Name: high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae at JoVE.com

Stort stöd för detta arbete tillhandahölls av NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), finansierat av Tamkeen under New York University Abu Dhabi Research Institute grant (73 71210 CGSB9) och NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. stöttades dessutom av hundratalangprogram av Zhejiang universitetar. Vi tackar Ashish Jaiswal för hjälpen med att spela in videon. Vi tackar Hong Cai för att generera metaboliska fenotypdata.

1. Phenotype Microarray Experiment
<ol><li>Få C. reinhardtii stam CC-503 från Chlamydomonas Resource Center vid University of Minnesota, USA (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Odla cellerna i färska Tris-Acetat-Fosfat (TAP) media19 med slutliga koncentrationer av 400 μg/mL timentin, 50 μg/mL ampicillin och 100 μg/mL kanamycin (för att hämma bakterietillväxt) under 400 mikromol fotoner/m2s, vid 25 °C, i två dagar till mitten av stockfasen.</li>
	<li>Snurra ner kulturen vid 2 000 x g i 10 min vid 22 °C och kassera supernatanten utan att störa pelleten.</li>
	<li>Förbered färska TAP-medier som innehåller 0,1% tetrazoliumviolett färgämne "D". OBS: Ändra TAP-media i detta steg för att utesluta vissa näringsämnen beroende på den metabolitkategori som testas i varje platta (t.ex. uteslut ammoniumklorid för kvävekällaplattor).</li>
	<li>Återsuspendera pelleten i färska TAP-medier beredda (från steg 1.2) till en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/ml.</li>
	<li>Använd kemiska sammansatta matrisanalysplattor (kolkällor, kvävekällor, fosfor- och svavelkällor och peptidkvävekällorna).</li>
	<li>Inokulera en 100 μL alikvot cellinnehållande media i varje brunn på analysplattorna. OBS: Se till att duplicera analyserna.</li>
	<li>Strimmor på jästextrakt/peptonplattor och utför gramfärgning, som i Smith m.fl. 20 före och efter analysen för att övervaka bakteriell förorening.</li>
	<li>För in de kemiska sammansatta matrisanalysplattorna i mikroplattans avläsarsystem.</li>
	<li>Inkubera alla plattor vid 30 °C i upp till 7 dagar och programmera mikroplattans avläsarsystem att läsa färgförändringen var 15:e minut. OBS: Eftersom de flesta mikroplatta läsare inte ger en källa till kontinuerligt ljus under inkubation, algerna bör kunna utföra heterotrofisk andning.</li>
</ol>2. Dataanalys
<ol><li>Exportera de råa kinetiska data från mikroplateläsaren som CSV-filer, som därefter kommer att användas som indata till Omnilog Phenotype Microarray (OPM) -paketet i R. Lägg till den biologiska informationen som metadata (t.ex. stambeteckning, tillväxtmedier, temperatur etc.).<ol>
<li>Använda PM Kinetic datakonverterare programvara; läs in D5E-datafilerna och konvertera dem till OKA-filer med hjälp av följande kommandorader i PM kinetiska analysprogramvaran: Läs in | Importera (leta reda på mappen för OKA-filerna) | Fyll filter | Importera | Lägg till alla tallrikar | Stänga. Exportera | välj läsdata (Kinetic), välj format (CSV) (tabulthuvud)och välj skyltar (varje platta (enskilda filer)) | Exportera data | Spara.
