Name: high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae at JoVE.com

O grande apoio para este trabalho foi fornecido pelo NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), financiado pela Tamkeen sob a bolsa do Instituto de Pesquisa de Abu Dhabi da Universidade de Nova York (73 71210 CGSB9) e nyu Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. foi adicionalmente apoiado pelo Programa de Cem Talentos da Universidade de Zhejiang. Agradecemos a Ashish Jaiswal pela ajuda na gravação do vídeo. Agradecemos a Hong Cai por gerar os dados do fenótipo metabólico.

1. Experimentos de Microarray do Fenótipo
<ol><li>Obtenha C. reinhardtii cep CC-503 do Centro de Recursos Chlamydomonas na Universidade de Minnesota, EUA (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Cultivar as células em mídia fresca Tris-Acetato-Fosfato (TAP)19 com concentrações finais de 400 μg/mL timentin, 50 μg/mL ampicillin, e 100 μg/mL kanamycin (para inibir o crescimento bacteriano) sob 400 fótons de micromol/m2s, a 25 °C, durante dois dias até a fase de registro médio.</li>
	<li>Gire a cultura a 2.000 x g por 10 min a 22 °C e descarte o supernatante sem perturbar a pelota.</li>
	<li>Prepare as mídias tap frescas contendo 0,1% de corante violeta tetrazolium "D". NOTA: Modifique a mídia TAP nesta etapa para excluir alguns nutrientes dependendo da categoria metabólito testada em cada placa (por exemplo, exclua o cloreto de amônio para placas de origem de nitrogênio).</li>
	<li>Resuspende a pelota em mídia TAP fresca preparada (a partir da etapa 1.2) para uma concentração final de 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Use placas de ensaio de matriz de compostos químicos (fontes de carbono, fontes de nitrogênio, placas de fontes de fósforo e enxofre, e as fontes de nitrogênio peptídeo).</li>
	<li>Inocular uma alíquota de 100 μL de mídia contendo células em cada poço das placas de ensaio. NOTA: Certifique-se de duplicar os ensaios.</li>
	<li>Células de listras em placas de extrato de levedura/peptone e realizar coloração grama, como em Smith et al. 20 antes e depois do ensaio para monitorar a contaminação bacteriana.</li>
	<li>Insira as placas de ensaio do conjunto composto químico no sistema de leitor de microplacas.</li>
	<li>Incubar todas as placas a 30 °C por até 7 dias e programar o sistema de leitor de microplacas para ler a mudança de corante a cada 15 minutos. NOTA: Como a maioria dos leitores de microplaca não fornece uma fonte de luz contínua durante a incubação, as algas devem ser capazes de realizar respiração heterotrófica.</li>
</ol>2. Análise de dados
<ol><li>Exporte os dados cinéticos brutos do leitor de microplapes como arquivos CSV, que posteriormente serão usados como entrada para o pacote Omnilog Phenotype Microarray (OPM) em R. Adicione as informações biológicas como metadados (por exemplo, designação de cepa, mídia de crescimento, temperatura, etc.).<ol>
<li>Utilizando o software de conversor de dados PM Kinetic; carregar os arquivos de dados D5E e convertê-los em arquivos OKA usando as seguintes linhas de comando no software de análise cinética PM: | de carga Importação (localizar a pasta dos arquivos OKA) | Filtros de preenchimento | | de importação Adicione todas as placas | Fechar. | de exportação escolha os dados de leitura (Cinético), escolha o formato (CSV) (Cabeçalho Tabula)e escolha placas (cada placa (arquivos individuais)) | Dados de exportação | Salvar.
