Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Nous avons reçu une assistance technique de l’installation de biopolymères de la Harvard Medical School pour le bioanalyseur. Ce travail a été soutenu par la subvention de recherche RG-1707-28516 (H.L.W. et S.L.) de la National Multiple Sclerosis Society.

Toutes les méthodes impliquant des animaux de recherche décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Brigham and Women’s Hospital de la Harvard Medical School.
Toutes les méthodes impliquant des sujets de recherche humains décrites ici sont conformes aux lignes directrices établies par le Comité de recherche humaine des partenaires.
1. Prélèvement d’échantillons fécaux
<ol><li>Autoclaver ou prépar...

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Il est important d’utiliser une technique sans RNase pour prévenir la contamination par la RNase pendant l’isolement7. Après la centrifugation et la formation d’une interphase compacte, il est essentiel d’éviter l’interphase, la phase inférieure et le contaminant particulaire flottant au-dessus de la phase aqueuse lors de la récupération de la phase aqueuse. De plus, deux étapes de lavage avec 500 μL et 250 μL Wash Solution 2/3 sont ajoutées pour éliminer les contaminants dans...

L’ARN extracellulaire est de plus en plus reconnu comme un facteur important qui médie de nombreux processus biologiques1. L’ARN extracellulaire dans les matières fécales a été signalé pour la première fois en 2008 en tant que marqueur du cancer du côlon et de la colite ulcéreuse active2, et il a récemment été révélé comme un composant normal de la lumière intestinale et des matières fécales et médie les communications hôte-microbe 3,4,5. Le but de ce protocole d’isolement d’ARN est d’extraire de l’ARN extracellulaire de haute qualité à partir d’échantillons fécaux prélevés sur des sujets animaux et humains. Le protocole a été adapté à partir d’un kit commercial d’isolation de miARN. L’ARN acquis est utilisé pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et la micro-matrice. Le protocole comprend plusieurs conseils importants et utiles pour maximiser la quantité et la qualité de l’ARN présent dans les excréments des animaux et des humains. La raison de développer et d’optimiser cette méthode d’isolement de l’ARN (y compris les microARN) est de diminuer l’ARN microbien dans les fèces, de limiter les variables dans les études de recherche et d’analyser la composition de l’ARN dans l’intestin sans tenir compte des divers facteurs de confusion et sources de contamination. Il convient de noter que cet isolement d’ARN minimise la libération d’ARN par les cellules vivantes et les microbes vivants (ARN cellulaire). Il se concentre sur les ARN extracellulaires qui ont été libérés par les cellules intestinales ou ont été acquis par la prise alimentaire. Principalement, cette méthode ne convient pas aux études où le transcriptome microbien est étudié.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Il devient clair que l’ARN existe dans la lumière intestinale et les matières fécales chez les animaux et les humains. Le protocole décrit ci-dessous isole l’ARN total, y compris les microARN, provenant d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. L’objectif est d’isoler l’ARN total avec une pureté et une quantité élevées pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et les micro-réseaux. Les avantages de ce protocole optimisé dans l’isolement des miARN sont la capacité d’isoler des produits d’ARN hautement purifiés avec des étapes de lavage supplémentaires décrites, une quantité accrue d’ARN obtenue avec une méthode améliorée de remise en suspension de l’échantillon et des pointes importantes de décontamination. Une limitation est l’incapacité de traiter et de purifier un échantillon plus grand de plus de 200 mg, car ces tailles d’échantillon causeraient une difficulté dans la formation claire de l’interphase. Par conséquent, la grande taille de l’échantillon peut contaminer la phase aqueuse à extraire comme décrit dans le protocole avec des matières organiques qui affectent la qualité de l’ARN isolé à la fin. Cependant, les isolats d’ARN provenant d’un échantillon allant jusqu’à 200 mg sont suffisants pour la plupart des analyses en aval.

Des ARN représentatifs ont été isolés à partir d’échantillons fécaux de souris de 50 mg (2 granulés fécaux de souris) et de 100 mg d’échantillons de selles humaines respectivement et élués dans de l’eau exempte de nucléases de 50 μL. L’analyse spectrophotométrique de la concentration suggère qu’une quantité totale de 49 μg et 16 μg d’ARN ont été isolées respectivement (tableau 1). La pureté de l’ARN était élevée, comme l’indiquent un rapport A260/A280 de ~2,0 et ...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

Ce protocole isole l’ARN total de haute qualité à partir d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. Un kit commercial d’isolation de miARN est utilisé avec une adaptation significative pour isoler l’ARN pur avec une quantité et une qualité optimisées. Les isolats d’ARN sont bons pour la plupart des tests d’ARN en aval tels que le séquençage, les micro-réseaux et la RT-PCR.