</li>
		<li>För att utföra Phenotype Microarray (PM) dataanalys, använd OPM-programvarupaketet21,22 som körs i R-programvarumiljön. Paketet, självstudien och referensdokumentationen finns på: http://www.goeker.org/opm/. I RStudio, ett grafiskt användargränssnitt för R, installerar du opm-paketet och dess beroenden med följande kommandon: källa (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) bibliotek (opm)
</li>
		<li>Navigera till katalogen som innehåller CSV-filerna för kinetiska data och importera data med hjälp av funktionen read_opm: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
</li>
		<li>Aggregera och diskretisera kinetiska data med hjälp av uppskattning av kurvparameter. För (i i 1 :length(x)) { x[i]] <Jag gör _aggre(x[i]], boot = 0 L, kärnor = 1 L, metod ="splines", alternativ = set_spline_options("smooth.spline")) x[i]] <- do_disc(x[i]], cutoff = FALSE) } #Collection metadata metadata <- collect_template(".) metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503") för (I i 1:length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
</li>
		<li>Använd funktionen xy_plot för att kartlägga andningsmätningarna (eller tillväxtmätningarna) (y-axeln) som en funktion av tid (x-axel) för de belagda 96-brunnsplattorna. skriva ut (xy_plot(x[[ 1 ]], inkludera ="Stam", teor.max = FALSKT))
</li>
		<li>Visualisera data som en värmekarta med hjälp av funktionen level_plot för att möjliggöra en snabb jämförande översikt över de kinetiska data. level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0,7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Extrahera viktig biologisk information, kurvparametrarna, från de råa kinetiska kurvorna och inkludera fördröjningsfasen (λ), tillväxthastigheten (μ), maximal cellandning (A) och området under kurvan (AUC)21. För att identifiera positiva metaboliter, använd A-värdena för den negativa kontrollen, som representerar färgämnets abiotiska reaktivitet med mediet, förutom luckan för varje mikrobrunnplatta som bakgrundsretraktionsvärden. Extraktfunktionen används för att hämta A-parametern. opm_opt("curve.param") param <- extrakt (x, as.labels = list("Stam")))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifiering av reaktioner och gener associerade med nya metaboliter
<ol><li>Sök i KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) och MetaCyc (http://metacyc.org/) för att identifiera enzymkommissionens nummer (ECs) för reaktioner med hjälp av metaboliter som finns från kemiska sammansatta matriser23,2423,24.</li>
	<li>Använd de identifierade EG-numren som sökunderlag i flera tillgängliga algnotationsresurser som Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) och peer-reviewed publikationer23,25,26,27.</li>
	<li>Om en fråga inte returnerar några genetiska bevis för ett visst EG-nummer, identifiera relevanta associerade proteiner i andra organismer, med början med arter närmast C. reinhardtii, utför sedan en profilbaserad sökning med NCBI PSI-BLAST-servern med standardinställningar och använd icke-redundanta proteiner (nr) i C. reinhardtii (taxid:3055) för att identifiera kandidatgener som är associerade med reaktionen12.</li>
	<li>Kurera PSI-BLAST-träffar manuellt med E-värden på < 0,05 för relevans för det sökta EG-numret genom att fråga dessa BLAST-träffar via EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) eller InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) proteindomänförutsägelseservrar. Observera att de två senare skanningarna är kritiska steg för att säkerställa identifieringen av rätt enzymatisk aktivitet för proteinet.</li>
</ol>4. Modellförfining och utvärdering
<ol><li>Använd den senaste COBRA Toolbox v.3.028i MATLAB29,30plattform för att utföra följande steg för modellförfining. COBRA Toolbox kan installeras genom att följa stegen i: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternativt kan du notera att COBRA Toolbox också implementeras över andra programmeringsspråk med öppen källkod, till exempel Python (COBRApy31) och finns på: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>När du har installerat COBRA Toolbox v.3.0 öppnar du MATLAB och kör följande kommando för att initiera verktygslådan: initCobraToolbox;</li>
		<li>Lägg till de identifierade reaktionerna med tillhörande gener till den metaboliska modellen, till exempel iRC1080, med hjälp av COBRA Toolbox-funktionerna addReaction och changeGeneAssociation. Navigera till katalogen som innehåller iRC1080-modellen, hämtas från http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 och kör följande kommandon för att läsa in modellen, byta namn på den och lägga till en ny reaktion och dess associerade gen. Belastning('iRC 1080 .mat') modelNew = iRC 1080; modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2', ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... "D-aladata[c]" , "adp[c]" , "pi[c]" , ... "h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ... D-ALA 2, a.g 14655 _t 1).</li>
