Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

We kregen technische assistentie van de Biopolymers Facility aan de Harvard Medical School voor bioanalyzer. Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society onderzoeksbeurs RG-1707-28516 (H.L.W. en S.L.).

Alle methoden met onderzoeksdieren die hier worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.
Alle methoden met menselijke proefpersonen die hier worden beschreven, zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Partners Human Research Committee.
1. Verzameling fecale monsters
<ol><li>Autoclaaf of bereid een steriele en nucleasevrije 2 m...

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Het is belangrijk om RNase-vrije techniek te gebruiken om RNase-besmetting tijdens de isolatie te voorkomen7. Na centrifugatie en de vorming van een compacte interfase is het belangrijk om de interfase, de onderste fase en de deeltjesverontreiniging die op de top van de waterige fase zweven te vermijden bij het herstellen van de waterige fase. Daarnaast worden twee wasstappen met 500 μL en 250 μL Wash Solution 2/3 toegevoegd om verontreinigingen in het filtermembraan te verwijderen voor een opti...

Extracellulair RNA wordt erkend als een belangrijke factor die veel biologische processen bemiddelt1. Extracellulair RNA in de ontlasting werd voor het eerst gemeld in 2008 als een marker voor darmkanker en actieve colitis ulcerosa2, en het werd onlangs onthuld als een normaal onderdeel van het darmlumen en de ontlasting en bemiddelt gastheer-microbe communicatie 3,4,5. Het doel van dit RNA-isolatieprotocol is om extracellulair RNA van hoge kwaliteit te extraheren uit fecale monsters die zijn verzameld van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het protocol is aangepast van een commerciële miRNA Isolation Kit. Het verkregen RNA wordt gebruikt voor downstream-analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. Het protocol bevat verschillende belangrijke en nuttige tips om de kwantiteit en kwaliteit van RNA in de ontlasting van dieren en mensen te maximaliseren. De reden om deze methode van RNA (inclusief microRNA) isolatie te ontwikkelen en te optimaliseren, is om microbieel RNA in de ontlasting te verminderen, de variabelen in de onderzoeksstudies te beperken en de RNA-samenstelling in de darm te analyseren zonder rekening te houden met verschillende verstorende factoren en bronnen van besmetting. Van belang is dat deze RNA-isolatie de afgifte van RNA uit levende cellen en levende microben (cellulair RNA) minimaliseert. Het richt zich op extracellulaire RNA's die zijn vrijgegeven door darmcellen of zijn verkregen via voedselinname. In principe is deze methode niet geschikt voor studies waarbij het microbiële transcriptoom wordt onderzocht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Het wordt duidelijk dat RNA voorkomt in het darmlumen en uitwerpselen bij dieren en mensen. Het hieronder beschreven protocol isoleert totaal RNA inclusief microRNA's uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het doel is om totaal RNA met een hoge zuiverheid en hoeveelheid te isoleren voor downstream analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. De voordelen van dit geoptimaliseerde protocol in de miRNA-isolatie zijn mogelijkheden om sterk gezuiverde RNA-producten te isoleren met extra wasstappen beschreven, verhoogde hoeveelheid RNA verkregen met een verbeterde methode in de resuspensie van monster en belangrijke tips voor decontaminatie. Een beperking is het onvermogen om grotere monsters van meer dan 200 mg te verwerken en te zuiveren, omdat deze steekproefgroottes een probleem zouden veroorzaken bij de duidelijke vorming van de interfase. Bijgevolg kan de grote monstergrootte de te extraheren waterige fase zoals beschreven in het protocol verontreinigen met organische stoffen die uiteindelijk de kwaliteit van het geïsoleerde RNA beïnvloeden. RNA-isolaten uit een monster van maximaal 200 mg zijn echter voldoende voor de meeste downstream-analyses.

Representatieve RNA's werden geïsoleerd uit respectievelijk 50 mg muis fecale monsters (2 muis fecale pellets) en 100 mg menselijke ontlastingsmonsters en geëlueerd in 50 μL nucleasevrij water. Spectrofotometeranalyse van de concentratie suggereert dat een totale hoeveelheid van respectievelijk 49 μg en 16 μg RNA werd geïsoleerd (tabel 1). De RNA-zuiverheid was hoog zoals aangegeven door een A260/A280-verhouding van ~2,0 en een A260/A230-verhouding van ~1,8 (tabel 1). Zoals gemeld<...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

Dit protocol isoleert totaal RNA van hoge kwaliteit uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Een commerciële miRNA-isolatiekit wordt gebruikt met aanzienlijke aanpassing om zuiver RNA te isoleren met geoptimaliseerde kwantiteit en kwaliteit. De RNA-isolaten zijn goed voor de meeste downstream RNA-assays zoals sequencing, micro-array en RT-PCR.

Fecale (micro) RNA-isolatie

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fecal (micro) RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

RNA-interferentie in teken

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Isolatie van RNA Pseudomonas aeruginosa Kolonisatie van de muizen Maagdarmkanaal

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Elektroforese (NAAM) Assay Hiermee kan de snelle identificatie van HIV-1 nucleocapsid Remmers

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Cultuurmethoden om de limiet van detectie en overleving in transportmedia van Campylobacter Jejuni in menselijke fecale specimens te bepalen

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

Therapeutische evaluatie van fecale microbiotatransplantatie in een interleukine 10-deficiënt muismodel

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...