Name: high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 7 s
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इस काम के लिए प्रमुख समर्थन NYUAD सेंटर फॉर जीनोमिक्स एंड सिस्टम्स बायोलॉजी (सीजीएसबी) द्वारा प्रदान किया गया था, जो न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय अबू धाबी अनुसंधान संस्थान अनुदान (73 71210 सीजीबी9) और NYU अबू धाबी संकाय अनुसंधान कोष (AD060) के तहत Tamkeen द्वारा वित्त पोषित था। W.F. अतिरिक्त झेजियांग विश्वविद्यालय के सौ प्रतिभा कार्यक्रम द्वारा समर्थित था । हम वीडियो रिकॉर्ड करने में मदद के लिए आशीष जायसवाल को धन्यवाद देते हैं। हम मेटाबोलिक फेनोटाइप डेटा उत्पन्न करने के लिए हांग कै को धन्यवाद देते हैं।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

ग्रीन माइक्रोल्गा, सी रेनहार्डीके मेटाबॉलिक फेनोटाइपिंग को यहां हाई थ्रूपुट पीएम परख प्लेटों और एक असंशोधित पीएमआई का उपयोग करके वर्णित किया गया था । परख का उपयोग पेप्टाइड नाइट्रोजन स्रोतों (पीएम06-08) के साथ कुल 190 कार्बन स्रोतों (पीएम01 और पीएम02), 95 नाइट्रोजन स्रोतों (पीएम03), 59 फास्फोरस स्रोतों और 35 सल्फर स्रोतों (पीएम04) के लिए किया गया था। सकारात्मक श्वसन 148 पोषक तत्वों के लिए मनाया गया था (सी-स्रोत उपयोग के लिए एक सकारात्मक परख, प्रत्येक एस-स्रोत और पी-स्रोत उपयोग के लिए चार सकारात्मक परख, और एन-स्रोत उपयोग के लिए 139 सकारात्मक परख)। मीडिया के सब्सट्रेट्स या पोषक तत्वों (कार्बन, नाइट्रोजन, फास्फोरस, या सल्फर) घटक को परिभाषित माध्यम में नहीं जोड़ा जाना चाहिए जब प्रासंगिक पीएम माइक्रोप्लेट्स पर लागू किया जाता है जो उन स्रोतों में से प्रत्येक के लिए परीक्षण करता है।
यहां दिखाई गई विधि मेटाबोलिक माइक्रोअल्गा फेनोटाइप की विशेषता के लिए प्रभावी है जिसका उपयोग मौजूदा मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल का विस्तार करने या नए मॉडलों के पुनर्निर्माण को निर्देशित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि अधिकांश माइक्रोशैगे की पोषण आवश्यकताओं का पता नहीं है, इसलिए इस मंच का उपयोग इन्हें तेजी से परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है। नेल्सन एट अल। 43 ने इन तरीकों को नए यौगिकों की पहचान करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया था जो माइक्रोएल्गे क्लोरॉइडियम एसपी यूटेक्स 3007 के विकास का समर्थन करते हैं और प्रजातियों के प्रवेश मेटाबोलाइट्स को परिभाषित करने के लिए प्राप्त जानकारी का उपयोग किया, जो क्लैमाइडोमोनास के विपरीत, 40 विभिन्न कार्बन स्रोतों को शामिल करता है।
माइक्रोएल्गे प्रोफाइलिंग के लिए पीएम की एक बड़ी सीमा यह है कि पीएमआई के इनक्यूबेशन चैंबर में कोई रोशनी नहीं है, और माइक्रोएल्गे को विषमतापूर्ण चयापचय को अंजाम देने में सक्षम होने की जरूरत है । प्रकाश की अनुपस्थिति उन मॉडलों की व्याख्या को प्रभावित कर सकती है जो मेटाबोलिक फ्लक्स की गणना करने के लिए प्रकाश को शामिल करते हैं। मेटाबोलिक नेटवर्क हब का गठन करने के लिए समन्वय कार्यों के साथ जीन जोड़े सह-विकसित हुए हैं, और फोटोसिंथेटिक और गैर-फोटोसिंथेटिक नेटवर्क हब के बीच अंतर44बनाया जा सकता है। सामान्य तौर पर, फोटोसिंथेटिक नेटवर्क हब (यानी, मॉडल में अत्यधिक जुड़े नोड्स) हेट्रोट्रोफिक मॉडल से बाहर रह जाएंगे। व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए, मिक्सोट्रोफिक प्रजातियों में मॉडलिंग हेट्रोफिज्म को प्रकाश द्वारा संचालित होने वाली प्रतिक्रियाओं को छोड़ देना चाहिए और स्थितियों के बीच ऊर्जा संतुलन मतभेदों के लिए खाते हैं। इस प्रकार, क्लैमिडोमोनास मेटाबोलिक मॉडलिंग6,45में हल्के-निर्भर और हल्के-स्वतंत्र मेटाबोलिज्म को मॉडलिंग करना मानक अभ्यास है।