		<li>I vissa fall när metaboliten inte produceras intracellulärt utan tas upp från mediet, tillsätt transportreaktioner för de nya metaboliterna till modellen. Dessa transportreaktioner representerar passiv diffusion av en metabolit från det extracellulära mediet till cytosolen. Lägg dessutom till en motsvarande artificiell utbytesreaktion med hjälp av funktionen addExchangeRxn för att mata in eller mata ut metaboliten i det extracellulära mediet. modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)' modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );</li>
		<li>Testa beteendet hos den nya resulterande modellen, t.ex. iBD1106, genom att utföra flödesbalansanalys (FBA) med hjälp av funktionen optimizeCbModel under ljusa och mörka förhållanden för maximering av biomassa som objektiv funktion. För ljus tillväxt, ställ in de nedre och övre gränserna för PRISM solar lithos ljusreaktioner på 646,07 (maximal hastighet). För mörk tillväxt ställer du in gränserna för alla PRISM-ljusreaktioner på noll. Använd funktionen Biomassa som tidigare definierats10 för tillväxt under mörka och ljusa förhållanden. FBA-lösningen kommer att producera två vektorer som motsvarar reaktionsflöde (solution.v) och minskad kostnad (solution.w), samt en vektor som motsvarar metaboliternas skuggpriser (lösning.y). %Simulera tillväxt i ljust skick: modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... % "PRISM_solar_litho", ... "PRISM_solar_exo", ... "PRISM_incandescent_ 60 W" ... "PRISM_fluorescent_cool_ 215 W" , ... "PRISM_metal_halide", ... "PRISM_high_pressure_sodium" ... "PRISM_growth_room", ... "PRISM_white_LED" ... "PRISM_red_LED_array_ 653 nm", ... "PRISM_red_LED_ 674 nm", ... "PRISM_fluorescent_warm_ 18 W" ... "PRISM_design_growth", ... }, 0, "b" ). modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');</li>
		<li>Upprepa steg 4.1.4 för iRC1080 för att jämföra FBA-lösningar som erhållits för iBD1106 med de som erhållits för iRC1080.</li>
		<li>Det finns en rad COBRA-metoder tillgängliga som kan användas för att jämföra modeller (t.ex. flödesvariationsanalys, genborttagningsstudier, robusthetsanalyser, fluxdelningsprognoser, FBA, provtagning etc.). Detaljerade handledningar finns på https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Här ges ett exempel där iRC1080-modellen jämförs med dess raffinerade version, iBD1106, genom att erhålla skuggpriserna (känsligheten hos biomassamålfunktionen för förändringar i systemvariabeln) för de metaboliter som redovisas i varje modell. Få skuggpriserna för metaboliterna: shadowPrices = table(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Metabolisk fenotypning av den gröna microalga, C. reinhardtii, beskrevs här med hjälp av hög genomströmning PM analys plattor och en oförändrad PMI. Testerna användes för totalt 190 kolkällor (PM01 och PM02), 95 kvävekällor (PM03), 59 fosforkällor och 35 svavelkällor (PM04), tillsammans med peptidkvävekällor (PM06-08). Positiv andning observerades för 148 näringsämnen (en positiv analys för användning av C-källor, fyra positiva analyser för varje användning av S-källan och P-källan och 139 positiva analyser för användning av N-källor). Mediets substrat eller näringsämnen (kol, kväve, fosfor eller svavel) bör inte tillsättas det definierade mediet när de appliceras på de relevanta PM-mikroplattor som testar för var och en av dessa källor.
Metoden som visas här är effektiv för att karakterisera metaboliska mikroalgerfenotyper som kan användas för att utöka befintliga metaboliska nätverksmodeller eller styra återuppbyggnaden av nya modeller. Vidare, eftersom näringsbehoven hos de flesta mikroalger inte är kända, kan denna plattform användas för att definiera dessa snabbt. Nelson et al. 43 hade framgångsrikt tillämpat dessa metoder för att identifiera nya föreningar som stöder tillväxten av mikroalger Chloroidium sp. UTEX 3007 och använt den erhållna informationen för att definiera artinträdemetaboliter, som till skillnad från Chlamydomonas omfattar 40 olika kolkällor.
En viktig begränsning av pm för profilering av mikroalger är att PMI inte har någon belysning i inkubationskammaren, och mikroalger måste kunna utföra heterotrofisk metabolism. Frånvaron av ljus kan påverka tolkningen av modeller som innehåller ljus för att beräkna metaboliska flöden. Genpar med koordinerande funktioner har utvecklats tillsammans för att utgöra metaboliska nätverkshubbar, och skillnaden mellan fotosyntetiska och icke-fotosyntetiska nätverkshubbar kan göras44. I allmänhet skulle fotosyntetiska nätverkshubbar (dvs. höganslutna noder i modellen) utelämnas från heterotrofa modeller. För praktiska ändamål bör modellering av heterotrofiism hos mixotrofiska arter utelämna reaktioner som är kända för att drivas av ljus och ta hänsyn till energibalansskillnaderna mellan förhållandena. Således är modellering av ljusberoende och ljusoberoende metabolism standardpraxis i Chlamydomonas metabolisk modellering6,45.
