Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

تلقينا مساعدة فنية من مرفق البوليمرات الحيوية في كلية الطب بجامعة هارفارد للمحلل الحيوي. تم دعم هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد RG-1707-28516 (H.L.W. و S.L.).

تمت الموافقة على جميع الطرق التي تنطوي على البحث الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في مستشفى بريغهام والنساء ، كلية الطب بجامعة هارفارد.
تتوافق جميع الطرق التي تتضمن موضوعات البحث البشري الموضحة هنا مع الإرشادات التي وضعتها لجنة الأبحاث ال...

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

من المهم استخدام تقنية خالية من RNase لمنع تلوث RNase أثناء العزل7. بعد الطرد المركزي وتشكيل الطور البيني المضغوط ، من المهم تجنب الطور البيني والمرحلة السفلية وملوث الجسيمات العائم على قمة الطور المائي عند استعادة المرحلة المائية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة خطوتين للغسيل بمحلو?...

يتم التعرف على الحمض النووي الريبي خارج الخلية كعامل مهم يتوسط العديد من العمليات البيولوجية1. تم الإبلاغ عن الحمض النووي الريبي خارج الخلية في البراز لأول مرة في عام 2008 كعلامة لسرطان القولون والتهاب القولون التقرحيالنشط 2 ، وتم الكشف عنه مؤخرا كمكون طبيعي لتجويف الأمعاء والبراز ويتوسط اتصالات ميكروب المضيف3،4،5. الغرض من بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي هذا هو استخراج الحمض النووي الريبي خارج الخلية عالي الجودة من عينات البراز التي تم جمعها من الحيوانات والبشر. تم تكييف البروتوكول من مجموعة عزل miRNA التجارية. يتم استخدام الحمض النووي الريبي المكتسب لتحليلات المصب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. يتضمن البروتوكول العديد من النصائح المهمة والمفيدة لتعظيم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي الموجود في براز الحيوانات والبشر. السبب في تطوير وتحسين هذه الطريقة لعزل الحمض النووي الريبي (بما في ذلك microRNA) هو تقليل الحمض النووي الريبي الميكروبي في البراز ، والحد من المتغيرات في الدراسات البحثية وتحليل تكوين الحمض النووي الريبي في الأمعاء دون حساب مختلف العوامل المربكة ومصادر التلوث. تجدر الإشارة إلى أن عزل الحمض النووي الريبي هذا يقلل من إطلاق الحمض النووي الريبي من الخلايا الحية والميكروبات الحية (الحمض النووي الريبي الخلوي). وهو يركز على الحمض النووي الريبي خارج الخلية التي تم إطلاقها بواسطة خلايا الأمعاء أو تم الحصول عليها عن طريق تناول الطعام. بشكل أساسي ، هذه الطريقة ليست مناسبة للدراسات التي يتم فيها فحص النسخ الميكروبي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

أصبح من الواضح أن الحمض النووي الريبي موجود في تجويف الأمعاء والبراز في الحيوانات والبشر. يعزل البروتوكول الموصوف أدناه إجمالي الحمض النووي الريبي بما في ذلك الحمض النووي الريبي الميكروي من عينات البراز من الحيوانات والبشر. الهدف هو عزل الحمض النووي الريبي الكلي بنقاوة وكمية عالية للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول الأمثل في عزل miRNA في قدرات عزل منتجات الحمض النووي الريبي عالية النقاء مع خطوات غسيل إضافية موصوفة ، وزيادة كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بطريقة محسنة في إعادة تعليق العينة ، ونصائح مهمة لإزالة التلوث. أحد القيود هو عدم القدرة على معالجة وتنقية عينة أكبر من أكثر من 200 ملغ لأن أحجام العينات هذه قد تسبب صعوبة في التكوين الواضح للطور البيني. وبالتالي ، فإن حجم العينة الكبير قد يلوث المرحلة المائية المراد استخراجها كما هو موضح في البروتوكول مع المواد العضوية التي تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي المعزول في النهاية. ومع ذلك ، فإن عزلات الحمض النووي الريبي من عينة تصل إلى 200 ملغ كافية لمعظم التحليلات النهائية.

تم عزل الحمض النووي الريبي التمثيلي من عينات براز الفئران 50 ملغ (2 كريات براز الفئران) و 100 ملغ من عينات البراز البشري على التوالي واستخلصت في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. يشير تحليل مقياس الطيف الضوئي للتركيز إلى عزل كمية إجمالية قدرها 49 ميكروغرام و 16 ميكروغرام من الحمض النووي ...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

يعزل هذا البروتوكول الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من عينات البراز من الحيوانات والبشر. يتم استخدام مجموعة عزل miRNA التجارية مع تكيف كبير لعزل الحمض النووي الريبي النقي بكمية وجودة محسنة. تعتبر عزلات الحمض النووي الريبي جيدة لمعظم فحوصات الحمض النووي الريبي النهائية مثل التسلسل والمصفوفات الدقيقة و RT-PCR.

البراز (الصغير) عزل الحمض النووي الريبي

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fecal (micro) RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

التدخل في الحمض النووي الريبي القراد

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

في الوقت الحقيقي مهتز الناجمة عن تحويل الفحص للكشف عن البريونات CWD في المواد البرازية

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

أساليب الثقافة لتحديد الحد من الكشف والبقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام النقل من Campylobacter Jejuni في عينات البراز البشري

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

تحت إشراف التعلم الآلي من أجل تحديد شبه كمي للحمض النووي خارج الخلية في التهاب الجلوميرولونية

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

التقييم العلاجي لزرع الميكروبات البرازية في نموذج فأر ناقص إنترلوكين 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...