ट्रेबोक्सियोफाइट्स जैसे कुछ हरे माइक्रोशैगे, विकास के लिए विभिन्न प्रकार के कार्बन अणुओं को आत्मसात करने के लिए जाने जाते हैं, और यह उनके लंबे विकासवादी इतिहास से लाइकेन46के सदस्यों के रूप में उत्पन्न हुआ माना जाता है। जबकि क्लोमायोमोनास जैसे क्लोरोफाइट्स विकास के लिए एसीटेट का उपयोग कर सकते हैं, ब्राउन मरीन माइक्रोल्गा तिसोक्रिसिस ल्यूटा, जो व्यावसायिक रूप से बहुत लंबी श्रृंखला पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड (वीएलसी-पीयूएफए) का उत्पादन करने की क्षमता के लिए जाना जाता है, एसीटेट का उपयोग नहीं कर सकता है लेकिन विकास47के लिए ग्लिसरोल का उपयोग कर सकता है। क्लोरेला के साथ 100 ग्राम एल−1 ड्राई सेल वेट की बायोमास एकाग्रता हासिल की गई है, जिसमें फेड-बैच मोड48में कार्बनिक कार्बन स्रोतों के अनुकूलित जोड़ दिए गए हैं। इसके अलावा , क्लोरेलवुलगारिस में चीनी का जोड़ सीओ2के ज़ब्ती को ऊंचा कर सकता हैऔर इस प्रकार फोटोसिंथेटिक विकास49के दौरान एक योजक लाभ प्रदान करता है। अधिकांश हेट्रोट्रोफिक माइक्रोअल्गा भी मिक्सोट्रोफिक रूप से विकसित हो सकते हैं, लेकिन क्लोरोफाइट क्रोमोक्लोरिस ज़ोफिंगिनेन्सिस को चीनी50के अलावा प्रकाश संश्लेषण बंद करने के लिए दिखाया गया है।
डिवीजन बैकिलारियोफाइटा से संबंधित डायटोम्स, फाइटोप्लैंकटन का एक प्रमुख समूह हैं। यद्यपि अधिकांश डायटॉम केवल फोटोऑटोट्रोफिक रूप से विकसित हो सकते हैं, उनमें से कुछ को मिक्सोट्रोफिक रूप से या हेट्रोट्रोफिकली51की खेती की जा सकती है। उदाहरण के लिए, ग्लिसरोल को कुछ डायटॉम में सीओ2 की अनुपस्थिति में प्रकाश में वृद्धि का समर्थन करने के लिए पाया गया था, जिसमें मॉडल प्रजातियां फियोडाक्टिलम ट्राइकॉर्नुटम52शामिल थीं। इसके अलावा, नित्ज़स्चिया लिनेरिस जैसे कुछ बेंथिक डायटॉम अंधेरे53में कार्बोहाइड्रेट पर बढ़ सकते हैं। यह उपयुक्त कार्बनिक कार्बन स्रोतों के पूरक द्वारा डायटोम्स और अन्य शैवाल समूहों को प्रधानमंत्री की परख का विस्तार करने की संभावना है ताकि कोशिकाओं को विषम रूप से बढ़ने में सक्षम बनाया जा सके, और एक मिक्सोट्रॉफी रणनीति का उपयोग संभावित रूप से अनिवार्य ऑटोट्रोफिक माइक्रोएल्गे के लिए भी किया जा सकता है जो न्यूनतम आवश्यक प्रकाश आपूर्ति प्रदान करता है।
डेटा की प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए, सभी प्लेटों के लिए डुप्लिकेट परख करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। एक परख को तभी सकारात्मक माना जा सकता है जब नकारात्मक नियंत्रण और संबंधित खाली कुओं से घटाव के बाद, अवशोषण (पीएमआई मूल्य) सकारात्मक हो। यह विवरण, परीक्षण यौगिक की उपस्थिति में, माध्यम के साथ डाई की अजैविक प्रतिक्रिया का प्रतिबिंब है।

