Name: high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae at JoVE.com

El mayor apoyo para este trabajo fue proporcionado por el Centro NYUAD de Genómica y Biología de Sistemas (CGSB), financiado por Tamkeen bajo la subvención del Instituto de Investigación abu Dhabi de la Universidad de Nueva York (73 71210 CGSB9) y los Fondos de Investigación de la Facultad de NYU Abu Dhabi (AD060). W.F. también fue apoyado por el Programa de los Cien Talentos de la Universidad de Zhejiang. Agradecemos a Ashish Jaiswal por su ayuda en la grabación del video. Agradecemos a Hong Cai por generar los datos del fenotipo metabólico.

1. Experimentos de microarrays de fenotipo
<ol><li>Obtenga la cepa CC-503 de C. reinhardtii del Centro de Recursos de Chlamydomonas de la Universidad de Minnesota, EE. UU. (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Cultive las células en medios frescos de Tris-Acetato-Fosfato (TAP)19 con concentraciones finales de 400 μg/ml de timentina, 50 μg/ml de ampicilina y 100 μg/ml de kanamicina (para inhibir el crecimiento bacteriano) por debajo de 400 fotones micromol/m2s, a 25 °C, durante dos días hasta la mitad de la fase logarítmica.</li>
	<li>Girar el cultivo a 2.000 x g durante 10 min a 22 °C y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.</li>
	<li>Preparar medios TAP frescos que contengan un colorante violeta de tetrazolio al 0,1% "D". NOTA: Modifique los medios TAP en este paso para excluir algunos nutrientes dependiendo de la categoría de metabolitos probada en cada placa (por ejemplo, excluya el cloruro de amonio para las placas fuente de nitrógeno).</li>
	<li>Resuspend el pellet en medios TAP frescos preparados (a partir del paso 1.2) a una concentración final de 1 x 106 células/ml.</li>
	<li>Utilice placas de ensayo de matriz de compuestos químicos (fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, placas de fuentes de fósforo y azufre, y las fuentes de nitrógeno peptídico).</li>
	<li>Inocular una alícuota de 100 μL de medios que contienen células en cada pozo de las placas de ensayo. NOTA: Asegúrese de duplicar los ensayos.</li>
	<li>Rayar las células en las placas de extracto de levadura / peptona y realizar tinción de gram, como en Smith et al. 20 antes y después del ensayo para controlar la contaminación bacteriana.</li>
	<li>Inserte las placas de ensayo de la matriz de compuestos químicos en el sistema lector de microplacas.</li>
	<li>Incubar todas las placas a 30 °C durante un total de 7 días y programar el sistema lector de microplacas para leer el cambio de color del tinte cada 15 min. NOTA: Como la mayoría de los lectores de microplacas no proporcionan una fuente de luz continua durante la incubación, las algas deben poder llevar a cabo la respiración heterótrofa.</li>
</ol>2. Análisis de datos
<ol><li>Exporte los datos cinéticos sin procesar del lector de microplacas como archivos CSV, que posteriormente se utilizarán como entrada al paquete Omnilog Phenotype Microarray (OPM) en R. Agregue la información biológica como metadatos (por ejemplo, designación de cepa, medios de crecimiento, temperatura, etc.).<ol>
<li>Uso del software de conversión de datos PM Kinetic; cargue los archivos de datos D5E y conviértalos en archivos OKA utilizando las siguientes líneas de comandos en el software de análisis cinético PM: Cargar | Importar (localice la carpeta de los archivos OKA) | Rellenar filtros | Importar | Añadir todas las placas | Cerrar. exportación | elija leer datos (Cinético), elija formato (CSV) (Encabezado tabulado)y elija placas (cada placa (Archivos individuales)) | Exportar datos | Salvar.