Vissa gröna mikroalger, som Trebouxiophytes, är kända för att assimilera en mängd olika kolmolekyler för tillväxt, och detta tros ha uppstått från deras långa evolutionära historia som medlemmar i lavar46. Medan klorofyller som Chlamydomonas kan använda acetat för tillväxt, den bruna marina mikroalga Tisochrysis lutea, känd för sin potential att kommersiellt producera mycket långkedjiga fleromättade fettsyror (VLC-PUFAs), kan inte använda acetat men kan använda glycerol för tillväxt47. Biomassakoncentration på mer än 100 g l−1 torrcellsvikt har uppnåtts med Chlorella med optimerad tillsats av organiska kolkällor i fed-batch-läge48. Vidare kan tillsats av socker till Chlorellavulgaris höja dess bindning av CO2, vilket ger en additiv fördel under fotosyntetisk tillväxt49. De flesta heterotrofa mikroalger kan också växa mixotrohically, men klorofyllen Chromochloris zofingiensis har visat sig stänga av fotosyntes vid tillsats av socker50.
Diatomer, som tillhör divisionen Bacillariophyta, är en stor grupp fytoplankton. Även om de flesta diatomer bara kan växa fotoautotrophically, kan några av dem odlas mixotrophically eller heterotrophically51. Till exempel, glycerol konstaterades stödja tillväxt i ljuset i avsaknad av CO2 i vissa kiselalger, inklusive modellarten Phaeodactylum tricornutum52. Vissa benthic diatoms som Nitzschia linearis kan också växa på kolhydrater i mörkret53. Det är sannolikt att utvidga PM-analyserna till diatomer och andra alggrupper genom att komplettera lämpliga organiska kolkällor för att cellerna ska kunna växa heterotrofiiskt, och en mixotrofistrategi kan också potentiellt användas för den obligatoriska autotrofiska mikroalger som ger en minimalt nödvändig ljustillförsel.
För att bedöma uppgifternas reproducerbarhet rekommenderas det starkt att duplicerade analyser utförs för alla plattor. En analys kan endast anses vara positiv om absorbansen (PMI-värdet) är positiv efter subtraktion från den negativa kontrollen och respektive blanka brunnar. Denna beskrivning, i närvaro av den testade föreningen, är en återspegling av färgämnets abiotiska reaktion med mediet.

Optimering av algmetabolism för förbättrad och stabil produktion av riktade metaboliter kräver utveckling av komplexa metaboliska tekniska strategier genom systemnivåanalyser av metaboliska nätverk. Metaboliska nätverksmodeller kan vägleda de rationella designerna för snabb utveckling av optimeringsstrategier1,2,3,4. Även om cirka 160 mikroalgala arter harsekvenserats 5, finns det enligt vår kunskap endast 44 algmetaboliska modeller tillgängliga4,6,7. På grund av svårigheten att erhålla metaboliska fenotypiska data med hög genomströmning för experimentell validering av genomisk information ligger återuppbyggnaden av högkvalitativa nätverksmodeller efter den snabba utvecklingen av alggenomsekvensering.
C. reinhardtii är ett attraktivt modellsystem för algbaserade studier. Denna art kan växa fotoautotrophically eller heterotrophically och har använts i stor utsträckning som en modellorganism i grundläggande och tillämpad forskning. Dess genomsekvens publicerades 20078, med genomskalade metaboliska modeller som senare rekonstruerades för arten9,10,11. Genomskalan för C. reinhardtii (iRC1080) rekonstruerades av Chang et al. 10 baserat på genomiska och litteraturbevis (med ~250 källor). Den har 1 706 metaboliter med 2 190 reaktioner10; Modellens fullständighet kunde dock inte kontrolleras utöver de tillgängliga offentliggjorda experimentella bevisen vid den tidpunkten.