लक्षित मेटाबोलाइट्स के उन्नत और स्थिर उत्पादन के लिए शैवाल चयापचय का अनुकूलन मेटाबोलिक नेटवर्क के सिस्टम-स्तर विश्लेषण के माध्यम से जटिल मेटाबोलिक इंजीनियरिंग रणनीतियों के विकास की आवश्यकता होती है। मेटाबॉलिक नेटवर्क मॉडल अनुकूलन रणनीतियों के तेजी से विकास के लिए तर्कसंगत डिजाइनों का मार्गदर्शन कर सकते हैं1,2,3,4. यद्यपि लगभग 160 माइक्रोलगल प्रजातियों को5अनुक्रमित किया गया है, लेकिन हमारे ज्ञान के लिए, केवल 44 शैवाल मेटाबोलिक मॉडल उपलब्ध हैं4,6,7। जीनोमिक जानकारी के प्रायोगिक सत्यापन के लिए उच्च-थ्रूपुट मेटाबोलिक फेनोटाइपिक डेटा प्राप्त करने में कठिनाई के कारण, उच्च गुणवत्ता वाले नेटवर्क मॉडल का पुनर्निर्माण शैवाल जीनोम अनुक्रमण के तेजी से विकास से पीछे है।
सी रेनहार्टी शैवाल आधारित अध्ययनों के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली है। यह प्रजातियां फोटोऑटोट्रोफिकली या विषम रूप से विकसित हो सकती हैं और बुनियादी और लागू अनुसंधान में एक मॉडल जीव के रूप में व्यापक रूप से उपयोग की जा सकती हैं। इसका जीनोम अनुक्रम 20078में प्रकाशित हुआ था, जिसमें जीनोम-स्केल मेटाबोलिक मॉडल बाद में9, 10,11प्रजातियों के लिए खंगाला गया था। सी रेनहार्टी (iRC1080) के लिए जीनोम-स्केल मॉडल को चांग एट अल द्वारा खंगाला गया था। 10 जीनोमिक और साहित्य साक्ष्य (~ 250 स्रोतों को आकर्षित करने) के आधार पर। इसमें 1,706 मेटाबोलाइट्स हैं, जिसमें 2,190 प्रतिक्रियाएंहैं 10; हालांकि, मॉडल की पूर्णता समय पर उपलब्ध प्रकाशित प्रयोगात्मक सबूत से परे सत्यापित नहीं किया जा सकता है ।
फेनोटाइप माइक्रोएरे (पीएमएस) तकनीक एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म है जो हेट्रोट्रोफिक सूक्ष्मजीवों के साथ-साथ ऊतक-संस्कृति कोशिकाओं के लिए मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग जानकारी प्रदान कर सकता है। विशेष रूप से, इसका उपयोग माइक्रोल्गा में फेनोटाइप-टू-जीनोटाइप ज्ञान अंतर को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले क्लैमिडोमोनास रेनहार्टी12 और बाद में क्लोरॉयडियम13 और क्लोरेला14 की प्रजातियों के लिए रिपोर्ट किया गया था। हजारों मेटाबोलाइट्स, संकेत अणुओं, ओस्मोलाइट्स और प्रभावक अणुओं के लिए सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करके, प्रधानमंत्री परख कार्यात्मक मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग प्रदान कर सकते हैं और कार्य, चयापचय, और पर्यावरण संवेदनशीलता15,16,17में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । विशेष रूप से, प्रधानमंत्री ने प्रत्येक कुएं में निहित विभिन्न पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स या ओस्मोलाइट्स के साथ 96-वेल माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं मेटाबोलाइट उपयोग का पता लगाया है। इसके अलावा, एंटीबायोटिक दवाओं और हार्मोन जैसे बायोएक्टिव अणुओं को परखना भी संभव है। टेट्राजोलियम आधारित रेडॉक्स डाई की एनएचएच कमी द्वारा रंग उत्पादन की तीव्रता से निर्धारित, सब्सट्रेट्स के मेटाबॉलिक उपयोग का मूल्यांकनसेलश्वसन 15,16, 17के संदर्भ में कियाजाताहै। 96-वेल माइक्रोप्लेट में प्रयोगों की निगरानी की जा सकती है और फेनोटाइप माइक्रोएरे इंस्ट्रूमेंट (पीएमआई) प्लेटफॉर्म के साथ समय के साथ स्वचालित रूप से निर्धारित की जा सकती है। बीस 96-वेल माइक्रोप्लेट को विभिन्न ऑस्मोटिक/आयन और पीएच प्रभावों के साथ-साथ कार्बन, नाइट्रोजन, सल्फर और फास्फोरस स्रोतों का उपयोग करने के लिए सेलुलर फेनोटाइप का अध्ययन करने के लिए आम सेट मेटाबोलाइट्स का प्रतिनिधित्व करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। पीएम तकनीक का इस्तेमाल सूक्ष्मजीवों15 , 16 , 17,18के लिए कई मौजूदा जीनोम-स्केल मेटाबोलिक मॉडल को अद्यतन और उन्नत करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है ।
