Name: high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 7 s
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この研究に対する主要な支援は、ニューヨーク大学アブダビ研究所助成金(73 71210 CGSB9)とNYUアブダビ教員研究基金(AD060)の下でタムキーンが資金を提供したNYUADゲノミクス・システム生物学センター(CGSB)によって提供されました。W.F.は浙江大学の百人タレントプログラムによってさらにサポートされました。私たちは、ビデオを記録する上で助けを求めてAshish Jaiswalに感謝します。代謝表現型データを生成してくれたホンカイに感謝します。

1. 表現型マイクロアレイ実験
<ol><li>ミネソタ大学クラミドモラスリソースセンター(https://www.chlamycollection.org)から C.reinhardtii 株CC-503を取得します。</li>
	<li>400 μg/mL インフィング、50 μg/mL アンピシリン、および 100 μg/mL カナマイシン (細菌増殖を阻害する) の新鮮なトリス-酢酸リン酸 (TAP) 培地19で細胞を成長させます(細菌増殖を抑制する) 400 マイクロモル光素子/ms の下で 25 °C, 25 °C, 中期段階ログから 2 日間.</li>
	<li>22°Cで10分間2,000 x gで培養液をスピンダウンし、ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。</li>
	<li>0.1%テトラゾリウムバイオレット染料「D」を含む新鮮なTAP培地を準備します。 注:このステップでTAP培地を変更して、各プレートでテストされた代謝産物カテゴリに応じて栄養素を除外します(例えば、窒素源プレートの塩化アンモニウムを除外します)。</li>
	<li>ペレットを調製した新鮮なTAP培地(ステップ1.2から)で1 x 106 細胞/mLの最終濃度まで再懸濁します。</li>
	<li>化学化合物アレイアッセイプレート(炭素源、窒素源、リンおよび硫黄源プレート、ペプチド窒素源)を使用します。</li>
	<li>細胞含有培地の100μLアリコートをアッセイプレートの各ウェルに接種します。 注:必ずアッセイを複製してください。</li>
	<li>酵母エキス/ペプトンプレート上のストリーク細胞は、スミスらのように、グラム染色を行 う。20の前および後の細菌汚染を監視するアッセイ。</li>
	<li>化学化合物アレイアッセイプレートをマイクロプレートリーダーシステムに挿入します。</li>
	<li>30°Cですべてのプレートを最大7日間インキュベートし、15分ごとに色素の色の変化を読み取るようにマイクロプレートリーダーシステムをプログラムします。 注:ほとんどのマイクロプレートリーダーは、インキュベーション中に連続光の源を提供しなくて、藻類は、ヘテロ栄養呼吸を行うことができるはずです。</li>
</ol>2. データ分析
<ol><li>マイクロプレートリーダーから生のキネティックデータをCSVファイルとしてエクスポートし、その後、R.のオムニログ表現型マイクロアレイ(OPM)パッケージへの入力として使用されます。<ol>
<li>PMキネティックデータコンバータソフトウェアを使用する。D5E データ ファイルをロードし、PM キネティック解析ソフトウェアの次のコマンドラインを使用して、OKA ファイルに変換します。 |を読み込むインポート (OKA ファイルのフォルダを検索する) |フィルタの|の設定インポート |すべてのプレートを追加|閉める。 輸出| [データの読み取り (キネティック)] を選択し、 フォーマット (CSV) (タブヘッダー)を選択して、プレート (各プレート (個々のファイル) ) を選択|データ |のエクスポートセーブ。
</li>
		<li>表現型マイクロアレイ(PM)データ解析を実行するには、Rソフトウェア環境内で動作するOPMソフトウェアパッケージ21,22を使用します。パッケージ、チュートリアル、およびリファレンス ドキュメントは、次の http://www.goeker.org/opm/ にあります。RStudio では、R のグラフィカル ユーザー インターフェイスで、次のコマンドを使用して opm パッケージとその依存関係をインストールします。 ソース (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) 図書館(opm)
</li>
		<li>キネティックデータの CSV ファイルを含むディレクトリに移動し、opm 関数 read_を使用してデータをインポートします。 x <- read_opm ("." "
</li>
		<li>曲線パラメータ推定を使用して、運動データを集約し、分離します。 (i in 1 :length(x)) { x[i]<私は_aggre(x[[i]、ブート = 0 L、コア= 1 L、メソッド="スプライン"、オプション=set_spline_options("smooth.spline")) x[[i]<- do_disc(x[[i],カットオフ = FALSE) } メタデータの#Collection メタデータ <- collect_template(") メタデータ$ひず<-c("ブランク"""、CC- 503") (I in 1 :length(x)) {x[i]<-include_metadata(x[i], md = メタデータ,置き換え = TRUE)}
</li>
		<li>xy_plot関数を使用して、呼吸(または成長)測定(y軸)をアッセイされた96ウェルプレートの時間(x軸)の関数としてマッピングします。 印刷 (xy_plot[x[]1]、="ひずみ"、セオ.max = FALSEを含む)
</li>
		<li>関数 level_plot を使用してデータをヒート マップとして視覚化し、キネティック データの簡単な比較概要を確認します。 level_plot(x, main = list)、色 =opm_opt("color.borders")、panel.headers = メタデータ$ひずみ、cex = NULL、ストリップ.fmt = リスト)、ストリップテキスト.fmt = リスト)、レジェンド.sep ="、スペース="ラボ"、バイアス = 0.7、num.colors = 200 L)
</li>
		<li>重要な生物学的情報を抽出し、曲線パラメータは、生の運動曲線から、ラグ相(λ)、増殖速度(μ λ)、最大細胞呼吸(A)、および曲線下面積(AUC)21を含む。正の代謝物を識別するには、各マイクロウェルプレートのブランクに加えて、培地との色素の非生物反応性を表す負のコントロールのA値を背景の減算値として使用する。抽出関数は、A パラメーターを取得するために使用されます。 opm_opt(「カーブ.パラム」) パラム<- 抽出 (x, as.labels = リスト("ひずみ")) )
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 新しい代謝産物に関連する反応と遺伝子の同定