Isolement de l’ARN fécal (micro)

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

We present a protocol for isolating RNA from fecal samples to study microRNAs. This protocol can be used to isolate RNA from feces with high quality and quantity. It minimizes RNAs from living microbes.It is important to emphasize that and the binding buffer is not used in this protocol. This protocol is simple and straightforward. Begin by resuspending 25 to 100 milligrams of fecal samples in 600 microliters of sterile 1X DPBS in a two-milliliter microcentrifuge tube.Incubate the tube containing the sample at room temperature for 30 minutes. Then mash the mixture with a one milliliter pipette tip and vortex well. Resuspend the mixture in a homogenizer with a setting for one cycle at 4, 000 rotations per minute for 45 seconds to optimize and increase the quantity and quality of RNA.Add 600 microliters of acid phenol chloroform solution to the sample and vortex the mixture for 60 seconds. Alternatively, to optimize an increased quantity of RNA in the yield, mix it with a homogenizer. Centrifuge the sample for 15 minutes at 10, 000 x g at room temperature to separate the aqueous and organic phase.Repeat the centrifugation until the interface is compact. Transfer the upper aqueous phase carefully without disturbing the lower phase to a new two milliliter microcentrifuge tube with a hinge cap. Add ACS grade 100%ethanol at 1.25 x the volume of the acquired aqueous phase and vortex for three seconds.Place the filter cartridge into the collection tubes. Load 600 microliters of each of the samples in the filter cartridge provided in the microRNA isolation kit. Centrifuge at 10, 000 x g for 90 seconds to filter the mixture through the cartridge.Then discard the filtrate. Repeat this until the entire volume of the mixture is filtered through the same filter membrane in successive applications. After all the sample is filtered.add 700 microliters of microRNA wash solution 1 into the same filter cartridge. Centrifuge for 60 seconds to filter the wash solution through the filter cartridge. Discard the filtrate and place the filter cartridge on the same collection tube.Wash the filter cartridge with 700 microliters of wash solution 2/3 prepared in ACS grade 100%ethanol and centrifuge at 10, 000 x g for a minute. Discard the obtained filtrate and place the filter cartridge into the same tube. Wash the filter cartridge with 500 microliters of wash solution 2/3 and centrifuge at 10, 000 x g for a minute.Discard the obtained filtrate and place the filter cartridge into the same collection tube. Wash the filter cartridge with 250 microliters of wash solution 2/3 prepared in ACS grade 100%ethanol and centrifuge at 10, 000 x g for a minute. Discard the obtained filtrate and place the filter cartridge into the same collection tube.Finally, transfer the filter cartridge into a new collection tube and spin the assembly for five minutes to remove the residual fluid. Transfer the filter cartridge into a new collection tube then add 50 microliters of nuclease-free water to the center of the filter and cap the tube. Incubate the tube at room temperature for 10 minutes.Then spin the tube for five minutes at 8, 000 x g to recover the RNA into a new collection tube. A chip-based electrophoresis assay of RNA suggests that representative RNA isolates from mouse and human feces are low in or lack of 18S and 28S rRNA compositions and the size of RNA isolates falls in the small RNA region. A further small RNA electrophoresis with the chip-based electrophoresis revealed that a large portion of the RNAs are of microRNA size.The purity of the extracted RNA was high as indicated by the absorbance ratio of 2.0 for 260 and 280-nanometer wavelengths and 1.8 ratio value for absorbance at 260 and 230 nanometers. To ensure success of the organic extraction, make sure that the faces are obvious and only transfer the upper aqueous phase without disturbing the lower phase, even at the cost of a reduced volume of our aqueous phase.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fecal (micro) RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

ARN interférence dans les tiques

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

En temps réel Quaking induite par le test de Conversion pour détection de CWD Prions dans les matières fécales

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

Un modèle de culture de lots in vitro pour estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Méthodes de culture pour déterminer la limite de détection et de survie dans les médias de transport de Campylobacter Jejuni dans les spécimens fécals humains

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l’ADN extracellulaire dans la glomerulonephrite

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...