Fenotypmikroarrays (PMs) teknik är en plattform med hög genomströmning som kan ge metabolisk profileringsinformation för heterotrofa mikroorganismer samt vävnadskulturceller. I synnerhet kan det användas för att ta itu med kunskapsgapet fenotyp till genotyp i mikroalger, som först rapporterades för Chlamydomonas reinhardtii12 och därefter för en art av kloroidium13 och Chlorella14. Genom att studera cellsvar på tusentals metaboliter, signalmolekyler, osmolyter och effektormolekyler kan PM-analyserna ge funktionell metabolisk profilering och ge insikter om funktion, metabolism och miljökänslighet15,16,17. Specifikt detekterar PM-analyser cellers metabolitanvändning i 96-brunns mikroplattor med olika näringsämnen, metaboliter eller osmolyter som finns i varje brunn. Dessutom är det också möjligt att analysera bioaktiva molekyler, såsom antibiotika och hormoner. Som bestäms av färgproduktionens intensitet genom NADH-reduktionen av ett tetrazoliumbaserat redoxfärgämne utvärderas det metaboliska utnyttjandet av substrat i termer av cellandning15,16,17. Experimenten i 96-brunnsmikroplattor kan övervakas och bestämmas automatiskt över tid med plattformen för fenotypmikroarrayinstrument (PMI). Tjugo 96-brunns mikroplattor är utformade för att representera de vanliga uppsättningen metaboliter för att studera cellulära fenotyper för att använda kol-, kväve-, svavel- och fosforkällor, tillsammans med olika osmotiska / jon- och pH-effekter. PM-tekniken har framgångsrikt använts för att uppdatera och uppgradera ett antal befintliga genomskalade metaboliska modeller för mikroorganismer15,16,17,18.
Protokollet och data som visas här är baserade på tidigare publicerade verk av Chaiboonchoe et al. 12 Det presenterade arbetet beskriver användningen av PM-analysmetoden för att karakterisera de metaboliska fenotyperna av mikroalger och för att utöka en befintlig algmetabolisk modell av C. reinhardtii samt för att vägleda återuppbyggnaden av nya metaboliska modeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog assay plates [ PM01-08]</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog Omnilog Instrument</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td>
			<td></td>
			<td>Regents of the University of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0408-EU-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium Violet Dye &#8220;D&#8221;</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td>
			<td>42010012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae

Metaboliska modeller rekonstrueras baserat på en organisms tillgängliga genomanotering och ger prediktiva verktyg för att studera metaboliska processer på systemnivå. Genomskalade metaboliska modeller kan inkludera luckor samt reaktioner som är overifierade experimentellt. Rekonstruerade modeller av nyligen isolerade mikroalgala arter kommer att resultera i svagheter på grund av dessa luckor, eftersom det vanligtvis finns glesa biokemiska bevis tillgängliga för metabolismen av sådana isolat. Fenotypmikroarray (PM) teknik är en effektiv, hög genomströmning metod som funktionellt bestämmer cellulära metaboliska aktiviteter som svar på ett brett spektrum av inträde metaboliter. Kombinera hög genomströmning fenotypiska analyser med metabolisk modellering kan göra det möjligt för befintliga metaboliska nätverksmodeller att snabbt rekonstrueras eller optimeras genom att tillhandahålla biokemiska bevis för att stödja och expandera genomiska bevis. Detta arbete kommer att visa användningen av PM-analyser för studier av mikroalger genom att använda den gröna mikroalgala modellarten Chlamydomonas reinhardtii som exempel. Experimentella bevis för över 254 reaktioner erhållna av PM användes i denna studie för att expandera och förfina en genomskala C. reinhardtii metabolisk nätverksmodell, iRC1080, med cirka 25 procent. Protokollet som skapas här kan användas som grund för funktionell profilering av metabolismen av andra mikroalger, inklusive kända mikroalgermutanter och nya isolat.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae at JoVE.com

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Detta protokoll visar användningen av en fenotyp microarray (PM) teknik plattform för att definiera metaboliska krav av Chlamydomonas reinhardtii, en grön microalga, och förfina en befintlig metabolisk nätverksmodell.