</li>
		<li>Para llevar a cabo el análisis de datos de Phenotype Microarray (PM), utilice el paquete de software OPM21,22 que se ejecuta dentro del entorno de software R. El paquete, el tutorial y la documentación de referencia están disponibles en: http://www.goeker.org/opm/. En RStudio, una interfaz gráfica de usuario para R, instale el paquete opm y sus dependencias mediante los siguientes comandos: fuente (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) biblioteca (opm)
</li>
		<li>Navegue hasta el directorio que contiene los archivos CSV de los datos cinéticos e importe los datos utilizando la funciónread_ opm: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
</li>
		<li>Agregue y discretize los datos cinéticos utilizando la estimación de parámetros de curva. Para (i en 1 :length(x)) { x[[i]] x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE) } #Collection de los metadatos metadatos <- collect_template(".") metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503") for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
</li>
		<li>Utilice la función xy_plot para mapear las mediciones de respiración (o crecimiento) (eje y) en función del tiempo (eje x) para las placas de 96 pociones ensayadas. print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
</li>
		<li>Visualice los datos como un mapa de calor utilizando la función level_plot para permitir una visión comparativa rápida de los datos cinéticos. level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Extraer información biológica importante, los parámetros de la curva, de las curvas cinéticas crudas e incluir la fase de retraso (λ), la tasa de crecimiento (μ), la respiración celular máxima (A) y el área bajo la curva (AUC)21. Para identificar metabolitos positivos, utilice los valores A del control negativo, que representa la reactividad abiótica del colorante con el medio, además del espacio en blanco de cada placa de microojo como valores de resta de fondo. La función de extracción se utiliza para obtener el parámetro A. opm_opt("curve.param") param <- extract (x, as.labels = list("Strain")))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identificación de reacciones y genes asociados a nuevos metabolitos
<ol><li>Búsqueda keGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) y MetaCyc (http://metacyc.org/) para identificar números de la Comisión de Enzimas (CE) para reacciones utilizando metabolitos encontrados en matrices de compuestos químicos23,2423,24.</li>
	<li>Utilice los números CE identificados como base de búsqueda en múltiples recursos de anotación de algas disponibles, como Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) y publicaciones revisadas por pares23,25,26,27.</li>
	<li>Si una consulta no devuelve evidencia genética para un número CE dado, identifique las proteínas asociadas relevantes en otros organismos, comenzando con las especies más cercanas a C. reinhardtii,luego realice una búsqueda basada en perfiles utilizando el servidor NCBI PSI-BLAST con la configuración predeterminada y use proteínas no redundantes (nr) en C. reinhardtii (taxid: 3055) para identificar genes candidatos asociados a la reacción12.</li>
	<li>Seleccionar manualmente los éxitos PSI-BLAST con valores E de < 0,05 para determinar la relevancia del número EC buscado mediante la consulta de esos aciertos BLAST a través de los servidores de predicción de dominios de proteínas EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) o InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Tenga en cuenta que los dos últimos escaneos son pasos críticos para garantizar la identificación de la actividad enzimática correcta para la proteína.</li>
</ol>4. Refinamiento y evaluación del modelo
<ol><li>Utilice la última versión de COBRA Toolbox v.3.028en MATLAB29,30plataforma para llevar a cabo los siguientes pasos para el refinamiento del modelo. COBRA Toolbox se puede instalar siguiendo los pasos de: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternativamente, tenga en cuenta que COBRA Toolbox también se implementa en otros lenguajes de programación de código abierto, como Python (COBRApy31) y está disponible en: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>Después de instalar COBRA Toolbox v.3.0, abra MATLAB y ejecute el siguiente comando para inicializar la caja de herramientas: initCobraToolbox;</li>
		<li>Agregue las reacciones identificadas con sus genes asociados al modelo metabólico, como iRC1080, utilizando las funciones cobra Toolbox addReaction y changeGeneAssociation. Navegue hasta el directorio que contiene el modelo iRC1080, descargado de http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 y ejecute los siguientes comandos para cargar el modelo, cambiarle el nombre y agregar una nueva reacción y su gen asociado. Carga('iRC 1080 .mat') modelNew = iRC 1080; modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]', ... 'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... «h[c]» },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ... «D-ALA 2», «au.g 14655 _t 1»);</li>