</li>
		<li>Para realizar a análise de dados Phenotype Microarray (PM), utilize o pacote de software OPM21,22 que funciona dentro do ambiente de software R. O pacote, tutorial e documentação de referência estão disponíveis em: http://www.goeker.org/opm/. No RStudio, uma interface de usuário gráfica para R, instale o pacote opm e suas dependências usando os seguintes comandos: fonte (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) biblioteca (opm)
</li>
		<li>Navegue até o diretório que contém os arquivos CSV dos dados cinéticos e importe os dados usando a função read_opm: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
</li>
		<li>Agregar e discretizar os dados cinéticos usando a estimativa de parâmetro de curva. Para (i em 1:comprimento(x)) { x[[i]] <Eu do _aggre(x[[[i]], inicial = 0 L, núcleos = 1 L, método ="splines", opções = set_spline_options("smooth.spline")) x[[i]] <- do_disc(x[[i]], corte = FALSO) } #Collection dos metadados metadados <- collect_template(".") metadados$Strain <-c("BLANK","CC- 503") para (I em 1:comprimento(x)) {x[[[i]] <- include_metadata(x[[[i]], md = metadados, substitua = TRUE)}
</li>
		<li>Use a função xy_plot para mapear as medidas de respiração (ou crescimento) (eixo y) em função do tempo (eixo x) para as placas de 96 poços. imprimir (xy_plot(x[[1]] incluem ="Tensão", teor.max = FALSO))
</li>
		<li>Visualize os dados como um mapa de calor usando a função level_plot para permitir uma visão geral comparativa rápida dos dados cinéticos. level_plot(x, principal = lista(), cores = opm_opt ("cor.fronteiras"), painel.cabeçalhos = metadados $Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Extrair informações biológicas importantes, os parâmetros da curva, a partir das curvas cinéticas brutas e incluem a fase de lag (λ), a taxa de crescimento (μ), a respiração celular máxima (A) e a área sob a curva (AUC)21. Para identificar metabólitos positivos, utilize os valores A do controle negativo, que representa a reatividade abiótica do corante com o meio, além do vazio de cada placa de microwell como valores de subtração de fundo. A função extrato é usada para obter o parâmetro A. opm_opt("curve.param") param <- extrato (x, as.labels = lista("Tensão"))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identificação de Reações e Genes Associados a Novos Metabólitos
<ol><li>Procure KEGG (Enciclopédia de Quioto de Genes e Genomas) (http://www.genome.jp/kegg/) e MetaCyc (http://metacyc.org/) para identificar números da Comissão de Enzimas (CES) para reações usando metabólitos encontrados a partir de matrizes de compostos químicos23,2423,24.</li>
	<li>Use os números de CE identificados como base de pesquisa em múltiplos recursos de anotação de algas disponíveis, como Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) e publicações revisadas por pares23,25,26,27.</li>
	<li>Se uma consulta não retornar nenhuma evidência genética para um determinado número ce, identifique as proteínas associadas relevantes em outros organismos, começando com espécies mais próximas do C. reinhardtii, em seguida, realize uma pesquisa baseada em perfil usando o servidor NCBI PSI-BLAST com configurações padrão e use proteínas não redundantes (nr) em C. reinhardtii (taxid:3055) para identificar genes candidatos associados à reação12.</li>
	<li>Faça a curadoria manual dos hits PSI-BLAST com valores E de < 0,05 para relevância para o número de CE pesquisado através da consulta desses hits BLAST através de servidores de domínio de proteínas EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) ou InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Observe que os dois últimos exames são passos críticos para garantir a identificação da atividade enzimática correta para a proteína.</li>
</ol>4. Refinamento e Avaliação do Modelo
<ol><li>Use a última caixa de ferramentas COBRA v.3.028no MATLAB29,30plataforma para realizar as seguintes etapas para refinamento de modelo. A caixa de ferramentas COBRA pode ser instalada seguindo as etapas em: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternativamente, observe que a caixa de ferramentas COBRA também é implementada em outras linguagens de programação de código aberto, como python (COBRApy31), e está disponível em: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>Após a instalação da caixa de ferramentas COBRA v.3.0, abra o MATLAB e execute o seguinte comando para inicializar a caixa de ferramentas: initCobraToolbox;</li>