Metabolisk profilering med hög genomströmning för modellförbättringar av mikroalger

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

Fenotyp mikro-matris teknik är en effektiv high-throughput metod som funktionellt bestämmer cellulära metaboliska aktiviteter som svar på ett brett spektrum av inträde metaboliter. Användningen i denna teknik mäts i form av cellulär andning som bestäms av mängden färgutveckling som produceras av NADH-reduktionen av ett tetrazoliumbaserat redoxfärgämne. I detta arbete kommer vi att introducera användningen av fenotyp mikro matrisanalyser i samband med mikroalger med hjälp av modellarten Chlamydomonas reinhardtii.Målet med denna studie är att etablera en tillförlitlig metod för att karakterisera metabolisk fenotypning av mikroalger som kan användas för att utöka befintliga algmetaboliska nätverksmodeller eller vägleda återuppbyggnaden av nya modeller. Chlamydomonas reinhardtii stam CC-503 kan erhållas från Chlamydomonas resurscenter vid University of Minnesota USA. Odla cellerna i färska trisacetatfosfatfettmedier till mitten av stockfasen.Kontrollera cellerna under mikroskopet för att se till att de är i gott skick och utan förorening. Snurra ner kulturen vid 2000 G-kraft i 10 minuter. Kassera supernatanten utan att störa pelleten.Förbered färska kranmedier som innehåller 0,1%tetrazoliumviolett färgämne D"Tillsätt olika antibiotika inklusive Timentin, Ampicillin och Kanamycin till media för att hämma bakterietillväxten. Fettmedia och detta steg bör utelämnas från näringsämnen, beroende på varje tallrikstyp. Suspendera pelleten och det färska kranmediet till en slutlig koncentration av 1 miljon celler per milliliter.Använd kemiska sammansatta matris assay plattor, såsom kolkällor, kvävekällor, fosfor, och svavel källor plattor, och peptid kväve källor. Inokulera 100 mikroliter tillräcklig av fristående media i varje brunn av uppsatsplattorna. Se till att duplicera analyserna.Det bör noteras att celler i detta skede bör testas med gramnegativ färgning före och efter analysen för att övervaka bakteriell förorening. För in de kemiska sammansatta områdesanalysplattorna i mikroplattans avläsarsystem. Inkubera alla plattor i 30 grader i upp till sju dagar och programmera mikroplattans avläsarsystem för att läsa färgförändringen var 15: e minut.Eftersom de flesta mikroplatta läsare inte ger en källa till kontinuerligt ljus under inkubation, algerna bör kunna utföra heterotrofisk andning. Exportera de råa kinetiska data från mikroplate läsaren som CSV filer, som därefter kommer att användas som inmatning till fenotyp microarray mjukvarupaketet och vår programvara. För att utföra fenotyp microarray data analys, använd OmniLog fenotyp micro Erik OPM mjukvarupaket som körs inom R-programvarumiljön.I R-studion installerar det grafiska användargränssnittet för R OPM-paketet och dess beroenden med hjälp av kommandona som beskrivs i manuskriptet. Navigera till katalogen som innehåller CSV-filerna för de kinetiska data och importera data med hjälp av funktionen läs-OPM. De kinetiska data kan aggregeras och diskretiseras med hjälp av pref parameter uppskattning.Med hjälp av funktionen XY-brytningen kan andnings- eller tillväxtmätningarna kartläggas som en funktion av tiden för analysplattorna med 96 brunnar. Data kan visualiseras som en värmekarta med hjälp av funktionsnivådiagrammet för att möjliggöra en snabb jämförande översikt över de kinetiska data. Nästa steg är att identifiera de reaktioner och gener som är förknippade med de nya metaboliterna.Vid förekomst av en befintlig modell för algerna kan dataanalysen från fenotypmikroarraysystemet användas för att förfina denna modell. Här presenterar vi pipelinen vi använde för genomskala metabolisk nätverksförfining för Chlamydomonas-modellen med hjälp av fenotypmikroarraydata. När en ny förening test positivt för användning, föreningens relevanta reaktionsprofiler definieras med hjälp av metabolisk kunskapsbas, vilket ger tillhörande enzymprovisionsnummer.Det första steget är att söka Kegg och MetaCyc för att identifiera enzymprovisionsnummer, ECs, för reaktioner med metaboliserade som finns från de kemiska sammansatta matriserna. Därefter använder vi de identifierade EG-siffrorna som sökbas i flera tillgängliga alg anteckningsresurser, till exempel joint genome Institute, JGI, Phytozome och peer reviewed publikationer. Reaktionerna och metaboliterna läggs till den COBRA-baserade Chlamydomonas reinhardtii metaboliska nätverksmodellen, iRC1080, för att expandera och förfina modellen.Om genetiska bevis inte finns till stöd för EG-numret kan en profilbaserad sökning