Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00
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Recibimos asistencia técnica de la Instalación de Biopolímeros de la Escuela de Medicina de Harvard para el bioanalizador. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple RG-1707-28516 (H.L.W. y SL).

Todos los métodos que involucran animales de investigación descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Brigham and Women's, Escuela de Medicina de Harvard.
Todos los métodos que involucran sujetos de investigación humanos descritos aquí están de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Investigación Humana de Partners.
1. Recogida de muestras fecales
<ol><li>Autoclave o prepa...

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Es importante utilizar la técnica libre de RNasa para prevenir la contaminación por RNasa durante el aislamiento7. Después de la centrifugación y la formación de una interfase compacta, es clave evitar la interfase, la fase inferior y el contaminante de partículas flotando en la parte superior de la fase acuosa al recuperar la fase acuosa. Además, se agregan dos pasos de lavado con solución de lavado 2/3 de 500 μL y 250 μL para eliminar los contaminantes en la membrana del filtro y optim...

El ARN extracelular está siendo reconocido como un factor significativo que media muchos procesos biológicos1. El ARN extracelular en las heces fue reportado por primera vez en 2008 como un marcador de cáncer de colon y colitis ulcerosa activa2, y recientemente se reveló como un componente normal de la luz intestinal y las heces y media las comunicaciones huésped-microbio 3,4,5. El propósito de este protocolo de aislamiento de ARN es extraer ARN extracelular de alta calidad de muestras fecales recolectadas de sujetos animales y humanos. El protocolo fue adaptado de un kit de aislamiento de miARN comercial. El ARN adquirido se utiliza para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarrays. El protocolo incluye varios consejos importantes y útiles para maximizar la cantidad y calidad del ARN que se encuentra en las heces de animales y humanos. La razón para desarrollar y optimizar este método de aislamiento de ARN (incluido el microARN) es disminuir el ARN microbiano en las heces, limitar las variables en los estudios de investigación y analizar la composición del ARN en el intestino sin tener en cuenta varios factores de confusión y fuentes de contaminación. Cabe destacar que este aislamiento de ARN minimiza la liberación de ARN de células vivas y microbios vivos (ARN celular). Se centra en los ARN extracelulares que han sido liberados por las células intestinales o han sido adquiridos a través de la ingesta de alimentos. Principalmente, este método no es adecuado para estudios donde se investiga el transcriptoma microbiano.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Cada vez está más claro que el ARN existe en la luz intestinal y las heces en animales y humanos. El protocolo descrito a continuación aísla el ARN total, incluidos los microARN, de muestras fecales de sujetos animales y humanos. El objetivo es aislar el ARN total con alta pureza y cantidad para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarray. Las ventajas de este protocolo optimizado en el aislamiento de miARN son la capacidad de aislar productos de ARN altamente purificados con pasos de lavado adicionales descritos, una mayor cantidad de ARN obtenida con un método mejorado en la resuspensión de la muestra y consejos importantes de descontaminación. Una limitación es la incapacidad de procesar y purificar muestras más grandes de más de 200 mg, ya que estos tamaños de muestra causarían una dificultad en la formación clara de la interfase. En consecuencia, el gran tamaño de la muestra puede contaminar la fase acuosa a extraer como se describe en el protocolo con materias orgánicas que afectan la calidad del ARN aislado al final. Sin embargo, los aislados de ARN de una muestra de hasta 200 mg son suficientes para la mayoría de los análisis posteriores.

Se aislaron ARN representativos de muestras fecales de ratón de 50 mg (2 gránulos fecales de ratón) y 100 mg de muestras de heces humanas respectivamente y se eluyeron en agua libre de nucleasas de 50 μL. El análisis espectrofotómetro de la concentración sugiere que se aisló una cantidad total de 49 μg y 16 μg de ARN respectivamente (Tabla 1). La pureza del ARN fue alta como lo indica una relación A260 / A280 de ~ 2.0 y una relación A260 / A230 de ~ 1.8 (Tabla 1). Como se inf...

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Fecal micro RNA Isolation

Este protocolo aísla ARN total de alta calidad de muestras fecales de sujetos animales y humanos. Se utiliza un kit de aislamiento de miARN comercial con una adaptación significativa para aislar ARN puro con cantidad y calidad optimizadas. Los aislados de ARN son buenos para la mayoría de los ensayos de ARN aguas abajo, como la secuenciación, la micromatriz y la RT-PCR.

Aislamiento de (micro) ARN fecal

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fecal (micro) RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

La interferencia de ARN en las garrapatas

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

El aislamiento de las variantes de los virus de ARN de fidelidad y caracterización de la frecuencia de mutación de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Métodos de cultivo para determinar el límite de detección y supervivencia en los medios de transporte de Campylobacter Jejuni en especímenes fecales humanos

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Aprendizaje automático supervisado para la semi-cuantificación del ADN extracelular en glomerulonefritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

Evaluación terapéutica del trasplante de microbiota fecal en un modelo de ratón deficiente en interleucina 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...