		<li>Adicione as reações identificadas com seus genes associados ao modelo metabólico, como o iRC1080, usando as funções da caixa de ferramentas COBRA adicionando Reação e changeGeneAssociation. Navegue até o diretório que contém o modelo iRC1080, baixado de http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 e execute os seguintes comandos para carregar o modelo, renomeá-lo e adicionar uma nova reação e seu gene associado. Carga ('iRC 1080 .mat') modeloNova = iRC 1080; modelNew = addReaction (modelNew, 'D-ALA 2' , ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... 'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... 'h[c]' },[-2 - 11 11 11 ],falso); modelNEW = changeGeneAssociation (modelNew, ... 'D-ALA 2','au.g 14655 _t 1' );</li>
		<li>Em alguns casos, quando o metabólito não é produzido intracelularmente, mas é retirado do meio, adicione reações de transporte para os novos metabólitos ao modelo. Estas reações de transporte representam difusão passiva de um metabólito do meio extracelular ao citosol. Além disso, adicione uma reação de troca artificial correspondente usando a função addExchangeRxn para inserir ou saída do metabólito no meio extracelular. modelNew = addReaction (modelNew, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 11 ],true)' modelNew = addExchangeRxn (modelNew, 'cycp[e]' - 1000 ,1000 );</li>
		<li>Teste o comportamento do novo modelo resultante, por exemplo, iBD1106, realizando análise de equilíbrio de fluxo (FBA) utilizando a função otimizar O Modelo de pressão sob condições claras e escuras para a maximização da biomassa como função objetiva. Para o crescimento da luz, defina as retrações de luz do lito solar PRISM para 646,07 (taxa máxima). Para o crescimento escuro, coloque os limites de todas as reações de luz PRISM a zero. Use a função biomassa definida anteriormente10 para crescimento em condições escuras e claras. A solução FBA produzirá dois vetores correspondentes a fluxos de reação (solution.v) e redução de custo (solution.w), bem como um vetor correspondente aos preços de sombra dos metabólitos (solution.y). %Simular crescimento sob condição leve: modelNew = changeRxnBounds (modelNew,{ ... % 'PRISM_solar_litho', ... 'PRISM_solar_exo', ... 'PRISM_incandescent_ 60 W', ... 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W', ... 'PRISM_metal_halide', ... 'PRISM_high_pressure_sodium', ... 'PRISM_growth_room', ... 'PRISM_white_LED', ... 'PRISM_red_LED_array_ 653 nm', ... 'PRISM_red_LED_ 674 nm', ... 'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W', ... 'PRISM_design_growth', ... }, 0, 'b' ); modelNew = changeObjective (modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel (modelNew, 'max');</li>
		<li>Repita o passo 4.1.4 para iRC1080 para comparar as soluções FBA obtidas para iBD1106 com as obtidas para iRC1080.</li>
		<li>Há uma gama de métodos COBRA disponíveis que podem ser usados para comparar modelos (por exemplo, análise de variabilidade de fluxo, estudos de exclusão genética, análises de robustez, previsões de divisão de fluxo, FBA, amostragem, etc.). Tutoriais detalhados podem ser encontrados em https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Aqui, é fornecido um exemplo onde o modelo iRC1080 é comparado com sua versão refinada, iBD1106, obtendo os preços de sombra (sensibilidade da função objetiva de biomassa às mudanças na variável sistema) dos metabólitos contabilizados em cada modelo. Obtenha os preços das sombras para os metabólitos: shadowPrices = tabela(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Fenotipagem metabólica da microalga verde, C. reinhardtii,foi descrito aqui usando placas de ensaio pm de alta taxa de rendimento e um PMI não modificado. Os ensaios foram utilizados para um total de 190 fontes de carbono (PM01 e PM02), 95 fontes de nitrogênio (PM03), 59 fontes de fósforo e 35 fontes de enxofre (PM04), além de fontes de nitrogênio peptídeo (PM06-08). A respiração positiva foi observada para 148 nutrientes (um ensaio positivo para utilização da fonte C, quatro ensaios positivos para cada utilização da fonte S e fonte P e 139 ensaios positivos para utilização da fonte N). Os substratos ou nutrientes (carbono, nitrogênio, fósforo ou enxofre) da mídia não devem ser adicionados ao meio definido quando aplicados às microplatas pm relevantes que testam para cada uma dessas fontes.
O método aqui mostrado é eficaz para caracterizar fenótipos de microalgas metabólicas que podem ser usados para estender modelos de rede metabólica existentes ou direcionar a reconstrução de novos modelos. Além disso, como não são conhecidos os requisitos nutricionais da maioria das microalgas, essa plataforma pode ser usada para defini-las rapidamente. Nelson et al. 43 aplicou com sucesso esses métodos para identificar novos compostos que suportam o crescimento da microalgae Cloroidium sp. UTEX 3007 e usou as informações obtidas para definir os metabólitos de entrada da espécie, que, ao contrário das Clamídias, incluem 40 diferentes fontes de carbono.
