Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Vi fick teknisk hjälp från Biopolymers Facility vid Harvard Medical School för bioanalysator. Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society forskningsanslag RG-1707-28516 (H.L.W. och S.L.).

Alla metoder som involverar försöksdjur som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.
Alla metoder som involverar mänskliga forskningsämnen som beskrivs här är i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Partners Human Research Committee.
1. Fekal provsamling
<ol><li>Autoklav eller förbered ett sterilt och nukleasfritt 2 ml mikrocentrifugrör med ett skru...

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Det är viktigt att använda RNas-fri teknik för att förhindra RNas-kontaminering under isoleringen7. Efter centrifugering och bildandet av en kompakt interfas är det viktigt att undvika interfas, lägre fas och partikelföroreningen som flyter på toppen av vattenfasen när man återvinner vattenfasen. Dessutom tillsätts två tvättsteg med 500 μL och 250 μL Tvättlösning 2/3 för att eliminera föroreningar i filtermembranet för optimerad kvalitet. Dessutom rekommenderas inte ett startpr...

Extracellulärt RNA blir erkänt som en viktig faktor som förmedlar många biologiska processer1. Extracellulärt RNA i avföring rapporterades först 2008 som en markör för tjocktarmscancer och aktiv ulcerös kolit2, och det avslöjades nyligen som en normal komponent i tarmlumen och avföring och förmedlar värd-mikrobkommunikation 3,4,5. Syftet med detta RNA-isoleringsprotokoll är att extrahera extracellulärt RNA av hög kvalitet från fekala prover som samlats in från djur och människor. Protokollet anpassades från ett kommersiellt miRNA Isolation Kit. Det förvärvade RNA används för nedströmsanalyser såsom RNA-sekvensering, RT-PCR och mikromatris. Protokollet innehåller flera viktiga och användbara tips för att maximera kvantiteten och kvaliteten på RNA som finns i avföring från djur och människor. Anledningen till att utveckla och optimera denna metod för RNA -isolering (inklusive mikroRNA) är att minska mikrobiellt RNA i avföringen, begränsa variablerna i forskningsstudierna och analysera RNA -kompositionen i tarmen utan att redovisa olika förvirrande faktorer och föroreningskällor. Observera att denna RNA-isolering minimerar frisättningen av RNA från levande celler och levande mikrober (cellulärt RNA). Det fokuserar på extracellulära RNA som har släppts av tarmceller eller förvärvats via matintag. I huvudsak är denna metod inte lämplig för studier där det mikrobiella transkriptomet undersöks.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Det blir tydligt att RNA finns i tarmlumen och avföring hos djur och människor. Protokollet som beskrivs nedan isolerar totalt RNA inklusive mikroRNA från fekala prover av djur och människor. Målet är att isolera totalt RNA med hög renhet och kvantitet för nedströmsanalyser såsom RNA-sekvensering, RT-PCR och mikromatris. Fördelarna med detta optimerade protokoll i miRNA-isoleringen är förmågan att isolera högrenade RNA-produkter med ytterligare tvättsteg beskrivna, ökad mängd RNA erhållen med en förbättrad metod vid resuspension av prov och viktiga tips för dekontaminering. En begränsning är oförmågan att bearbeta och rena större prov på mer än 200 mg eftersom dessa provstorlekar skulle orsaka svårigheter vid klar bildning av interfasen. Följaktligen kan den stora provstorleken förorena den vattenfas som ska extraheras enligt beskrivningen i protokollet med organiska ämnen som påverkar kvaliteten på RNA som isoleras i slutändan. RNA-isolat från ett prov på upp till 200 mg är dock tillräckliga för de flesta nedströmsanalyser.

Representativa RNA isolerades från 50 mg fekala musprover (2 fekala pellets för mus) respektive 100 mg humana avföringsprover och eluerades i 50 μl nukleasfritt vatten. Spektrofotometeranalys av koncentrationen tyder på att en total mängd av 49 μg respektive 16 μg RNA isolerades (tabell 1). RNA-renheten var hög, vilket indikeras av ett A260/A280-förhållande på ~2,0 och ett A260/A230-förhållande på ~1,8 (tabell 1). Som rapporterats3 är majoriteten a...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

Detta protokoll isolerar högkvalitativt totalt RNA från fekala prover av djur och människor. Ett kommersiellt miRNA-isoleringssats används med betydande anpassning för att isolera rent RNA med optimerad kvantitet och kvalitet. RNA-isolaten är bra för de flesta nedströms RNA-analyser såsom sekvensering, mikromatris och RT-PCR.

Fekal (mikro) RNA-isolering

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fecal (micro) RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

RNA-interferens i Fästingar

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolering av Pseudomonas aeruginosa Kolonisera Murine mag-tarmkanalen

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Upptäckt av fluorescerande nanopartiklar Interaktion med Primär Immun cellsubpopulationer med flödescytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nukleokapsid Annealing-medierad elektrofores (NAME) Analys Tillåter snabb identifiering av HIV-1 nukleokapsiden Hämmare

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimering av en kvantitativ Micro-neutraliseringstest

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Realtid skakande-inducerad konvertering analys för detektion av CWD prioner i fekalt Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Kulturmetoder för att bestämma gränsen för upptäckt och överlevnad i Transport Media of Campylobacter Jejuni i humana fekalprover

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Övervakad maskininlärning för semikvantifiering av extracellulärt DNA i Glomerulonefrit

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

Terapeutisk utvärdering av fekal mikrobiotatransplantation i en interleukin 10-bristfällig musmodell

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...