यहां दिखाए गए प्रोटोकॉल और डेटा चैबूनचो एट अल द्वारा पहले प्रकाशित काम पर आधारित हैं। 12 प्रस्तुत कार्य में माइक्रोएल्गे के मेटाबॉलिक फेनोटाइप की विशेषता और सी रेनहार्ट्टी के मौजूदा शैवाल मेटाबॉलिक मॉडल का विस्तार करने के साथ-साथ नए मेटाबॉलिक मॉडल के पुनर्निर्माण का मार्गदर्शन करने के लिए पीएम परख विधि का विवरण दिया गया है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog assay plates [ PM01-08]</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog Omnilog Instrument</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td>
			<td></td>
			<td>Regents of the University of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0408-EU-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium Violet Dye &#8220;D&#8221;</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td>
			<td>42010012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae

मेटाबोलिक मॉडल को एक जीव के उपलब्ध जीनोम एनोटेशन के आधार पर खंगाला जाता है और सिस्टम-स्तर पर मेटाबोलिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भविष्य कहनेवाला उपकरण प्रदान करता है। जीनोम-स्केल मेटाबोलिक मॉडल में अंतराल के साथ-साथ प्रतिक्रियाएं शामिल हो सकती हैं जो प्रयोगात्मक रूप से असत्यापित हैं। नए अलग माइक्रोअगल प्रजातियों के पुनर्निर्मित मॉडल इन अंतरालों के कारण कमजोरियों में परिणाम होगा, क्योंकि आमतौर पर इस तरह के आइसोले के चयापचय के लिए विरल जैव रासायनिक सबूत उपलब्ध होते हैं । फेनोटाइप माइक्रोएरे (पीएम) तकनीक एक प्रभावी, उच्च थ्रूपुट विधि है जो कार्यात्मक रूप से प्रवेश मेटाबोलाइट्स की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब में सेलुलर मेटाबोलिक गतिविधियों को निर्धारित करती है। मेटाबोलिक मॉडलिंग के साथ उच्च थ्रूपुट फेनोटाइपिक परख का संयोजन मौजूदा मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल को जीनोमिक साक्ष्य का समर्थन और विस्तार करने के लिए जैव रासायनिक साक्ष्य प्रदान करके तेजी से खंगाला या अनुकूलित करने की अनुमति दे सकता है। इस काम में एक उदाहरण के तौर पर ग्रीन माइक्रोल्गल मॉडल प्रजाति क्लैमिडोमोनास रेनहार्टी का इस्तेमाल कर माइक्रोल्गा के अध्ययन के लिए पीएम परख का इस्तेमाल दिखाया जाएगा। प्रधानमंत्री द्वारा प्राप्त 254 से अधिक प्रतिक्रियाओं के लिए प्रायोगिक साक्ष्य का उपयोग इस अध्ययन में जीनोम-स्केल सी रेनहार्टी मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल, आईआरसी1080 को लगभग 25 प्रतिशत तक बढ़ाने और परिष्कृत करने के लिए किया गया था। यहां बनाए गए प्रोटोकॉल का उपयोग ज्ञात माइक्रोएल्गे म्यूटेंट और नए आइसोलेट सहित अन्य माइक्रोएल्गे के मेटाबोलिज्म को कार्यात्मक रूप से प्रोफाइल करने के लिए एक आधार के रूप में किया जा सकता है।

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High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

यह प्रोटोकॉल क्लैमाइडोमोनास रेनहार्टी, एक हरे माइक्रोल्गा की मेटाबॉलिक आवश्यकताओं को परिभाषित करने और एक मौजूदा मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल को परिष्कृत करने के लिए एक फेनोटाइप माइक्रोएरी (पीएम) प्रौद्योगिकी मंच के उपयोग को दर्शाता है।

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