Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Abbiamo ricevuto assistenza tecnica dalla Biopolymers Facility della Harvard Medical School per il bioanalizzatore. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di ricerca della National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. e S.L.).

Tutti i metodi che coinvolgono animali da ricerca qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.
Tutti i metodi che coinvolgono soggetti di ricerca umana qui descritti sono conformi alle linee guida stabilite dal Comitato di ricerca umana dei partner.
1. Raccolta di campioni fecali
<ol><li>Autoclavare o preparare una provetta da microcentrifuga sterile e priva di...

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

È importante utilizzare una tecnica priva di RNasi per prevenire la contaminazione da RNasi durante l'isolamento7. Dopo la centrifugazione e la formazione di un'interfase compatta, è fondamentale evitare l'interfase, la fase inferiore e il contaminante particellare che galleggia sulla parte superiore della fase acquosa durante il recupero della fase acquosa. Inoltre, vengono aggiunte due fasi di lavaggio con 500 μL e 250 μL Wash Solution 2/3 per eliminare i contaminanti nella membrana del filt...

L'RNA extracellulare viene riconosciuto come un fattore significativo che media molti processi biologici1. L'RNA extracellulare nelle feci è stato segnalato per la prima volta nel 2008 come marker per il cancro del colon e la colite ulcerosa attiva2, ed è stato recentemente rivelato come un componente normale del lume intestinale e delle feci e media le comunicazioni ospite-microbo 3,4,5. Lo scopo di questo protocollo di isolamento dell'RNA è quello di estrarre RNA extracellulare di alta qualità da campioni fecali raccolti da soggetti animali e umani. Il protocollo è stato adattato da un kit commerciale di isolamento miRNA. L'RNA acquisito viene utilizzato per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA, RT-PCR e micro-array. Il protocollo include diversi suggerimenti importanti e utili per massimizzare la quantità e la qualità dell'RNA presente nelle feci di animali e umani. La ragione per sviluppare e ottimizzare questo metodo di isolamento dell'RNA (incluso il microRNA) è diminuire l'RNA microbico nelle feci, limitare le variabili negli studi di ricerca e analizzare la composizione dell'RNA nell'intestino senza tenere conto di vari fattori confondenti e fonti di contaminazione. Da notare, questo isolamento dell'RNA riduce al minimo il rilascio di RNA dalle cellule viventi e dai microbi viventi (RNA cellulare). Si concentra sugli RNA extracellulari che sono stati rilasciati dalle cellule intestinali o sono stati acquisiti attraverso l'assunzione di cibo. Principalmente, questo metodo non è adatto per studi in cui viene studiato il trascrittoma microbico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Sta diventando chiaro che l'RNA esiste nel lume intestinale e nelle feci negli animali e negli esseri umani. Il protocollo descritto di seguito isola l'RNA totale, compresi i microRNA, da campioni fecali di soggetti animali e umani. L'obiettivo è quello di isolare l'RNA totale con elevata purezza e quantità per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA, RT-PCR e micro-array. I vantaggi di questo protocollo ottimizzato nell'isolamento dei miRNA sono la capacità di isolare prodotti di RNA altamente purificati con ulteriori fasi di lavaggio descritte, una maggiore quantità di RNA ottenuta con un metodo migliorato nella risospensione del campione e importanti suggerimenti di decontaminazione. Una limitazione è l'incapacità di elaborare e purificare campioni più grandi di oltre 200 mg in quanto queste dimensioni del campione causerebbero una difficoltà nella chiara formazione dell'interfase. Di conseguenza, le grandi dimensioni del campione possono contaminare la fase acquosa da estrarre come descritto nel protocollo con sostanze organiche che influenzano la qualità dell'RNA isolato alla fine. Tuttavia, gli isolati di RNA da un campione fino a 200 mg sono sufficienti per la maggior parte delle analisi a valle.

Gli RNA rappresentativi sono stati isolati rispettivamente da campioni fecali di topo da 50 mg (2 pellet fecali di topo) e campioni di feci umane da 100 mg ed eluiti in acqua priva di nucleasi da 50 μL. L'analisi spettrofotometrica della concentrazione suggerisce che una quantità totale di 49 μg e 16 μg di RNA sono stati isolati rispettivamente (Tabella 1). La purezza dell'RNA era elevata, come indicato da un rapporto A260/A280 di ~2,0 e un rapporto A260/A230 di ~1,8 (Tabella 1). Com...

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Fecal micro RNA Isolation

Questo protocollo isola l'RNA totale di alta qualità da campioni fecali di soggetti animali e umani. Un kit commerciale di isolamento dei miRNA viene utilizzato con un adattamento significativo per isolare l'RNA puro con quantità e qualità ottimizzate. Gli isolati di RNA sono buoni per la maggior parte dei saggi di RNA a valle come sequenziamento, micro-array e RT-PCR.

Isolamento fecale (micro) RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fecal (micro) RNA Isolation

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RNA interferenza nelle zecche

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Ricerca

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RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

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Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

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The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

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Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

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Valutazione terapeutica del trapianto di microbiota fecale in un modello murino carente di interleuchina 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...