Uma das principais limitações da PM para o perfil das microalgas é que o PMI não tem iluminação na câmara de incubação, e as microalgas precisam ser capazes de realizar o metabolismo heterotrófico. A ausência de luz poderia afetar a interpretação de modelos que incorporam luz para calcular fluxos metabólicos. Os pares genéticos com funções de coordenação têm co-evoluído para constituir hubs de rede metabólica, e a distinção entre hubs de rede fotossintéticos e não fotossintéticos pode ser feita44. Em geral, os hubs de rede fotossintéticos (ou seja, nódulos altamente conectados no modelo) ficariam de fora dos modelos heterotróficos. Para fins práticos, a modelagem do heterotrofismo em espécies mixotróficas deve omitir reações conhecidas por serem impulsionadas pela luz e explicar as diferenças de equilíbrio energético entre as condições. Assim, modelar o metabolismo dependente da luz e da luz é a prática padrão na modelagem metabólica clamídia6,45.
Algumas microalgas verdes, como trebouxiophytes, são conhecidas por assimilar uma variedade de moléculas de carbono para o crescimento, e acredita-se que isso tenha surgido de sua longa história evolutiva como membros dos líquens46. Enquanto clorofilas como as Clamídias podem usar acetato para crescimento, a microalga marinha marrom Tisochrysis lutea, conhecida por seu potencial de produzir comercialmente ácidos graxos poli-insaturados de cadeia muito longa (VLC-PUFAs), não pode usar acetato, mas pode usar glicerol para crescimento47. A concentração de biomassa de mais de 100 g l-1 de peso celular seco foi alcançada com chlorella com adição otimizada de fontes orgânicas de carbono em um modo de lotealimentado 48. Além disso, a adição de açúcar aos Clorovulgaris pode elevar seu sequestro de CO2, proporcionando assim um benefício aditivo durante o crescimento fotossintético49. A maioria das microalgas heterotróficas também pode crescer mixotropo, mas a clorofila chromoclolo zofingiensis tem sido mostrada para desligar a fotossíntese após a adição de açúcar50.
Diatomas, pertencentes à divisão Bacillariophyta, são um grande grupo de fitoplâncton. Embora a maioria dos diatomas só possa crescer fotoautotropoticamente, alguns deles podem ser cultivados misotroficamente ou heterotroficamente51. Por exemplo, o glicerol foi encontrado para apoiar o crescimento da luz na ausência de CO2 em algumas diatomas, incluindo a espécie modelo Phaeodactylum tricornutum52. Além disso, alguns diatomás benéticos como nitzschia linearis podem crescer em carboidratos no escuro53. É provável que estenda os ensaios pm a diatomas e outros grupos de algas, suplementando fontes de carbono orgânicas adequadas para permitir que as células cresçam heterotroficamente, e uma estratégia de mixotrofia também pode ser potencialmente usada para a microalga autotrófica obrigatória, fornecendo um fornecimento de luz minimamente necessário.
Para avaliar a reprodutibilidade dos dados, é altamente recomendável realizar ensaios duplicados para todas as placas. Um ensaio só pode ser considerado positivo se, após a subtração do controle negativo e dos respectivos poços em branco, a absorção (valor pmi) for positiva. Esta descrição, na presença do composto testado, é um reflexo da reação abiótica do corante com o meio.

A otimização do metabolismo algal para uma produção aprimorada e estável de metabólitos requer o desenvolvimento de estratégias complexas de engenharia metabólica através de análises em nível de sistemas de redes metabólicas. Modelos de rede metabólica podem orientar os projetos racionais para o rápido desenvolvimento das estratégias de otimização1,2,3,4. Embora aproximadamente 160 espécies microánguas tenham sido sequenciadas5, existem, pelo que sabemos, apenas 44 modelos metabólicos de algas disponíveis4,6,7. Devido à dificuldade em obter dados fenotípicos metabólicos de alto rendimento para validação experimental de informações genômicas, a reconstrução de modelos de rede de alta qualidade está por trás do rápido desenvolvimento do sequenciamento do genoma de algas.
C. reinhardtii é um sistema de modelo atraente para estudos baseados em algas. Esta espécie pode crescer fotoautotrófica ou heterotrofoficamente e tem sido amplamente utilizada como um organismo modelo em pesquisas básicas e aplicadas. Sua sequência de genomas foi publicada em 20078, com modelos metabólicos em escala de genoma posteriormente reconstruídos para a espécie9,10,11. O modelo em escala de genoma para C. reinhardtii (iRC1080) foi reconstruído por Chang et al. 10 com base em evidências genômicas e bibliográficos (implicando ~250 fontes). Tem 1.706 metabólitos com 2.190 reações10; no entanto, a com completeidade do modelo não pôde ser verificada além das evidências experimentais publicadas disponíveis na época.
A tecnologia de microarrays fenotipos (PMs) é uma plataforma de alto rendimento que pode fornecer informações metabólicas de perfil para microrganismos heterotróficos, bem como células de cultura tecidual. Em particular, pode ser usado para abordar a lacuna de conhecimento fenótipo-genótipo em microalgas, como relatado pela primeira vez para chlamydomonas reinhardtii12 e posteriormente para uma espécie de Cloroidium13 e Chlorella14. Ao estudar as respostas celulares a milhares de metabólitos, moléculas de sinalização, osmolitos e moléculas de efeitos, os ensaios da PM podem fornecer perfis metabólicos funcionais e oferecer insights sobre a função, metabolismo e sensibilidade ambiental15,16,17. Especificamente, os ensaios pm detectam a utilização de células metabólicas em microplatas de 96 poços com diferentes nutrientes, metabólitos ou osmólises contidos em cada poço. Além disso, também é possível avaliar moléculas bioativas, como antibióticos e hormônios. Conforme determinado pela intensidade da produção de cores pela redução nadh de um corante de redox à base de tetrazolium, a utilização metabólica dos substratos é avaliada em termos de respiração celular15,16,17. Os experimentos em microplacos de 96 poços podem ser monitorados e determinados automaticamente ao longo do tempo com a plataforma de instrumentos de microarraia de fenótipo (PMI). Vinte microplacas de 96 poços são projetadas para representar os metabólitos comuns para estudar fenótipos celulares para utilizar fontes de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo, juntamente com diferentes efeitos osmóticos/íons e pH. A tecnologia PM tem sido usada com sucesso para atualizar e atualizar uma série de modelos metabólicos em escala de genoma existentes para microrganismos15,16,17,18.
O protocolo e os dados aqui mostrados são baseados em trabalhos publicados anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12 O trabalho apresentado detalha o uso do método de ensaio pm para caracterizar os fenótipos metabólicos das microalgas e ampliar um modelo metabólico de algas existente de C. reinhardtii, bem como orientar a reconstrução de novos modelos metabólicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog assay plates [ PM01-08]</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog Omnilog Instrument</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td>
			<td></td>
			<td>Regents of the University of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0408-EU-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium Violet Dye &#8220;D&#8221;</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td>
			<td>42010012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae

Modelos metabólicos são reconstruídos com base na anotação do genoma disponível de um organismo e fornecem ferramentas preditivas para estudar processos metabólicos em nível de sistemas. Modelos metabólicos em escala de genoma podem incluir lacunas, bem como reações que não são verificadas experimentalmente. Modelos reconstruídos de espécies microalgal recém-isoladas resultarão em fraquezas devido a essas lacunas, pois geralmente há evidências bioquímicas esparsas disponíveis para o metabolismo de tais isolados. A tecnologia de microarraia de fenótipo (PM) é um método eficaz e de alto rendimento que determina funcionalmente atividades metabólicas celulares em resposta a uma ampla gama de metabólitos de entrada. A combinação dos ensaios fenotípicos de alto rendimento com a modelagem metabólica pode permitir que modelos de rede metabólica existentes sejam rapidamente reconstruídos ou otimizados, fornecendo evidências bioquímicas para apoiar e expandir evidências genômicas. Este trabalho mostrará como exemplo o uso de ensaios pm para o estudo de microalgas usando a espécie modelo microalgal verde Chlamydomonas reinhardtii. Evidências experimentais para mais de 254 reações obtidas pela PM foram utilizadas neste estudo para expandir e refinar um modelo de rede metabólica C. reinhardtii em escala genoma, iRC1080, em aproximadamente 25%. O protocolo criado aqui pode ser usado como base para traçar o perfil funcional do metabolismo de outras microalgas, incluindo mutantes conhecidos de microalgas e novos isolados.

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High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Este protocolo demonstra o uso de uma plataforma tecnológica de microarray fenotipo (PM) para definir os requisitos metabólicos de Chlamydomonas reinhardtii, uma microalga verde, e refinar um modelo de rede metabólica existente.