såsom NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, utföras för att identifiera kandidatgener som är associerade med reaktionen. Resultaten utvärderas sedan manuellt. De som klarar det här QC-steget med E-värden under 0,05 för relevans för sökningens EC-nummer läggs sedan till i måttmodellen.Det sista steget i det här protokollet är att förfina modellen, utvärdera och jämföra modellerna. Använd den senaste COBRA-verktygslådan version 3.0 och MATLAB-plattformen för att utföra stegen för modellförfining. När du har installerat Cobra-verktygslådan kan du ladda ner iRC1080-modellen.Sedan i MATLAB är det första du ska göra att navigera till mappen som innehåller referensmodellen, iRC1080. Lägg till de identifierade reaktionerna med tillhörande gener till den metaboliska modellen, till exempel iRC1080, med hjälp av Cobra-verktygslådefunktionerna. Lägg till reaktion och ändra genassociation.Navigera till katalogen som innehåller iRC1080-modellen och kör kommandona för att läsa in modellen. Byt namn på den och lägg till en ny reaktion och dess tillhörande gen. I vissa fall när metaboliten inte produceras intracellulärt, utan tas från mediet, måste transportreaktioner för de nya metaboliterna läggas till i modellen med hjälp av add/exchange-reaktionsfunktionen för att mata in eller mata ut metaboliten i det extracellulära mediet.Testa beteendet hos det nya resultatet och modellen, till exempel iBD1106, genom att utföra flödesbalansanalys, FBA, med hjälp av funktionen optimera CB-modellen under ljusa och mörka förhållanden för maximering av biomassa som objektfunktion. FBA-lösningen ger bland annat ut tre vektorer som reaktionsflödet, metabolitskuggspriserna och reaktionen minskade kostnaderna. Här ges ett exempel där iRC1080-modellen jämförs med dess raffinerade version, iBD1106, genom att erhålla de skuggpriser som representerar biomassamålfunktionens känslighet för förändringar och metaboliter som redovisas i varje modell.Här visar vi andning XY tomter och nivå tomter av kolkällor och kväve källor analys plattor för tom och CC-503 i kricka färg respektive lila. Inom varje brunn representerar andningskurvor färgkonvertering genom reduktion som tidsfunktion. Den markerade toppen i panel A representerar detektion av acetat som den enda kolkällan från denna platta, vilket överensstämmer med Chlamydomonas litteratur.Jämförelsen av antalet metaboliter som identifierats med hjälp av tre olika metoder, iRC1080, som är den väl utvalda Chlamydomonas metaboliska modellen, gaskromatografitiden för flygning GC-TOF och fenotypmikroarray-uppsatsen visar att endast sex metaboliter överlappar mellan de tre uppsättningarna, medan 149 var vanliga mellan iRC1080 och fenotypmikroarrayanalysuppsättningen. Detta visar att medan varje teknik har en styrka mot metabolisk profilering forskning, fenotyp microarray assay set kan vara en betydande källa till ny metabolisk information. Den erhållna informationen användes för att expandera och förfina den metaboliska nätverksmodellen iRC1080.Här jämför vi innehållet i iRC1080-modellen och den utökade modellen iBD1106, inklusive antalet reaktioner, antalet metaboliter och antal gener. Vi visar att vår modellraffinering lade till över 254 reaktioner på det nya resulterade nätverket. Dessa reaktioner klassificeras i aminosyror, dipeptider, tripeptider och transportreaktioner.De nyligen identifierade metaboliterna användes för metabolisk nätverk expansion och förfining av den befintliga Chlamydomonas reinhardtii metaboliska modellen. Fenotyp microarray analyser kan användas för att karakterisera metaboliska fenotyper av befintliga och nyligen isolerade stammar. Dessutom kan protokollet som vi använde i samband med mikroalger styra förfining av metaboliska modeller av andra arter.

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabil Isotopic Profilering av förmedlande Metabola Flux i utvecklingsländer och vuxna Stage Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Med hög kapacitet försockringen analys för lignocellulosa

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Kemiskt blockerad antikropp Microarray för Multiplexade hög kapacitet profilering av specifik proteinglykosylering i komplexa prover

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA för högupplöst profilering av genuttryck för RNA syntes, bearbetning och förfall i cellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA förutsägelser av sekundär struktur med high-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Hög kapacitet Titrering av luciferas-uttryckande rekombinanta virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...