<ol><li>KEGG(京都遺伝子・ゲノム百科事典)(http://www.genome.jp/kegg/)とMetaCyc(http://metacyc.org/)を検索し、化学化合物アレイから見つかった代謝物を用いた反応について酵素委員会番号(AC)を同定する23,24,23,24.</li>
	<li>同定されたEC番号を、関節ゲノム研究所(JGI)、フィトゾーム(http://www.phytozome.net)、査読出版23、25、26、27などの複数の利用可能な藻類注釈リソースの検索基準として使用する。</li>
	<li>クエリが特定のEC番号の遺伝的証拠を返さない場合は 、C.reinhardtiiに最も近い種から始めて、他の生物の関連する関連タンパク質を特定し、デフォルト設定でNCBI PSI-BLASTサーバーを使用してプロファイルベースの検索を行い 、C.reinhardtii(taxid:3055) で非冗長タンパク質(nr)を使用して反応12に関連する候補遺伝子を同定します。</li>
	<li>EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search)またはInterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)タンパク質ドメイン予測サーバーを介してBLASTヒットを照会することにより、検索されたEC番号との関連性について、PsI-BLASTヒットを0.05のE <値で手動でキュレーションします。後者の2つのスキャンは、タンパク質の正しい酵素活性の同定を確実にするための重要なステップであることに注意してください。</li>
</ol>4. モデルの改良と評価
<ol><li>最新のCOBRAツールボックスv.3.0を使用する28マットラボで29,30モデルの絞り込みのための次のステップを実行するプラットフォーム。COBRA ツールボックスは、「https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html」の手順に従ってインストールできます。また、COBRA ツールボックスは Python (COBRApy) などの他のオープン ソース プログラミング言語にも実装されています。31)、https://opencobra.github.io/cobrapy/ で入手できます。<ol><li>COBRAツールボックスv.3.0をインストールした後、MATLABを開き、次のコマンドを実行してツールボックスを初期化します。 イニトコブラツールボックス;</li>
		<li>COBRA ツールボックス関数addReactionとchangeGeneAssociationを使用して、関連する遺伝子と共に同定された反応を代謝モデル(iRC1080 など) に追加します。http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 からダウンロードしたiRC1080 モデルを含むディレクトリに移動し、次のコマンドを実行してモデルをロードし、名前を変更し、新しいリアクションとそれに関連するジーンを追加します。 ロード('iRC 1080 .mat') モデル新しい = iRC 1080; モデル新しい = 反応を追加する(モデル、'D-ALA 2'、.. {'d-ala[c]'、'atp[c]'、.. 'D-アラデータ[c]、'adp[c]'、'pi[c]'、.. 'h[c]' },,2 - 1 1 1 1 1 [,false); モデルNEW = 変更遺伝子協会(モデル新、.. 'D-ALA 2','au.g 14655 _t 1' );</li>
		<li>代謝産物が細胞内で産生されないが培地から取り込まれる場合には、新しい代謝産物の輸送反応をモデルに追加する。これらの輸送反応は、細胞外媒体から細胞質体への代謝産物の受動的拡散を表す。さらに 、addExchangeRxn 関数を使用して対応する人工交換反応を追加して、代謝産物を細胞外媒体に入力または出力します。 モデル新しい = 反応を追加する(モデル、'CYCPt'、.. {'cycp[e]','cycp[c]' },,1 1 1 [,真)' モデル新しい = addExchangeRxn(モデル、'cycp[e]' ,- 1000,1000);</li>
		<li>新しい結果モデルの挙動をテストし、例 えば、BD1106は、光と闇 条件下で 、バイオマスを最大化するための光と暗い条件下でフラックスバランス解析(FBA)を実施し、目的関数として機能を発揮します。光の成長のために、PRISM太陽リチョの光反応の下限と上限を646.07(最大レート)に設定します。暗い成長のために、すべてのPRISM光反応の限界をゼロに設定します。暗い条件と明るい条件下での成長のために、以前に定義されたバイオマス関数を使用してください。FBA溶液は、反応流束(solution.v)とコスト削減(solution.w)に対応する2つのベクトルと、代謝産物の影の価格(solution.y)に対応する1つのベクトルを出力します。 %光条件下での成長をシミュレートする: モデル新しい = 変更Rxn境界(モデル新しい、{.. %'PRISM_solar_litho'、.. 'PRISM_solar_exo' , .. 'PRISM_incandescent_ 60 W'、.. 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' ,.. 'PRISM_metal_halide'、.. 'PRISM_high_pressure_sodium'、.. 'PRISM_growth_room'、.. 'PRISM_white_LED'、.. 'PRISM_red_LED_array_ 653 nm' ,.. 'PRISM_red_LED_ 674 nm' ,.. 'PRISM_fluorescent_warm_18 W'、.. 'PRISM_design_growth'、.. }, 0, 'b' ); モデル新しい = 変更目的(モデル、新しい、'BIOMASS_Chlamy_mixo')。 FBAsolution 新しい = 最適化CbModel(モデル新、'最大');</li>
		<li>ステップ 4.1.4 を iRC1080 で繰り返して 、iBD1106 用に得られた FBA ソリューションと iRC1080 用に得られたものを比較します。</li>
		<li>モデルの比較に使用できるさまざまなCOBRA法があります(例えば、フラックス変動解析、遺伝子欠失解析、ロバストネス分析、フラックス分割予測、FBA、サンプリングなど)。詳細なチュートリアルは、https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html で見つけることができます。ここでは、iRC1080モデルを精製版 iBD106と比較する例を提供し、各モデルで説明する代謝産物の影価格(バイオマス目的関数のシステム変数の変化に対する感度)を得ることによって提供される。 代謝物の影の価格を取得します。 シャドウ価格 = テーブル(モデルNew.mets、.. モデル新しい.メットネーム、FBAソリューション新しい.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