		<li>En algunos casos, cuando el metabolito no se produce intracelularmente, sino que se toma del medio, agregue reacciones de transporte para los nuevos metabolitos al modelo. Estas reacciones de transporte representan la difusión pasiva de un metabolito desde el medio extracelular al citosol. Además, agregue una reacción de intercambio artificial correspondiente utilizando la función addExchangeRxn para ingresar o emitir el metabolito en el medio extracelular. modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)' modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );</li>
		<li>Pruebe el comportamiento del nuevo modelo resultante, por ejemplo, iBD1106, realizando un análisis de balance de flujo (FBA) utilizando la función optimizeCbModel en condiciones de luz y oscuridad para la maximización de la biomasa como función objetivo. Para el crecimiento de la luz, establezca los límites inferior y superior de las reacciones de luz de la litografía solar PRISM en 646.07 (velocidad máxima). Para el crecimiento oscuro, establezca los límites de todas las reacciones de luz PRISM en cero. Utilice la función Biomasa definida previamente10 para el crecimiento en condiciones de oscuridad y luz. La solución de Logística de Amazon producirá dos vectores correspondientes a flujos de reacción (solution.v) y costes reducidos (solution.w), así como un vector correspondiente a los precios sombra de los metabolitos (solution.y). %Simular el crecimiento en condiciones de luz: modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... % «PRISM_solar_litho» , ... 'PRISM_solar_exo', ... 'PRISM_incandescent_ 60 W', ... 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ... 'PRISM_metal_halide', ... 'PRISM_high_pressure_sodium', ... 'PRISM_growth_room', ... 'PRISM_white_LED', ... 'PRISM_red_LED_array_ 653 nm' , ... 'PRISM_red_LED_ 674 nm' , ... 'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ... 'PRISM_design_growth', ... }, 0, 'b' ); modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');</li>
		<li>Repita el paso 4.1.4 para iRC1080 para comparar las soluciones de Logística de Amazon obtenidas para iBD1106 con las obtenidas para iRC1080.</li>
		<li>Hay una gama de métodos COBRA disponibles que se pueden utilizar para comparar modelos (por ejemplo, análisis de variabilidad de flujo, estudios de deleción de genes, análisis de robustez, predicciones de división de flujo, FBA, muestreo, etc.). Los tutoriales detallados se pueden encontrar en https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Aquí, se proporciona un ejemplo donde se compara el modelo iRC1080 con su versión refinada, iBD1106, obteniendo los precios sombra (sensibilidad de la función objetivo de biomasa a los cambios en la variable del sistema) de los metabolitos contabilizados en cada modelo. Obtener los precios sombra para los metabolitos: shadowPrices = table(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El fenotipado metabólico de la microalga verde, C. reinhardtii,se describió aquí utilizando placas de ensayo de PM de alto rendimiento y un PMI no modificado. Los ensayos se utilizaron para un total de 190 fuentes de carbono (PM01 y PM02), 95 fuentes de nitrógeno (PM03), 59 fuentes de fósforo y 35 fuentes de azufre (PM04), junto con fuentes de nitrógeno peptídico (PM06-08). Se observó respiración positiva para 148 nutrientes (un ensayo positivo para la utilización de la fuente C, cuatro ensayos positivos para cada utilización de la fuente S y la fuente P, y 139 ensayos positivos para la utilización de la fuente N). Los sustratos o nutrientes (carbono, nitrógeno, fósforo o azufre) del componente del medio no deben agregarse al medio definido cuando se aplican a las microplacas PM pertinentes que prueban cada una de esas fuentes.
El método que se muestra aquí es eficaz para caracterizar fenotipos de microalgas metabólicas que se pueden utilizar para ampliar los modelos de redes metabólicas existentes o dirigir la reconstrucción de nuevos modelos. Además, como no se conocen los requisitos nutricionales de la mayoría de las microalgas, esta plataforma se puede utilizar para definirlos rápidamente. Nelson et al. 43 había aplicado con éxito estos métodos para identificar nuevos compuestos que apoyan el crecimiento de la microalga Chloroidium sp. UTEX 3007 y utilizó la información obtenida para definir los metabolitos de entrada de especies, que, a diferencia de Chlamydomonas, incluyen 40 fuentes de carbono diferentes.
Una limitación importante del PM para perfilar microalgas es que el PMI no tiene iluminación en la cámara de incubación, y las microalgas deben poder llevar a cabo el metabolismo heterótrofo. La ausencia de luz podría afectar a la interpretación de modelos que incorporan luz para calcular los flujos metabólicos. Los pares de genes con funciones de coordinación han coevolucionado para constituir centros de redes metabólicas, y la distinción entre centros de red fotosintéticos y no fotosintéticos se puede hacer44. En general, los centros de red fotosintéticos (es decir, los nodos altamente conectados en el modelo) se dejarían fuera de los modelos heterótrofos. A efectos prácticos, el modelado del heterotrofio en especies mixotróficas debe omitir las reacciones que se sabe que son impulsadas por la luz y tener en cuenta las diferencias de equilibrio energético entre las condiciones. Por lo tanto, el modelado del metabolismo dependiente de la luz e independiente de la luz es una práctica estándar en el modelado metabólico de Chlamydomonas6,45.
