ve ikinci bir korunmuş histidinden oluşan karakteristik bir "histidin-ayraç" içinde mononükleer bakır merkezi içerir (Ek Şekil 3)40. Mantar LPMO'larının N terminali metillenmiştir, ancak geçiş sonrası modifikasyon mayadaki rekombinant ekspresyoz sırasında gerçekleşmez. NcLPMO9D dinlenme durumunda, bakır merkezi Cu2 + oksidasyon durumunda bulunur ve Cu1+ için tek elektron azaltımı ile aktive edilir, moleküler oksijenin hızla bir süperoksit türüne indirgenerek bağlanmasına ve aktive edilmesine izin verir41,42. Genel NcLPMO9D reaksiyonu, hidroksillenmiş polisakkarit ürününü oluşturmak için bir elektron ve iki protonun daha fazla eklenmesini gerektirir43. Polisakkarit substratından hidrojen atom soyutlamasından (HAA) sorumlu aktif oksijen türlerinin kimliği tespit edilememiş diriltilmiş diri dırı dırım ve yoğun yapısal ve hesaplamalı çalışmalar halen devam etmektedir44,45. NcLPMO9D aktif sahasındaki redoks kimyası göz önüne alındığında, radyasyon hasarının azaltılması özellikle önemlidir. NcLPMO9D yapısını sırasıyla 46'da, dinlenme durumunda ve etkinleştirilmiş azaltılmış formda belirlemek için NcLPMO9D kristallerinde oda sıcaklığını ve kriyo sıcaklığı veri toplamayı burada gösteriyoruz. Protein kristal montajına, veri toplama için beamline enstrüman kurulumuna, verilerin ve koordinat dosyalarının hazırlanmasına ve tamamen atomlu bir nötron yapısını modellemek için gerekli iyileştirme adımlarına vurgu yapılacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td>
			<td>DiaDent/DiaVet</td>
			<td>218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary wax</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.0.077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Version 0.8.9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalCap ALS</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-Tip Forceps</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>TW-CTF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &#181;m</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M5-L18SP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30266626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>M-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four Color Mounting Clay</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (T),</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td>
			<td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td>
			<td>XtaLAB Synergy-R</td>
			<td>Home source X-ray diffractometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Wand Straight</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &#8211; 20 &#181;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &#215; 96 pcs.)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.14-3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Tong 18 mm</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 0.1-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 10-100 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 20-200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR6-146</td>
			<td>Thin-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>GB-B3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>CV1012</td>
			<td>Thick-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich Box with cover</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax pen</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

Nötron kristalografisi, biyolojik makromoleküller içindeki hidrojen atomu konumlarının belirlenmesine izin veren, radyasyon hasarına neden olmazken protonasyon ve hidrasyon durumları hakkında mekanistik olarak önemli bilgiler veren yapısal bir tekniktir. Buna karşılık X-ışını kırınımı, ışık atomlarının konumu hakkında sadece sınırlı bilgi sağlar ve X-ışını ışını, ışığa duyarlı kofaktörlerin ve metal merkezlerin radyasyon hasarına neden olur. Burada sunulan, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'ndaki (ORNL) IMAGINE ve MaNDi kiriş hatları için uygun boyutta bir protein kristali (> 0,1 mm3) yetiştirildikten sonra nötron kırınım yapısı elde etmek için kullanılan iş akışıdır. Nötron kırınım verisi toplanması için hidrojenize protein kristallerinin kuvars kılcal damarlara montesini gösteriyoruz. Ayrıca, döteryum ile değiştirilebilir sahalarda hidrojen atomlarının değiştirilmesini sağlamak için D2O içeren tampon ile monte edilmiş kristallerin buhar değişim süreci de sunulmaktadır. Döteryumun birleştirilmesi, hidrojen atomlarının tutarsız saçılımından kaynaklanan arka planı azaltır ve negatif tutarlı saçılma uzunluklarının neden olduğu yoğunluk iptalini önler. Örnek hizalama ve oda sıcaklığı veri toplama stratejileri, Yüksek Akı Izotop Reaktörü'ndeki (HFIR) IMAGINE'de quasi-Laue veri toplama kullanılarak gösterilmiştir. Ayrıca, kristal montajı ve sıvı nitrojende hızlı donma, laboratuvar reaksiyonu aralarını hapsetmek için kriyo-veri toplama, Spallation Nötron Kaynağı'ndaki (SNS) MaNDi uçuş zamanı cihazında gösterilmiştir. Model koordinat ve kırınım veri dosyalarının hazırlanması ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) haritalarının görselleştirilmesi de ele alınacaktır. İlgi çekici proteinin tamamen atom yapısını elde etmek için sadece nötron verilerine veya ortak X-ışını/nötron verilerine karşı yapı iyileştirmesi nihayet tartışılacaktır. Nötron yapısının belirlenmesi süreci, glikosidik bağın oksidatif bölünmesi yoluyla recalcitrant polisakkaritlerin bozulmasında rol oynayan bakır içeren bir metalloprotein olan litik polisakkarit monooksijenaz Neurospora crassa LPMO9D kristalleri kullanılarak gösterilecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures at JoVE.com

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

Nötron proteini kristalografisi, hidrojen atomlarının lokalizasyonuna izin veren ve böylece protein fonksiyonunun önemli mekanistik ayrıntılarını sağlayan yapısal bir tekniktir. Burada bir protein kristali montajı için iş akışını sunuyoruz, nötron kırınım veri toplama, yapı iyileştirme ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritalarının analizi.

Protein Yapılarında Hidrojen Atomlarının Modellenmesi için Nötron Kristalografisi Veri Toplama ve İşleme

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Reaktif Gözenekli Malzemelerin Saflaştırılması Süperkritik Azot İşleme

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

Küçük açılı Nötron Saçılma tarafından Thermo-geri dönüşümlü Blok Kopolimer ve Karakterizasyonu Tek duvarlı Karbon Nanotüpler işlevselleştirilmesi

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Koruma Bilimi X-ışını Toz Kırınım: Miras Sanat Objects Korozyon Ürünleri Rutin Kristal Yapı Tayini Doğru

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Son derece kararlı, Fonksiyonel Tüylü Nanoparçacıklar ve Ahşap Elyaf Biyopolimerler: Sürdürülebilir Nanoteknoloji Doğru

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

Mikroyerçekimi Ortamında Verimli Güneş HidrojenI Üretimi Için Deneysel Yöntemler

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...

Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

Karbon Nanotüp Üzerinde Katkılı Co ve N Atomları ile Desteklenen Metal Nanopartiküllerin Sentezi ve Hidrojen Üretiminde Katalitik Uygulamaları

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...

Hydrogen Production and Utilization in a Membrane Reactor

Bir Membran Reaktöründe Hidrojen Üretimi ve Kullanımı

Industrial hydrogenation consumes ~11 Mt of fossil-derived H2 gas yearly. Our group invented a membrane reactor to bypass the need to use H2 gas for ...