Perfil metabólico de alta produtividade para refinamentos de modelo de microalgas

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

A tecnologia de micro array de fenótipo é um método eficaz de alta produtividade que determina funcionalmente atividades metabólicas celulares em resposta a uma ampla gama de metabólitos de entrada. A utilização nesta tecnologia é medida na forma de respiração celular determinada pela quantidade de desenvolvimento de cores produzida pela redução naDH de um corante de redox à base de tetrazolium. Neste trabalho, introduziremos o uso de ensaios de micro matriz fenótipo no contexto de micro-algas usando espécies modelo Chlamydomonas reinhardtii.O objetivo deste estudo é estabelecer um método confiável para caracterizar fenotipagem metabólica de microálgas que possam ser usadas para expandir modelos de rede metabólica de algas existentes ou orientar a reconstrução de novos modelos. Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 pode ser obtido do centro de recursos Chlamydomonas na Universidade de Minnesota EUA. Cresça as células em mídia fresca de gordura fosfato tris-acetato para a fase de registro médio.Verifique as células sob o microscópio para ter certeza de que elas estão em boa forma e sem contaminação. Desça a cultura em 2000 G-force por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.Prepare as mídias de torneira fresca contendo 0,1% de corante violeta tetrazolium D"Adicione diferentes antibióticos, incluindo Timentin, Ampicillin e Kanamycin à mídia para inibir o crescimento bacteriano. A mídia gorda e esta etapa devem ser omitidas de nutrientes, dependendo de cada tipo de placa. Suspenda a pelota e a nova mídia de torneira para uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro.Use placas de ensaio de matriz de compostos químicos, como fontes de carbono, fontes de nitrogênio, placas de fontes de fósforo e enxofre, e as fontes de nitrogênio peptídeo. Inocular 100 microliter adequado de mídia auto-contendo em cada poço das placas de ensaio. Certifique-se de duplicar os ensaios.Deve-se notar que, nesta fase, as células devem ser testadas com manchas gram-negativas antes e depois do ensaio para monitorar a contaminação bacteriana. Insira as placas de ensaio da área do composto químico no sistema de leitor de microplacas. Incubar todas as placas a 30 graus por até sete dias e programar o sistema de leitor de microplacas para ler a mudança de cor do corante a cada 15 minutos.Como a maioria dos leitores de microplaca não fornece uma fonte de luz contínua durante a incubação, as algas devem ser capazes de realizar respiração heterotrófica. Exporte os dados cinéticos brutos do leitor de microplacravuras como arquivos CSV, que posteriormente serão usados como entrada para o pacote de software de microarray fenótipo e nosso software. Para realizar a análise de dados de microarray do fenótipo, use o pacote de software micro Erik OPM do fenótipo OmniLog que é executado dentro do ambiente de software R.No estúdio R, a interface gráfica do usuário para R, instale o pacote OPM e suas dependências usando os comandos detalhados no manuscrito. Navegue até o diretório que contém os arquivos CSV dos dados cinéticos e importe os dados usando a função OPM de leitura. Os dados cinéticos podem ser agregados e discretizados usando estimativa de parâmetros pref.O uso da função XY plot permite que as medidas de respiração ou crescimento sejam mapeadas em função do tempo para as placas de 96 poços do ensaio. Os dados podem ser visualizados como um mapa de calor usando o gráfico de nível de função para permitir uma visão geral comparativa rápida dos dados cinéticos. O próximo passo é identificar as reações e genes associados aos novos metabólitos.No caso da presença de um modelo existente para as algas, a análise de dados do sistema de microarraia fenótipo pode ser usada para refinar este modelo. Aqui apresentamos o pipeline que usamos para o refinamento da rede metabólica em escala de genoma para o modelo Clalamydomonas usando dados de microarray fenótipo. Quando um novo teste composto positivo para utilização, os perfis de reação relevantes do composto são definidos usando base de conhecimento metabólico, fornecendo os números de comissão de enzimas associados.O primeiro passo é procurar Kegg e MetaCyc para identificar números de comissão de enzimas, CES, para reações usando metabolizados encontrados a partir das matrizes de compostos químicos. Em seguida, usamos