Se sabe que algunas microalgas verdes, como Trebouxiophytes, asimilan una variedad de moléculas de carbono para el crecimiento, y se cree que esto surgió de su larga historia evolutiva como miembros de los líquenes46. Mientras que los clorofitos como Chlamydomonas pueden usar acetato para el crecimiento, la microalga marina marrón Tisochrysis lutea, conocida por su potencial para producir comercialmente ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga (VLC-PUFA), no puede usar acetato pero puede usar glicerol para el crecimiento47. La concentración de biomasa de más de 100 g l−1 peso de celda seca se ha logrado con Chlorella con adición optimizada de fuentes de carbono orgánico en un modo de lote alimentado48. Además, la adición de azúcar a Chlorellavulgaris puede elevar su secuestro de CO2, proporcionando así un beneficio aditivo durante el crecimiento fotosintético49. La mayoría de las microalgas heterótrofas también pueden crecer mixotróficamente, pero se ha demostrado que el clorofito Chromochloris zofingiensis apaga la fotosíntesis tras la adición de azúcar50.
Las diatomeas, pertenecientes a la división Bacillariophyta, son un grupo importante de fitoplancton. Aunque la mayoría de las diatomeas solo pueden crecer fotoautotróficamente, algunas de ellas se pueden cultivar mixotróficamente o heterótrofamente51. Por ejemplo, se encontró que el glicerol apoya el crecimiento en la luz en ausencia de CO2 en algunas diatomeas, incluida la especie modelo Phaeodactylum tricornutum52. Además, algunas diatomeas bentónicas como Nitzschia linearis pueden crecer con carbohidratos en la oscuridad53. Es probable que extienda los ensayos de PM a diatomeas y otros grupos de algas complementando fuentes de carbono orgánico adecuadas para permitir que las células crezcan heterótrofamente, y también se puede usar potencialmente una estrategia de mixotrofia para las microalgas autótrofas obligadas que proporcionan un suministro de luz mínimamente requerido.
Para evaluar la reproducibilidad de los datos, es muy recomendable realizar ensayos duplicados para todas las placas. Un ensayo sólo puede considerarse positivo si, después de restar el control negativo y los respectivos pozos en blanco, la absorbancia (valor PMI) es positiva. Esta descripción, en presencia del compuesto probado, es un reflejo de la reacción abiótica del colorante con el medio.

La optimización del metabolismo de las algas para una producción mejorada y estable de metabolitos específicos requiere el desarrollo de estrategias complejas de ingeniería metabólica a través de análisis a nivel de sistemas de redes metabólicas. Los modelos de redes metabólicas pueden guiar los diseños racionales para el rápido desarrollo de estrategias de optimización1,2,3,4. Aunque se han secuenciado aproximadamente 160 especies de microalgas5,sólo hay, hasta donde sabemos, sólo 44 modelos metabólicos de algas disponibles4,6,7. Debido a la dificultad de obtener datos fenotípicos metabólicos de alto rendimiento para la validación experimental de la información genómica, la reconstrucción de modelos de red de alta calidad está rezagada con respecto al rápido desarrollo de la secuenciación del genoma de algas.
C. reinhardtii es un sistema modelo atractivo para estudios basados en algas. Esta especie puede crecer fotoautótrofa o heterótrofamente y ha sido ampliamente utilizada como organismo modelo en investigación básica y aplicada. Su secuencia genómica fue publicada en 20078,con modelos metabólicos a escala genómica posteriormente reconstruidos para las especies9,10,11. El modelo a escala genómica de C. reinhardtii (iRC1080) fue reconstruido por Chang et al. 10 basado en evidencia genómica y bibliográfica (que implica ~ 250 fuentes). Tiene 1.706 metabolitos con 2.190 reacciones10; sin embargo, la integridad del modelo no pudo verificarse más allá de la evidencia experimental publicada disponible en ese momento.