緑色の微細藻類 C.reinhardtiiの代謝表現型は、高スループットPMアッセイプレートおよび未改変PMIを用いてここで説明した。このアッセイは、合計190個の炭素源(PM01およびPM02)、95個の窒素源(PM03)、59リン源、35個の硫黄源(PM04)、ペプチド窒素源(PM06-08)に対して利用された。陽性呼吸は148の栄養素(C源利用のための1つの陽性アッセイ、各S源およびP源利用のための4つの肯定的なアッセイ、およびN源利用のための139陽性アッセイ)に対して観察された。これらの各ソースをテストする関連するPMマイクロプレートに適用する場合、メディアの基質または栄養素(炭素、窒素、リン、または硫黄)成分を定義された培地に添加しないでください。
ここに示す方法は、既存の代謝ネットワークモデルを拡張したり、新しいモデルの再構築を指示するために使用することができる代謝微細藻類の表型を特徴付けるために有効である。また、ほとんどの微細藻類の栄養要件が知られていないので、このプラットフォームはこれらを迅速に定義するために使用することができる。ネルソン ら43は、これらの方法を適用して、微細藻類 クロロイドウム sp.UTEX 3007の成長を支える新しい化合物を同定し、得られた情報を使用して、クラミドマとは異なり、40種類の炭素源を含む種の侵入代謝物を定義した。
微細藻類のプロファイリングのためのPMの大きな制限の1つは、PMIがインキュベーションチャンバーに照明を持たないことであり、微細藻類は不均栄養代謝を行うことができる必要がある。光の欠如は、代謝フラックスを計算するために光を組み込むモデルの解釈に影響を与える可能性があります。協調機能を持つ遺伝子ペアは、代謝ネットワークハブを構成するために共進化しており、光合成ネットワークハブと非光合成ネットワークハブの区別を44にすることができる。一般に、光合成ネットワークハブ(モデル内の高度に接続されたノード)は、ヘテロトロピケートモデルから除外されます。ミキソトロピケート種におけるモデリングの異種のモデリングは、光によって駆動される反応を省略し、条件間のエネルギーバランスの違いを考慮する必要があります。従って、クラミドモラス代謝モデリング6,45における光依存性および光非依存代謝のモデリングが標準的な実践である。
トレブキシオフィテスのようないくつかの緑色の微細藻類は、成長のために様々な炭素分子を同化することが知られており、これは地衣類46のメンバーとしての長い進化の歴史から生じたと考えられている。クラミドメナスのようなクロロファイトは、成長に酢酸を使用することができるが、非常に長鎖多価不飽和脂肪酸(VLC-PUFAs)を商業的に生産する可能性で知られる褐海の微細藻類チソクリシスルテアは、酢酸を使用することはできないが、成長にグリセロールを使用することができる47。100 g l-1以上の乾電池重量のバイオマス濃度は、供給バッチモード48で有機炭素源を最適化してクロレラで達成されています。また、クロレリャヴルガリスへの糖の添加は、CO2の隔離を高めることができ、したがって、光合成成長49中に付加的な利益を提供する。ほとんどの異栄養性微細藻類もミキソトロフィカルに成長することができるが、クロロファイトクロモクロリスゾフィンギエンシスは、糖50を添加すると光合成を遮断することが示されている。
分裂バチラリオフィタに属する珪藻類は、植物プランクトンの主要なグループである。ほとんどの珪藻は光自己対光的にしか成長できないが、それらのいくつかは、ミキソトロフィックまたは異様51を培養することができる。例えば、グリセロールは、モデル種であるフェオダクチラムトリコルヌトゥタム52を含む一部の珪藻類においてCO2が存在しない場合の光の成長を支えることを発見した。また、ニッツキアリニアのようないくつかの底生珪藻は、暗い53の炭水化物に成長することができます。PMアッセイは、細胞が不均一に成長できるように適切な有機炭素源を補うことによって、糖尿病および他の藻類群にPMアッセイを拡張する可能性があり、かつ、必要最小限の光供給を提供する義務的な自己栄養性微細藻類にもミキソトロフィー戦略を使用する可能性がある。
データの再現性を評価するために、全てのプレートに対して重複アッセイを行うことを強く推奨します。アッセイは、負のコントロールとそれぞれのブランクウェルからの減算後に、吸光度(PMI値)が正の場合にのみ正であると考えられる。この説明は、試験化合物の存在下で、色素の培地との不生物反応の反映である。

標的代謝産物の増強と安定した生産のために藻類代謝を最適化するには、代謝ネットワークのシステムレベルの解析を通じた複雑な代謝工学戦略の開発が必要です。代謝ネットワークモデルは、最適化戦略1、2、3、4の迅速な開発のための合理的な設計を導くことができます。約160種の微細種が5種配列化されているが、我々の知る限りでは、4,6,7の藻類代謝モデルは44種類しか存在しません。ゲノム情報の実験検証のための高スループット代謝型フェノミカルデータの取得が困難なため、高品質ネットワークモデルの再構築は藻類ゲノムシーケンシングの急速な発展に遅れをとっています。
C.reinhardtiiは藻類ベースの研究のための魅力的なモデルシステムです。この種は、光自己または不均一に成長することができ、基礎および応用研究のモデル生物として広く使用されています。そのゲノム配列は2007年8月に発表され、ゲノムスケールの代謝モデルは9、10、11種のために再構築された。C.reinhardtii(i RC1080)のゲノムスケールモデルをChangらによって再構築した。 10ゲノムおよび文献の証拠に基づく(〜250の情報源を伴う)。それは2,190反応10と1,706代謝物を有する;しかし、モデルの完全性は、当時公開された公開された実験証拠を超えて検証できませんでした。
表現型マイクロアレイ(PM)技術は、組織培養細胞だけでなく、ヘテロ栄養微生物の代謝プロファイリング情報を提供できるハイスループットプラットフォームです。特に、クロミドモナス・レインハルト12に対して最初に報告されたように、クロロイドニウム13およびクロレラ14の種に対して最初に報告されたように、微細藻類における表現型間の知識ギャップに対処するために使用することができる。何千もの代謝産物、シグナル伝達分子、浸透分子、およびエフェクター分子に対する細胞応答を研究することにより、PMアッセイは機能的代謝プロファイリングを提供し、機能、代謝、および環境感受性15、16、17に関する洞察を提供することができる。具体的には、PMアッセイは、各ウェルに含まれる異なる栄養素、代謝物、または浸透量が異なる96ウェルマイクロプレートにおける細胞代謝産物の利用を検出する。また、抗生物質やホルモンなどの生理活性分子をアッセイすることもできる。テトラゾリウム系酸化還元色素のNADH還元による色の強度によって決定されるように、基質の代謝利用率は細胞呼吸15、16、17の観点から評価される。96ウェルマイクロプレートでの実験は、表現型マイクロアレイ装置(PMI)プラットフォームを使用して、時間の経過とともに自動的に監視および決定することができます。20個の96ウェルマイクロプレートは、炭素、窒素、硫黄、リン源を利用する細胞表現型を研究するための共通のセット代謝産物を表すように設計されており、異なる浸透/イオンおよびpH効果を有する。PM技術は、微生物15、16、17、18の既存のゲノムスケール代謝モデルの数を更新し、アップグレードするために正常に使用されています。
ここに示すプロトコルとデータは、Chaiboonchoeらによって以前に公開された作品に基づいています 。12本発表の研究では、微小藻類の代謝表現型を特徴付け 、C.reinhardtii の既存の藻類代謝モデルを拡大し、新しい代謝モデルの再構築を導くために、PMアッセイ法の使用について詳しく説明した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog assay plates [ PM01-08]</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog Omnilog Instrument</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td>
			<td></td>
			<td>Regents of the University of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0408-EU-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium Violet Dye &#8220;D&#8221;</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td>
			<td>42010012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae

代謝モデルは、生物の利用可能なゲノム注釈に基づいて再構築され、システムレベルで代謝プロセスを研究するための予測ツールを提供します。ゲノムスケールの代謝モデルには、実験的に未確認の反応と同様にギャップが含まれる可能性があります。新たに単離された微細藻類種の再構築モデルは、通常、そのような分離株の代謝に利用可能なまばらな生化学的証拠があるので、これらのギャップによる弱点をもたらす。表現型マイクロアレイ(PM)技術は、幅広いエントリ代謝産物に応答して細胞代謝活動を機能的に決定する効果的で高スループットな方法です。高スループットの表現型アッセイと代謝モデリングを組み合わせることで、ゲノム証拠をサポートおよび拡張するための生化学的証拠を提供することで、既存の代謝ネットワークモデルを迅速に再構築または最適化することができます。本研究では、緑色の微細藻類モデル種クラミドマス・reinhardtiiを例に用いた微細藻類研究のためのPMアッセイの使用を示す。PMが得た254以上の反応の実験的証拠は、ゲノムスケールC.reinhardtii代謝ネットワークモデルi RC1080を約25%拡大し、精製するために使用された。ここで作成されたプロトコルは、既知の微細藻類変異体および新しい分離株を含む他の微細藻類の代謝を機能的にプロファイリングするための基礎として使用することができる。

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High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

このプロトコルは、表現型マイクロアレイ(PM)技術プラットフォームを使用して、緑の微細藻類 であるクラミドモナス・レインハルトイ の代謝要件を定義し、既存の代謝ネットワークモデルを改良することを実証しています。

微細藻類のモデル改良のための高スループット代謝プロファイリング

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

表現型マイクロアレイ技術は、幅広いエントリ代謝産物に応答して細胞代謝活動を機能的に決定する効果的なハイスループット法です。この技術の利用は、テトラゾリウム系酸化還元色素のNADH還元によって生成される発色量によって決定される細胞呼吸の形で測定される。本研究では、モデル種クラミドモラス・レインハルトを用いた微藻類の文脈における表現型マイクロアレイアッセイの利用について紹介する。本研究の目的は、既存の藻類代謝ネットワークモデルの拡大や新モデルの再構築を導くために使用できる、微細藻類の代謝型のフェノタイピングを特徴付けるための信頼できる方法を確立することです。クラミドモナス・レインハルトティ菌株CC-503は、米国ミネソタ大学クラミドモラス・リソースセンターから入手できます。新鮮なトリス酢酸リン酸脂肪培地中の細胞を中ログ相に成長させます。顕微鏡の下の細胞をチェックして、良好な状態で汚染が発生していないことを確認します。2000 Gフォースで10分間培養をスピンダウンします。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。0.1%テトラゾリウムバイオレット色素を含む新鮮なタップ培地を準備D"細菌の増殖を阻害するために、インチュンチン、アンピシリン、カナマイシンを含む異なる抗生物質を培地に加えます。脂肪培地とこのステップは、各プレートの種類に応じて、栄養素から省略する必要があります。ペレットと新鮮なタップメディアを1ミリリットル当たり100万細胞の最終濃度まで再懸濁する。炭素源、窒素源、リン、硫黄源プレート、ペプチド窒素源などの化学化合物アレイアッセイプレートを使用します。エッセイプレートの各ウェルに自己含有媒体の十分な100マイクロリットルを接種する。アッセイを複製してください。この段階では、細胞は、細菌汚染を監視するために、アッセイの前後にグラム陰性染色で試験されるべきであることを留意すべきである。化学化合物領域アッセイプレートをマイクロプレートリーダーシステムに挿入します。すべてのプレートを最大7日間30度でインキュベートし、15分ごとに色素の色の変化を読み取るようにマイクロプレートリーダーシステムをプログラムします。ほとんどのマイクロプレートリーダーは、インキュベーション中に連続光の源を提供しなくてはなりませんので、藻類は、ヘテロトロピー性呼吸を行うことができるはずです。マイクロプレートリーダーから生のキネティックデータをCSVファイルとしてエクスポートし、その後、表現型マイクロアレイソフトウェアパッケージと当社のソフトウェアへの入力として使用されます。表現型マイクロアレイデータ解析を実行するには、Rソフトウェア環境内で動作するOmniLog表現型マイクロエリックOPMソフトウェアパッケージを使用します。R studio で、R のグラフィカル ユーザー インターフェイスを使用して、原稿に詳細なコマンドを使用して OPM パッケージとその依存関係をインストールします。キネティックデータの CSV ファイルを含むディレクトリに移動し、読み取り OPM 関数を使用してデータをインポートします。キネティックデータは、pref パラメータ推定を使用して集計および分離することができます。関数XYプロットを使用すると、呼吸または成長測定をアッセイ96ウェルプレートの時間の関数としてマッピングすることができます。このデータは、機能レベルプロットを使用してヒートマップとして視覚化され、動態データの迅速な比較概要を可能にします。次のステップは、新しい代謝産物に関連する反応と遺伝子を同定することです。藻類の既存のモデルが存在する場合、表現型マイクロアレイシステムからのデータ解析を使用して、このモデルを改良することができます。ここでは、表現型マイクロアレイデータを用いたクラミドモナスモデルのゲノムスケール代謝ネットワーク改良に使用したパイプラインを紹介します。新しい化合物が陽性の使用率を検定すると、化合物の関連する反応プロファイルが代謝知識ベースを使用して定義され、関連する酵素手数料数が提供されます。最初のステップは、ケッグとMetaCycを検索して、化学化合物アレイから見つかった代謝を使用した反応について、酵素手数料数であるECを同定することです。次に、同定されたEC番号を、共同ゲノム研究所、JGI、フィトゾーム、ピアレビュー出版物など、複数の利用可能な藻類注釈リソースの検索基準として使用します。反応および代謝物は、COBRAベースのクラミドモナス・reinhardtii代謝ネットワークモデルiRC1080に添加され、モデルを拡大および改良する。EC番号を支持する遺伝子証拠が見つからない場合、NCBI位置特異的反復性、NCBI PSI-BLASTなどのプロファイルベースの検索を行い、反応に関連する候補遺伝子を同定することができる。その結果は手動で評価されます。検索 EC 番号との関連性に関して、E 値が 0.05 未満のこの QC ステップを渡した場合は、メトリック モデルに追加されます。このプロトコルの最後のステップは、モデルの改良、モデルの評価と比較です。最新の COBRA ツールボックス バージョン 3.0 と MATLAB プラットフォームを使用して、モデルの改良の手順を実行します。コブラツールボックスをインストールした後、iRC1080モデルをダウンロードできます。MATLAB では、まず参照モデル iRC1080 を含むフォルダに移動します。コブラツールボックス機能を使用して、関連遺伝子と同定された反応を代謝モデル(iRC1080など)に追加します。反応を追加し、遺伝子の関連を変更します。iRC1080 モデルが含まれているディレクトリーにナビゲートし、モデルをロードするためのコマンドを実行します。名前を変更し、新しい反応とそれに関連する遺伝子を追加します。代謝産物が細胞内で産生されない場合、媒体から取り出される場合、新しい代謝産物の輸送反応は、追加/交換反応機能を使用して、代謝産物を細胞外媒体に入力または出力する必要があります。新しい結果およびモデルの挙動をテストし、例えば、iBD1106は、フラックスバランス解析を行うことにより、FBA、光・暗条件下でのCBモデルを最適化し、バイオマスを最大限に活用する機能を利用して、その物体関数として最大限に活用する。とりわけ、FBA溶液は反応流束、代謝物の影の価格、および反応がコストを削減した3つのベクトルを出力する。ここでは、iRC1080モデルを精製版iBD1106と比較する例を提供し、各モデルで占める変化及び代謝物に対するバイオマス目的関数の感度を表す影価格を求める。ここでは、炭素源と窒素源の呼吸XYプロットと窒素源アッセイプレートの呼吸を示し、それぞれティールカラーと紫でCC-503を測定します。各井戸内では、呼吸曲線は時間の関数としての減少による染料変換を表します。パネルAでハイライトされたピークは、クラミドメナス文献と一致するこのプレートからの唯一の炭素源としてのアセテートの検出を表す。3つの異なる方法を使用して同定された代謝産物の数の比較は、よくキュレーションされたクラミドミナ代謝モデルであるiRC1080、GC-TOF飛行のガスクロマトグラフィー時間、および表現型マイクロアレイエッセイでは、3つのセット間で6つの代謝産物だけが重複し、149はiRC1080とpheno型マイクロタイプの間で共通であった。これは、各技術が代謝プロファイリング研究に向けて強みを持っている一方で、表現型マイクロアレイアッセイセットが新しい代謝情報の重要な源となり得ことを示しています。得られた情報を、代謝ネットワークモデルiRC1080を拡大・改良するために用いた。ここでは、iRC1080モデルの含有量と拡大モデルiBD1106を比較し、反応数、代謝物の数、遺伝子数を含む。我々は、我々のモデルの精製が新しい結果のネットワークに254以上の反応を加えることを示す。これらの反応は、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドおよび輸送反応に分類される。新たに同定された代謝産物は、既存のクラミドマナス・reinhardtii代謝モデルの代謝ネットワーク拡張および精製に使用された。この表現型マイクロアレイアッセイは、既存および新規に単離された株の代謝表現型を特徴付けるために使用できます。さらに、微細藻類の文脈で使用したプロトコルは、他の種の代謝モデルの改良を導くことができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

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開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）</em

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High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

細胞培養におけるRNA合成、処理およびディケイの高解像度遺伝子発現プロファイリングのための新規転写されたRNAの代謝標識

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

ハイスループットSHAPEを使用したRNA二次構造予測

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...