os números de CE identificados como base de pesquisa em múltiplos recursos de anotação de algas disponíveis, como o Joint genome Institute, JGI, Phytozome e publicações revisadas por pares. As reações e metabólitos são adicionados ao modelo de rede metabólica Chlamydomonas reinhardtii baseado em COBRA, iRC1080, para expandir e refinar o modelo.Se não forem encontradas evidências genéticas em apoio ao número ce, uma pesquisa baseada em perfil, como o Iterativo Específico da Posição NCBI, NCBI PSI-BLAST, pode ser realizada para identificar genes candidatos associados à reação. Os resultados são então avaliados manualmente. Aqueles que passarem esta etapa QC com valores E inferiores a 0,05 por relevância para os números de EC de pesquisa, são então adicionados ao modelo métrico.A última etapa deste protocolo é refinar o modelo, avaliar e comparar os modelos. Use a mais recente caixa de ferramentas COBRA versão 3.0 e a plataforma MATLAB para realizar as etapas para o refinamento do modelo. Depois de instalar a caixa de ferramentas Cobra, você pode baixar o modelo iRC1080.Em seguida, no MATLAB, a primeira coisa a fazer é navegar até a pasta que contém o modelo de referência, iRC1080. Adicione as reações identificadas com seus genes associados ao modelo metabólico, como o iRC1080, usando as funções da caixa de ferramentas Cobra. Adicione reação e mude a associação genética.Navegue até o diretório que contém o modelo iRC1080 e execute os comandos para carregar o modelo. Renomeie-o e adicione uma nova reação e seu gene associado. Em alguns casos, quando o metabólito não é produzido intracelularmente, mas é retirado do meio, as reações de transporte para os novos metabólitos precisam ser adicionadas ao modelo usando a função de reação de adicionar/troca para inserir ou saída do metabólito para o meio extracelular.Teste o comportamento do novo resultado e modelo, por exemplo, iBD1106, realizando análise de equilíbrio de fluxo, FBA, utilizando a função otimizar o modelo cb em condições claras e escuras para a maximização da biomassa como função do objeto. Entre outros, a solução FBA produz três vetores os fluxos de reação, os preços da sombra metabólica e a reação reduziram os custos. Aqui, um exemplo é fornecido onde o modelo iRC1080 é comparado com sua versão refinada, iBD1106, obtendo os preços de sombra que representam a sensibilidade da função objetiva de biomassa para mudanças e metabólitos contabilizados em cada modelo.Aqui mostramos parcelas de respiração XY e parcelas de nível das fontes de carbono e fontes de nitrogênio assar placas para branco e CC-503 em cor teal e roxo, respectivamente. Dentro de cada poço, as curvas respiratórias representam a conversão de corante por redução em função do tempo. O pico destacado no painel A representa a detecção de acetato como a única fonte de carbono desta placa, que é consistente com a literatura de Clamídias.A comparação do número de metabólitos identificados utilizando três métodos diferentes, o iRC1080, que é o modelo metabólico clamídomonas bem curado, o tempo de cromatografia gasosa do voo GC-TOF, e o ensaio de microarraia do fenótipo mostram que apenas seis sobreposições metabólicas entre os três conjuntos, enquanto 149 eram comuns entre iRC1080 e o microarrato de fenótipo. Isso mostra que, embora cada tecnologia tenha uma força para a pesquisa de perfil metabólico, o conjunto de ensaios de microarray de fenótipo pode ser uma fonte significativa de novas informações metabólicas. As informações obtidas foram utilizadas para expandir e refinar o modelo de rede metabólica iRC1080.Aqui, comparamos o conteúdo do modelo iRC1080 e do modelo expandido iBD1106, incluindo o número de reações, número de metabólitos e número de genes. Mostramos que nosso modelo de refinação adicionou mais de 254 reações à nova rede resultante. Essas reações são classificadas em aminoácidos, dipeptídeos, tripeptídeos e reações de transporte.Os metabólitos recém-identificados foram utilizados para expansão da rede metabólica e refinamento do modelo metabólico chlamydomonas reinhardtii existente. Os ensaios de microarraia fenótipo podem ser usados para caracterizar fenótipos metabólicos de cepas existentes e recém-isoladas. Além disso, o protocolo que utilizamos no contexto das microálgas pode orientar o refinamento de modelos metabólicos de outras espécies.

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Biologia

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...