La tecnología de microarrays de fenotipo (PMs) es una plataforma de alto rendimiento que puede proporcionar información de perfiles metabólicos para microorganismos heterótrofos, así como células de cultivo de tejidos. En particular, se puede utilizar para abordar la brecha de conocimiento de fenotipo a genotipo en microalgas, como se informó por primera vez para Chlamydomonas reinhardtii12 y posteriormente para una especie de Chloroidium13 y Chlorella14. Al estudiar las respuestas celulares a miles de metabolitos, moléculas de señalización, osmolitos y moléculas efectoras, los ensayos de PM pueden proporcionar perfiles metabólicos funcionales y ofrecer información sobre la función, el metabolismo y la sensibilidad ambiental15,16,17. Específicamente, los ensayos de PM detectan la utilización de metabolitos celulares en microplacas de 96 pozos con diferentes nutrientes, metabolitos u osmolitos contenidos en cada pozo. Además, también es posible ensayar moléculas bioactivas, como antibióticos y hormonas. Según lo determinado por la intensidad de la producción de color por la reducción de NADH de un colorante redox a base de tetrazolio, la utilización metabólica de los sustratos se evalúa en términos de respiración celular15,16,17. Los experimentos en microplacas de 96 pozos se pueden monitorear y determinar automáticamente a lo largo del tiempo con la plataforma de instrumento de microarrays de fenotipo (PMI). Veinte microplacas de 96 pozos están diseñadas para representar los metabolitos comunes para estudiar fenotipos celulares para utilizar fuentes de carbono, nitrógeno, azufre y fósforo, junto con diferentes efectos osmóticos / iónicos y de pH. La tecnología PM se ha utilizado con éxito para actualizar y actualizar una serie de modelos metabólicos a escala genómica existentes para microorganismos15,16,17,18.
El protocolo y los datos que se muestran aquí se basan en el trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12 El trabajo presentado detalla el uso del método de ensayo PM para caracterizar los fenotipos metabólicos de las microalgas y ampliar un modelo metabólico de algas existente de C. reinhardtii, así como para guiar la reconstrucción de nuevos modelos metabólicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog assay plates [ PM01-08]</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog Omnilog Instrument</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td>
			<td></td>
			<td>Regents of the University of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0408-EU-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium Violet Dye &#8220;D&#8221;</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td>
			<td>42010012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae

Los modelos metabólicos se reconstruyen en función de la anotación del genoma disponible de un organismo y proporcionan herramientas predictivas para estudiar los procesos metabólicos a nivel de sistemas. Los modelos metabólicos a escala genómica pueden incluir lagunas, así como reacciones que no se han verificado experimentalmente. Los modelos reconstruidos de especies de microalgas recientemente aisladas darán lugar a debilidades debido a estas brechas, ya que generalmente hay escasa evidencia bioquímica disponible para el metabolismo de dichos aislados. La tecnología de microarrays fenotipos (PM) es un método efectivo y de alto rendimiento que determina funcionalmente las actividades metabólicas celulares en respuesta a una amplia gama de metabolitos de entrada. La combinación de los ensayos fenotípicos de alto rendimiento con el modelado metabólico puede permitir que los modelos de redes metabólicas existentes se reconstruyan u optimicen rápidamente al proporcionar evidencia bioquímica para respaldar y expandir la evidencia genómica. Este trabajo mostrará el uso de ensayos de PM para el estudio de microalgas utilizando como ejemplo el modelo de microalgas verdes Chlamydomonas reinhardtii. La evidencia experimental de más de 254 reacciones obtenidas por PM se utilizó en este estudio para expandir y refinar un modelo de red metabólica de C. reinhardtii a escala genómica, iRC1080, en aproximadamente un 25 por ciento. El protocolo creado aquí se puede utilizar como base para perfilar funcionalmente el metabolismo de otras microalgas, incluidos los mutantes de microalgas conocidos y los nuevos aislados.

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High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Este protocolo demuestra el uso de una plataforma tecnológica de microarrays fenotipos (PM) para definir los requisitos metabólicos de Chlamydomonas reinhardtii, una microalga verde, y refinar un modelo de red metabólica existente.

Perfiles metabólicos de alto rendimiento para refinamientos de modelos de microalgas

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

La tecnología de micro-matriz de fenotipo es un método efectivo de alto rendimiento que determina funcionalmente las actividades metabólicas celulares en respuesta a una amplia gama de metabolitos de entrada. La utilización en esta tecnología se mide en forma de respiración celular determinada por la cantidad de desarrollo de color producido por la reducción de NADH de un colorante redox a base de tetrazolio. En este trabajo, introduciremos el uso de ensayos de micro matriz de fenotipo en el contexto de microalgas utilizando especies modelo Chlamydomonas reinhardtii.El objetivo de este estudio es establecer un método confiable para caracterizar el fenotipado metabólico de microalgas que se pueda utilizar para expandir los modelos de redes metabólicas de algas existentes o guiar la reconstrucción de nuevos modelos. La cepa CC-503 de Chlamydomonas reinhardtii se puede obtener en el centro de recursos de Chlamydomonas de la Universidad de Minnesota, Estados Unidos. Cultive las células en medios de grasa de fosfato de tris-acetato frescos hasta la fase de registro medio.Revise las células bajo el microscopio para asegurarse de que estén en buena forma y sin ninguna contaminación. Gira hacia abajo la cultura a 2000 G-force durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet.Prepare medios de grifo frescos que contengan un colorante violeta D de tetrazolio al 0.1% Agregue diferentes antibióticos, incluidos Timentin, Ampicilina y Kanamicina a los medios para inhibir el crecimiento bacteriano. Los medios de grasa y este paso deben omitirse de los nutrientes, dependiendo de cada tipo de placa. Vuelva a suspender el pellet y el medio fresco del grifo a una concentración final de 1 millón de células por mililitro.Use placas de ensayo de matriz de compuestos químicos, como fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, placas de fuentes de fósforo y azufre, y las fuentes de nitrógeno peptídico. Inocular 100 microlitros adecuados de medios autocontenentes en cada pozo de las placas de ensayo. Asegúrese de duplicar los ensayos.Cabe señalar que en esta etapa, las células deben analizarse con tinción gramnegativa antes y después del ensayo para monitorear la contaminación bacteriana. Inserte las placas de ensayo de área de compuestos químicos en el sistema lector de microplacas. Incuba todas las placas a 30 grados durante un total de siete días y programa el sistema lector de microplacas para leer el cambio de color del tinte cada 15 minutos.Como la mayoría de los lectores de microplacas no proporcionan una fuente de luz continua durante la incubación, las algas deberían poder llevar a cabo la respiración heterótrofa. Exporte los datos cinéticos sin procesar del lector de microplacas como archivos CSV, que posteriormente se utilizarán como entrada al paquete de software de microarrays de fenotipo y nuestro software. Para llevar a cabo el análisis de datos de microarrays de fenotipo, utilice el paquete de software OmniLog phenotype micro Erik OPM que se ejecuta dentro del entorno de software R.En R studio, la interfaz gráfica de usuario para R, instale el paquete OPM y sus dependencias utilizando los comandos detallados en el manuscrito. Desplácese hasta el directorio que contiene los archivos CSV de los datos cinéticos e importe los datos mediante la función OPM de lectura. Los datos cinéticos se pueden agregar y discretizar utilizando la estimación de parámetros pref.El uso de la gráfica de función XY permite mapear las mediciones de respiración o crecimiento en función del tiempo para las placas de ensayo de 96 podos. Los datos se pueden visualizar como un mapa de calor utilizando el gráfico de nivel de función para permitir una visión comparativa rápida de los datos cinéticos. El siguiente paso es identificar las reacciones y los genes asociados con los nuevos metabolitos.En caso de presencia de un modelo existente para las algas, el análisis de datos del sistema de microarrays fenotipo se puede utilizar para refinar este modelo. Aquí presentamos la tubería que utilizamos para el refinamiento de la red metabólica a escala genómica para el modelo Chlamydomonas utilizando datos de microarrays de fenotipo. Cuando un nuevo compuesto da positivo para su utilización, los perfiles de reacción relevantes del compuesto se definen utilizando la base de conocimiento metabólico, proporcionando los números de comisión de enzimas asociados.El primer paso es buscar en Kegg y MetaCyc para identificar los números de comisión de enzimas, CE, para las reacciones utilizando metabolizados encontrados de las matrices de compuestos químicos. A continuación, utilizamos los números CE identificados como base de búsqueda en múltiples recursos de anotación de algas disponibles, como el Instituto del Genoma Conjunto, JGI, Phytozome y publicaciones revisadas por pares. Las reacciones y metabolitos se agregan al modelo de red metabólica Chlamydomonas reinhardtii basado en COBRA, iRC1080, para expandir y refinar el modelo.Si no se encuentra evidencia genética que respalde el número EC, se puede realizar una búsqueda basada en perfiles como NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, para identificar genes candidatos asociados con la reacción. Los resultados se evalúan manualmente. Aquellos que pasan este paso de control de calidad con valores E inferiores a 0.05 para la relevancia de los números EC de búsqueda, se agregan al modelo métrico.El último paso de este protocolo es refinar el modelo, evaluar y comparar los modelos. Utilice la última versión 3.0 de la caja de herramientas COBRA y la plataforma MATLAB para llevar a cabo los pasos para el refinamiento del modelo. Después de instalar la caja de herramientas cobra, puede descargar el modelo iRC1080.Luego, en MATLAB, lo primero que debe hacer es navegar a la carpeta que contiene el modelo de referencia, iRC1080. Agregue las reacciones identificadas con sus genes asociados al modelo metabólico, como iRC1080, utilizando las funciones de la caja de herramientas Cobra. Agregue la reacción y cambie la asociación de genes.Desplácese hasta el directorio que contiene el modelo iRC1080 y ejecute los comandos para cargar el modelo. Cámbiele el nombre y agregue una nueva reacción y su gen asociado. En algunos casos, cuando el metabolito no se produce intracelularmente, sino que se toma del medio, las reacciones de transporte para los nuevos metabolitos deben agregarse al modelo utilizando la función de reacción de adición / intercambio para ingresar o emitir el metabolito en el medio extracelular.Pruebe el comportamiento del nuevo resultado y modelo, por ejemplo, iBD1106, realizando análisis de balance de flujo, FBA, utilizando la función optimizar el modelo CB en condiciones de luz y oscuridad para la maximización de la biomasa como función objeto. Entre otros, la solución de Logística de Amazon produce tres vectores: los flujos de reacción, los precios sombra del metabolito y los costos reducidos de reacción. Aquí, se proporciona un ejemplo donde el modelo iRC1080 se compara con su versión refinada, iBD1106, obteniendo los precios sombra que representan la sensibilidad de la función objetivo de biomasa a los cambios y metabolitos contabilizados en cada modelo.Aquí mostramos gráficos de respiración XY y diagramas de nivel de las fuentes de carbono y las placas de ensayo de fuentes de nitrógeno para blanco y CC-503 en color verde azulado y púrpura, respectivamente. Dentro de cada pozo, las curvas de respiración representan la conversión del tinte por reducción en función del tiempo. El pico resaltado en el panel A representa la detección de acetato como la única fuente de carbono de esta placa, lo que es consistente con la literatura de Chlamydomonas.La comparación del número de metabolitos identificados utilizando tres métodos diferentes, iRC1080, que es el modelo metabólico de Chlamydomonas bien curado, el tiempo de cromatografía de gases de vuelo GC-TOF y el ensayo de microarrays de fenotipo muestra que solo seis metabolitos se superponen entre los tres conjuntos, mientras que 149 fueron comunes entre iRC1080 y el conjunto de ensayos de microarrays de fenotipo. Esto muestra que, si bien cada tecnología tiene una fortaleza hacia la investigación de perfiles metabólicos, el conjunto de ensayos de microarrays de fenotipo puede ser una fuente significativa de nueva información metabólica. La información obtenida se utilizó para ampliar y refinar el modelo de red metabólica iRC1080.Aquí, comparamos el contenido del modelo iRC1080 y el modelo expandido iBD1106, incluyendo el número de reacciones, el número de metabolitos y el número de genes. Mostramos que nuestra refinación de modelos agregó más de 254 reacciones a la nueva red resultante. Estas reacciones se clasifican en aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos y reacciones de transporte.Los metabolitos recientemente identificados se utilizaron para la expansión de la red metabólica y el refinamiento del modelo metabólico existente de Chlamydomonas reinhardtii. Los ensayos de microarrays de fenotipo se pueden utilizar para caracterizar fenotipos metabólicos de cepas existentes y recientemente aisladas. Además, el protocolo que utilizamos en el contexto de las microalgas puede guiar el refinamiento de modelos metabólicos de otras especies.

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Investigación

Biología

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Recuperación de adultos de pez cebra Corazones para aplicaciones de alto rendimiento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias