Name: high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae at JoVE.com

Bu çalışma için büyük destek, New York Üniversitesi Abu Dabi Araştırma Enstitüsü hibesi (73 71210 CGSB9) ve NYU Abu Dabi Fakültesi Araştırma Fonları (AD060) kapsamında Tamkeen tarafından finanse edilen NYUAD Genomik ve Sistem Biyolojisi Merkezi (CGSB) tarafından sağlandı. W.F. ayrıca Zhejiang Üniversitesi'nin Yüz Yetenek Programı tarafından desteklendi. Ashish Jaiswal'a videoyu kaydetmede yardım için teşekkür ederiz. Hong Cai'ye metabolik fenotip verilerini ürettiği için teşekkür ederiz.

1. Fenotip Mikroarray Deneyleri
<ol><li>ABD Minnesota Üniversitesi Chlamydomonas Kaynak Merkezi'nden C. reinhardtii strain CC-503'ü edinin (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Hücreleri taze Tris-Asetat-Fosfat (TAP) ortam19'da 400 μg/mL timentin son konsantrasyonlarda büyütün, 50 μg/mL ampisilin ve 400 mikromol foton/m 2 sn altında 100 μg/mL kanamycin (bakteri üremesini engellemek için),25°C'de, iki gün boyunca orta kütük fazı.</li>
	<li>Kültürü 22 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün ve peletin rahatsız etmeden üst saltantayı atın.</li>
	<li>%0,1 tetrazolium menekşe boyası "D" içeren taze TAP ortamı hazırlayın. NOT: Her plakada test edilen metabolit kategorisine bağlı olarak bazı besin maddelerini hariç tutmak için bu adımda TAP medyasını değiştirin (örneğin, azot kaynak plakaları için amonyum klorürü hariç tutun).</li>
	<li>Peletin, hazırlanan taze TAP ortamlarında (adım 1.2'den) 1 x 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona yeniden biriktirin.</li>
	<li>Kimyasal bileşik dizi tahlil plakaları (karbon kaynakları, azot kaynakları, fosfor ve kükürt kaynakları plakaları ve peptit azot kaynakları) kullanın.</li>
	<li>Test plakalarının her kuyusuna 100 μL hücre içeren bir ortam alquot aşılayın. NOT: Tahlilleri çoğaltın.</li>
	<li>Maya özü / pepton plakaları üzerinde hücreleri çizgi ve Smith ve diğerleri gibi gram boyama gerçekleştirmek. Bakteriyel kontaminasyonu izlemek için test öncesi ve sonrası 20.</li>
	<li>Kimyasal bileşik dizi test plakalarını mikro plaka okuyucu sistemine yerleştirin.</li>
	<li>Tüm plakaları 30 °C'de 7 güne kadar kuluçkaya yatırın ve mikro plaka okuyucu sistemini her 15 dakikada bir boya renk değişimini okuyacak şekilde programlayın. NOT: Çoğu mikro plaka okuyucusu kuluçka sırasında sürekli ışık kaynağı sağlamadığı için, algler heterotrofik solunum yapabilmelidir.</li>
</ol>2. Veri Analizi
<ol><li>Ham kinetik verileri mikro plaka okuyucusundan CSV dosyaları olarak dışa aktarın, daha sonra R'deki Omnilog Fenotip Mikroarray (OPM) paketine giriş olarak kullanılacaktır.<ol>
<li>PM Kinetik veri dönüştürücü yazılımını kullanma; D5E veri dosyalarını yükleyin ve PM kinetik çözümleme yazılımında aşağıdaki komut satırlarını kullanarak OKA dosyalarına dönüştürün: Yük | Alma (OKA dosyalarının klasörünü bulma) | Filtreleri Doldurma | | al Tüm Plakaları Ekle | Kapatmak. | Dışa Aktar Okuma verilerini (Kinetik), biçim (CSV) (Tablo Başlığı)seçin ve plakaları seçin (her plaka (tek tek Dosyalar)) | Veri | verme Kurtarmak.
</li>
		<li>Fenotip Microarray (PM) veri analizini gerçekleştirmek için, R yazılım ortamında çalışan OPM yazılım paketi21,22'yi kullanın. Paket, öğretici ve başvuru belgeleri şu http://www.goeker.org/opm/. R için grafik kullanıcı arabirimi olan RStudio'da, aşağıdaki komutları kullanarak opm paketini ve bağımlılıklarını yükleyin: kaynak (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) kitaplık (opm)
</li>
		<li>Kinetik verilerin CSV dosyalarını içeren dizine gidin ve read_opm işlevini kullanarak verileri alın: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
</li>
		<li>Eğri parametresi tahminini kullanarak kinetik verileri toplar ve ayrıklaştırır. For (i in 1 :length(x)) { x[[i]] <_aggre(x[[i]], önyükleme = 0 L, çekirdek = 1 L, yöntem ="splines", seçenekler = set_spline_options("smooth.spline")) x[[i]] <- do_disc(x[i]], kesme = YANLIŞ) } Meta verilerin #Collection meta veriler <- collect_template(".")) metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503") için (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = meta veriler, replace = TRUE)}
</li>
		<li>96 kuyulu plakalar için solunum (veya büyüme) ölçümlerini (y ekseni) zamanın bir işlevi (x ekseni) olarak eşlemek için xy_plot işlevini kullanın. yazdırma (xy_plot(x[[ 1 ]], ="Strain", theor.max = FALSE))
</li>
		<li>Kinetik verilerin hızlı bir karşılaştırmalı genel görünümünü sağlamak için level_plot işlevini kullanarak verileri bir ısı haritası olarak görselleştirin. level_plot(x, ana = list(), renkler = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Ham kinetik eğrilerden önemli biyolojik bilgileri, eğri parametrelerini çıkarın ve gecikme fazını (φ), büyüme hızını (μ), maksimum hücre solunumunu (A) ve eğrinin altındaki alanı (AUC)21ekleyin. Pozitif metabolitleri tanımlamak için, her mikrowell plakasının boşluğuna ek olarak, boyanın ortamla abiyotik reaktivitesini temsil eden negatif kontrolün A değerlerini arka plan çıkarma değerleri olarak kullanın. Ayıklama işlevi A parametresini elde etmek için kullanılır. opm_opt("curve.param") param <- özü (x, as.labels = list("Strain")))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Yeni Metabolitlerle İlişkili Reaksiyonların ve Genlerin Tanımlanması
<ol><li>Kimyasal bileşik dizilerden bulunan metabolitleri kullanarak reaksiyonlar için Enzim Komisyonu numaralarını (VC' ler) tanımlamak için KEGG (Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi) (http://www.genome.jp/kegg/) ve MetaSik (http://metacyc.org/) arayın23,2423,24.</li>
	<li>Tanımlanan EC numaralarını, Joint Genom Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) ve hakemli yayınlar 23,25 ,26,27gibi birden fazla kullanılabilir alg ek açıklama kaynağında arama temeli olarak kullanın.</li>
	<li>Bir sorgu belirli bir EC numarası için genetik kanıt döndürmezse, C. reinhardtii'yeen yakın türlerden başlayarak diğer organizmalardaki ilgili ilişkili proteinleri tanımlayın, ardından varsayılan ayarlara sahip NCBI PSI-BLAST sunucusunu kullanarak profil tabanlı bir arama yapın ve reaksiyon12ile ilişkili aday genleri tanımlamak için C. reinhardtii'de (nr) gereksiz olmayan proteinler (nr) kullanın.</li>
	<li>EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) veya InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) protein etki alanı tahmin sunucuları aracılığıyla bu BLAST isabetlerini sorgulayarak, aranan EC numarasıyla ilgisi için PSI-BLAST isabetlerini E değerleriyle 0,05 < el ile küratörlüğünü el ile toplar. İkinci iki taramanın, protein için doğru enzimmatik aktivitenin tanımlanmasını sağlamak için kritik adımlar olduğunu unutmayın.</li>
</ol>4. Model İyileştirme ve Değerlendirme
<ol><li>En son COBRA Araç Kutusu v.3.0'ı kullanın28MATLAB'da29,30model iyileştirmesi için aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için platform. COBRA Araç Kutusu aşağıdaki adımları izleyerek yüklenebilir: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternatif olarak, COBRA Toolbox'ın Python (COBRApy) gibi diğer açık kaynaklı programlama dillerinde de uygulandığını unutmayın31) ve şu adresinde mevcuttur: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>COBRA Toolbox v.3.0'ı yükledikten sonra MATLAB'ı açın ve araç kutusunu başlatmak için aşağıdaki komutu yürütün: initCobraToolbox;</li>
		<li>Cobra Toolbox işlevlerini kullanarak ilişkili genleriyle tanımlanan reaksiyonları metabolik modele ekleyin, örneğin iRC1080, addReaction ve changeGeneAssociation. iRC1080 modelini içeren dizine gidin, http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080'den indirilin ve modeli yüklemek, yeniden adlandırmak ve yeni bir reaksiyon ve ilişkili geni eklemek için aşağıdaki komutları yürütün. Yükle('iRC 1080 .mat') modelNew = iRC 1080; modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... 'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... 'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ... 'D-ALA 2','au.g 14655 _t 1' );</li>
		<li>Metabolit hücre içi olarak üretilmediği, ancak ortamdan alındığı bazı durumlarda, modele yeni metabolitler için taşıma reaksiyonları ekleyin. Bu taşıma reaksiyonları, bir metabolitin hücre dışı ortamdan sitozola pasif difüzyonunu temsil eder. Ek olarak, metabolit'i hücre dışı ortama girmek veya çıktı almak için addExchangeRxn işlevini kullanarak karşılık gelen bir yapay değişim reaksiyonu ekleyin. modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)' modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000,1000);</li>
		<li>Yeni sonuç modelinin davranışını test edin, örneğin, iBD1106, akı dengesi analizi (FBA) gerçekleştirerek optimizecbmodel işlevini kullanarak, nesnel işlev olarak biyokütlenin en üst düzeye çıkarılması için açık ve karanlık koşullar altında. Işık büyümesi için PRISM solar litho'nun ışık reaksiyonlarının alt ve üst sınırlarını 646,07 (maksimum oran) olarak ayarlayın. Karanlık büyüme için, tüm PRISM ışık reaksiyonlarının sınırlarını sıfıra ayarlayın. Karanlık ve açık koşullarda büyüme için daha önce10 olarak tanımlanan Biyokütle işlevini kullanın. FBA çözümü, reaksiyon akılarına (solution.v) ve daha düşük maliyete (solution.w) karşılık gelen iki vektörün yanı sıra metabolitlerin gölge fiyatlarına (solution.y) karşılık gelen bir vektörü çıkacaktır. %Işık koşulu altında büyümeyi simüle: modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... % 'PRISM_solar_litho' , ... 'PRISM_solar_exo' , ... 'PRISM_incandescent_ 60 W' , ... 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ... 'PRISM_metal_halide' , ... 'PRISM_high_pressure_sodium' , ... 'PRISM_growth_room' , ... 'PRISM_white_LED' , ... 'PRISM_red_LED_array_ 653 nm' , ... 'PRISM_red_LED_ 674 nm' , ... 'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ... 'PRISM_design_growth' , ... }, 0, 'b' ); modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');</li>
		<li>i BD1106 için elde edilen FBA çözümlerini iRC1080 için elde edilenlerle karşılaştırmak için iRC1080 için 4.1.4 adımlarınıyineleyin.</li>
		<li>Modelleri karşılaştırmak için kullanılabilecek bir dizi COBRA yöntemi vardır (örneğin, akı değişkenlik analizi, gen silme çalışmaları, sağlamlık analizleri, akı bölünmüş tahminler, FBA, örnekleme vb.). Ayrıntılı öğreticiler https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Burada, iRC1080 modelinin rafine sürümü olan iBD1106 ile karşılaştırıldığı bir örnek, her modelde hesaba katılan metabolitlerin gölge fiyatlarını (biyokütle nesnel işlevinin sistem değişkenlerindeki değişikliklere duyarlılığı) elde ederek verilmiştir. Metabolitler için gölge fiyatları elde edin: shadowPrices = tablo(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yeşil mikroalganın metabolik fenotipingi, C. reinhardtii, burada yüksek verimli PM test plakaları ve değiştirilmemiş bir PMI kullanılarak tanımlanmıştır. Tahliller peptit azot kaynakları (PM06-08) ile birlikte toplam 190 karbon kaynağı (PM01 ve PM02), 95 azot kaynağı (PM03), 59 fosfor kaynağı ve 35 kükürt kaynağı (PM04) için kullanılmıştır. 148 besin için pozitif solunum gözlendi (C-kaynağı kullanımı için bir pozitif test, her S-kaynağı ve P-kaynağı kullanımı için dört pozitif test ve N-kaynak kullanımı için 139 pozitif tahlil). Ortamın substratları veya besin maddeleri (karbon, azot, fosfor veya kükürt) bileşeni, bu kaynakların her biri için test eden ilgili PM mikro plakalarına uygulandığında tanımlanan ortama eklenmemelidir.
Burada gösterilen yöntem, mevcut metabolik ağ modellerini genişletmek veya yeni modellerin yeniden yapılandırılmasını yönlendirmek için kullanılabilecek metabolik mikroalg fenotiplerini karakterize etmek için etkilidir. Ayrıca, çoğu mikroalgin beslenme gereksinimleri bilinmediğinden, bu platform bunları hızlı bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir. Nelson ve diğerleri. 43, mikroalg Kloroidium sp. UTEX 3007'nin büyümesini destekleyen yeni bileşikleri tanımlamak için bu yöntemleri başarıyla uygulamış ve elde edilen bilgileri Chlamydomonas'ın aksine 40 farklı karbon kaynağı içeren tür giriş metabolitlerini tanımlamak için kullanmıştır.
Pm'nin mikroalglerin profilini çıkarmak için önemli bir sınırlaması, PMI'ın kuluçka odasında aydınlatma olmaması ve mikroalglerin heterotrofik metabolizmayı gerçekleştirebilmesi gerektiğidir. Işığın yokluğu, metabolik akıları hesaplamak için ışığı içeren modellerin yorumunu etkileyebilir. Koordinasyon fonksiyonlarına sahip gen çiftleri metabolik ağ merkezlerini oluşturmak için birlikte gelişti ve fotokintitik ve fotosetik olmayan ağ hub'ları arasındaki ayrımyapılabilir 44. Genel olarak, fotosetik ağ hub'ları (yani modeldeki yüksek bağlı düğümler) heterotrofik modellerin dışında kalır. Pratik amaçlar için, miksotrofik türlerde heterotrofik modelleme, ışık tarafından yönlendirdiği bilinen reaksiyonları atlamalı ve koşullar arasındaki enerji dengesi farklılıklarını hesaba katmalıdır. Bu nedenle, ışığa bağımlı ve ışıktan bağımsız metabolizma modelleme Chlamydomonas metabolikmodellemedestandart uygulamadır 6,45.
Trebouxiophytes gibi bazı yeşil mikroalglerin büyüme için çeşitli karbon moleküllerini özümsediği bilinmektedir ve bunun likenlerin üyeleri olarak uzun evrimsel tarihlerinden kaynaklandığı düşünülmektedir46. Chlamydomonas gibi klorofitler büyüme için asetat kullanabilirken, ticari olarak çok uzun zincirli çoklu doymamış yağ asitleri (VLC-PUFAs) üretme potansiyeli ile bilinen kahverengi deniz mikroalgası Tisochrysis lutea, asetat kullanamaz, ancak büyüme için gliserol kullanabilir47. 100 g l−1 kuru hücre ağırlığından fazla biyokütle konsantrasyonu, fed-batch modunda organik karbon kaynaklarının optimize edilmiş eklenmesiyle Chlorella ile elde edilmiştir48. Ayrıca, Chlorellavulgaris'e şeker eklenmesi CO2'ninelektrasyonunu yükseltebilir, böylece fotosetik büyüme sırasında katkı maddesi yararı sağlar49. Çoğu heterotrofik mikroalg de miksotropik olarak büyüyebilir, ancak Klorofit Krokloris zofingiensis'in şeker50ilavesi üzerine fotosentezi kapattığı gösterilmiştir.
Bacillariophyta bölümüne ait diatomlar, fitoplanktonların önemli bir grubudur. Diatomların çoğu sadece fotoautotropik olarak büyüyebilmesine rağmen, bazıları miktotropik veya heterotropik olarak yetiştirilebilir51. Örneğin, gliserol, Phaeodactylum tricornutum52 model türleri de dahil olmak üzere bazı diatomlarda CO2'ninyokluğunda ışıkta büyümeyi desteklediği bulunmuştur. Ayrıca, Nitzschia linearis gibi bazı bentik diatomlar karanlıkta karbonhidratlar üzerinde büyüyebilir53. Hücrelerin heterotrofik olarak büyümesini sağlamak için uygun organik karbon kaynaklarını destekleyerek PM testlerini diatomlara ve diğer alg gruplarına genişletmesi muhtemeldir ve bir mikstrofi stratejisi, minimum derecede gerekli bir ışık kaynağı sağlayan zorunlu ototrofi mikroalgleri için de potansiyel olarak kullanılabilir.
Verilerin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, tüm plakalar için yinelenen tahlillerin yapılması şiddetle tavsiye edilir. Bir tahlil ancak negatif kontrolden ve ilgili boş kuyulardan çıktıktan sonra absorbans (PMI değeri) pozitifse pozitif olarak kabul edilebilir. Bu açıklama, test edilen bileşiğin varlığında, boyanın abiyotik reaksiyonunun ortamla bir yansımasıdır.

Hedeflenen metabolitlerin gelişmiş ve istikrarlı üretimi için alg metabolizmasının optimize edilmesi, metabolik ağların sistem düzeyinde analizleri yoluyla karmaşık metabolik mühendislik stratejilerinin geliştirilmesini gerektirir. Metabolik ağ modelleri optimizasyon stratejilerinin hızlı gelişimi için rasyonel tasarımlara rehberlik edebilir1,2,3,4. Yaklaşık 160 mikroalgal tür sıralanmış olmasına rağmen5, bilgimize göre, sadece 44 alg metabolik model mevcuttur4,6,7. Genomik bilgilerin deneysel olarak doğrulanması için yüksek verimli metabolik fenotipik verilerin elde etmedeki zorluk nedeniyle, yüksek kaliteli ağ modellerinin yeniden inşası, alg genom diziliminin hızlı gelişiminin gerisinde kalmaktadır.
C. reinhardtii, alg bazlı çalışmalar için çekici bir model sistemidir. Bu tür fotoautotropik veya heterotropik olarak büyüyebilir ve temel ve uygulamalı araştırmalarda model organizma olarak yaygın olarak kullanılmıştır. Genom dizisi 20078'de yayınlandı , genom ölçeğindeki metabolik modeller daha sonra 9,10,11türleri için yeniden inşa edildi. C. reinhardtii (iRC1080) için genom ölçeği modeli Chang ve arkadaşları tarafından yeniden inşa edildi. 10 genomik ve literatür kanıtlarına dayanmaktadır (~250 kaynak gerektirir). 2.190 reaksiyonlu 1.706 metabolitvardır 10; ancak, modelin tamlığı o sırada yayınlanan mevcut deneysel kanıtların ötesinde doğrulanamadı.
Fenotip mikroarrays (PMs) teknolojisi, doku kültürü hücrelerinin yanı sıra heterotrofik mikroorganizmalar için metabolik profil oluşturma bilgileri sağlayabilen yüksek verimli bir platformdur. Özellikle, ilk olarak Chlamydomonas reinhardtii12 ve daha sonra kloroidium 13 ve Chlorella 14 türleri için bildirildiği gibi, mikroalglerdeki fenotip-genotip bilgi açığını gidermek için kullanılabilir. Binlerce metabolit, sinyal molekülü, ozmolit ve efektör moleküle verilen hücre yanıtlarını inceleyerek, PM tahlilleri fonksiyonel metabolik profilleme sağlayabilir ve işlev, metabolizma ve çevre duyarlılığı hakkında içgörüler sunabilir15,16,17. Özellikle, PM tahlilleri, her kuyuda bulunan farklı besin maddeleri, metabolitler veya ozmolitler ile 96 kuyulu mikro plakalarda hücrelerin metabolit kullanımını tespit eder. Ayrıca, antibiyotikler ve hormonlar gibi biyoaktif molekülleri de test etmek mümkündür. Tetrazolium bazlı bir redoks boyasının NADH azaltılması ile renk üretiminin yoğunluğuna göre belirlendiği gibi, substratların metabolik kullanımı hücre solunumu açısından değerlendirilir15,16,17. 96 kuyulu mikro plakalardaki deneyler fenotip mikroarray aleti (PMI) platformu ile zaman içinde otomatik olarak izlenebilir ve belirlenebilir. Yirmi 96 kuyulu mikro plaka, karbon, azot, kükürt ve fosfor kaynaklarının yanı sıra farklı ozmotik / iyon ve pH etkilerini kullanmak için hücresel fenotipleri incelemek için ortak set metabolitlerini temsil etmek üzere tasarlanmıştır. PM teknolojisi, mikroorganizmalar için mevcut genom ölçeğindeki metabolik modellerin15 , 16 , 17,18'ingüncellenmesi ve yükseltilmesi içinbaşarıylakullanılmıştır.
Burada gösterilen protokol ve veriler Chaiboonchoe ve ark.'ın daha önce yayınlanan çalışmalarına dayanmaktadır. 12 Sunulan çalışma, mikroalglerin metabolik fenotiplerini karakterize etmek ve C. reinhardtii'nin mevcut bir alg metabolik modelini genişletmek ve yeni metabolik modellerin yeniden inşasına rehberlik etmek için PM tahlil yönteminin kullanımını detaylandırmamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog assay plates [ PM01-08]</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolog Omnilog Instrument</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td>
			<td></td>
			<td>Regents of the University of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0408-EU-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium Violet Dye &#8220;D&#8221;</td>
			<td>Biolog, Hayward, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td>
			<td>42010012-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput metabolic profiling for model refinements of microalgae

Metabolik modeller, bir organizmanın mevcut genom ek açıklamasına göre yeniden oluşturulur ve metabolik süreçleri sistem düzeyinde incelemek için tahmine dayalı araçlar sağlar. Genom ölçeğindeki metabolik modeller, deneysel olarak doğrulanmamış reaksiyonların yanı sıra boşluklar içerebilir. Yeni izole edilmiş mikroalgal türlerin yeniden yapılandırılmış modelleri, bu boşluklara bağlı zayıflıklara neden olacaktır, çünkü bu tür izolelerin metabolizması için genellikle seyrek biyokimyasal kanıtlar vardır. Fenotip mikroarray (PM) teknolojisi, çok çeşitli giriş metabolitlerine yanıt olarak hücresel metabolik aktiviteleri işlevsel olarak belirleyen etkili, yüksek verimli bir yöntemdir. Yüksek verimli fenotipik testlerin metabolik modelleme ile birleştirilmesi, genomik kanıtları desteklemek ve genişletmek için biyokimyasal kanıtlar sağlayarak mevcut metabolik ağ modellerinin hızla yeniden haline gelmesine veya optimize edilmesine izin verebilir. Bu çalışma, örnek olarak yeşil mikroalgal model türü Chlamydomonas reinhardtii kullanılarak mikroalglerin incelenmesi için PM testlerinin kullanımını gösterecektir. Bu çalışmada PM tarafından elde edilen 254'ün üzerinde reaksiyon için deneysel kanıtlar, genom ölçeğinde bir C. reinhardtii metabolik ağ modeli olan iRC1080'i yaklaşık yüzde 25 oranında genişletmek ve iyileştirmek için kullanılmıştır. Burada oluşturulan protokol, bilinen mikroalg mutantları ve yeni izolatlar da dahil olmak üzere diğer mikroalglerin metabolizmasının işlevsel olarak profillerinin oluşturulması için bir temel olarak kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae at JoVE.com

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Bu protokol, yeşil bir mikroalga olan Chlamydomonas reinhardtii'nin metabolik gereksinimlerini tanımlamak ve mevcut bir metabolik ağ modelini iyileştirmek için bir fenotip mikroarray (PM) teknoloji platformunun kullanımını göstermektedir.

Mikroalglerin Model İyileştirmeleri için Yüksek Verimli Metabolik Profil oluşturma

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

Fenotip mikro dizi teknolojisi, çok çeşitli giriş metabolitlerine yanıt olarak hücresel metabolik aktiviteleri işlevsel olarak belirleyen etkili bir yüksek verimli yöntemdir. Bu teknolojideki kullanım, tetrazolium bazlı bir redoks boyasının NADH azaltımı ile üretilen renk geliştirme miktarına göre belirlenen hücresel solunum şeklinde ölçülür. Bu çalışmada, Chlamydomonas reinhardtii model türlerini kullanarak mikro algler bağlamında fenotip mikro dizi tahlillerinin kullanımını tanıtacağız.Bu çalışmanın amacı, mevcut alg metabolik ağ modellerini genişletmek veya yeni modellerin yeniden inşasına rehberlik etmek için kullanılabilecek mikro alglerin metabolik fenotiplesini karakterize etmek için güvenilir bir yöntem oluşturmaktır. Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503, Minnesota ÜNIVERSITESI ABD'deki Chlamydomonas kaynak merkezinden temin edilebilir. Hücreleri taze Tris-asetat fosfat yağ medyasında orta kütük fazı kadar büyütün.Mikroskop altındaki hücreleri kontrol ederek iyi durumda olduklarından ve herhangi bir kirlenme olmadığından emin olun. 2000 G kuvveti ile kültürü 10 dakika döndürün. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.%0,1 tetrazolium menekşe boyası içeren taze musluk ortamı hazırlayın D"Bakteri üremesini engellemek için medyaya Timentin, Ampicillin ve Kanamycin dahil olmak üzere farklı antibiyotikler ekleyin. Yağ ortamı ve bu adım, her plaka tipine bağlı olarak besinlerden çıkarılmalıdır. Peleni ve taze musluk medyasını mililitre başına 1 milyon hücrelik son konsantrasyona yeniden askıya alın.Karbon kaynakları, azot kaynakları, fosfor ve kükürt kaynakları plakaları ve peptit azot kaynakları gibi kimyasal bileşik dizi tahlil plakalarını kullanın. Deneme plakalarının her kuyusuna 100 mikroliter yeterli miktarda kendi kendine yeten ortam aşılayın. Tahlilleri çoğaltın.Bu aşamada bakteriyel kontaminasyonu izlemek için hücrelerin tahlil öncesi ve sonrasında gram negatif lekelenme ile test edilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Kimyasal bileşik alan test plakalarını mikro plaka okuyucu sistemine yerleştirin. Tüm plakaları yedi güne kadar 30 derecede kuluçkaya yatırın ve mikro plaka okuyucu sistemini her 15 dakikada bir boya renk değişimini okuyacak şekilde programlayın.Çoğu mikro plaka okuyucusu kuluçka sırasında sürekli ışık kaynağı sağlamadığı için, algler heterotrofik solunum yapabilmelidir. Ham kinetik verileri mikro plaka okuyucusundan CSV dosyaları olarak dışa aktarın, bu da daha sonra fenotip mikroarray yazılım paketine ve yazılımımıza giriş olarak kullanılacaktır. Fenotip mikroarray veri analizini gerçekleştirmek için, R yazılım ortamında çalışan OmniLog fenotip mikro Erik OPM yazılım paketini kullanın.R studio'da, R için grafik kullanıcı arayüzü, makalede ayrıntılı olarak açıklanan komutları kullanarak OPM paketini ve bağımlılıklarını yükleyin. Kinetik verilerin CSV dosyalarını içeren dizine gidin ve okuma OPM işlevini kullanarak verileri alın. Kinetik veriler pref parametre tahmini kullanılarak toplanabilir ve ayrıklaştırılabilir.XY çizim işlevinin kullanılması, solunum veya büyüme ölçümlerinin 96 kuyu plakaları için zamanın bir işlevi olarak eşlenilmesini sağlar. Veriler, kinetik verilerin hızlı bir karşılaştırmalı genel görünümünü sağlamak için işlev düzeyi çizimi kullanılarak bir ısı haritası olarak görselleştirilebilir. Bir sonraki adım, yeni metabolitlerle ilişkili reaksiyonları ve genleri tanımlamaktır.Algler için mevcut bir modelin varlığı durumunda, fenotip mikroarray sisteminden gelen veri analizi bu modeli iyileştirmek için kullanılabilir. Burada fenotip mikroarray verilerini kullanarak Chlamydomonas modeli için genom ölçeğinde metabolik ağ iyileştirmesi için kullandığımız boru hattını sunuyoruz. Kullanım için yeni bir bileşik test pozitif olduğunda, bileşiğin ilgili reaksiyon profilleri, ilişkili enzim komisyon numaralarını sağlayarak metabolik bilgi temeli kullanılarak tanımlanır.İlk adım, kimyasal bileşik dizilerden bulunan metabolize edilmiş reaksiyonlar için enzim komisyon numaralarını, VC'leri tanımlamak için Kegg ve MetaCyc'i aramaktır. Daha sonra, tanımlanan EC numaralarını ortak genom Enstitüsü, JGI, Fitome ve hakemli yayınlar gibi mevcut birden fazla alg ek açıklama kaynağında arama temeli olarak kullanıyoruz. Reaksiyonlar ve metabolitler, modeli genişletmek ve iyileştirmek için COBRA tabanlı Chlamydomonas reinhardtii metabolik ağ modeli olan iRC1080'e eklenir.EC sayısını destekleyen genetik kanıtlar bulunamazsa, reaksiyonla ilişkili aday genleri tanımlamak için NCBI Pozisyona Özgü Yineleme, NCBI PSI-BLAST gibi profil tabanlı bir arama yapılabilir. Sonuçlar daha sonra el ile değerlendirilir. Arama EC numaralarıyla ilgisi için 0,05'ten küçük E değerlerine sahip bu QC adımını geçenler, daha sonra ölçüm modeline eklenir.Bu protokolün son adımı modeli iyileştirmek, modelleri değerlendirmek ve karşılaştırmaktır. Model iyileştirme adımlarını gerçekleştirmek için en son COBRA araç kutusu sürüm 3.0'ı ve MATLAB platformunu kullanın. Cobra araç kutusunu yükledikten sonra iRC1080 modelini indirebilirsiniz.Daha sonra MATLAB'da yapılacak ilk şey, referans modeli iRC1080'i içeren klasöre gitmektir. Kobra araç kutusu işlevlerini kullanarak iRC1080 gibi metabolik modele ilişkili genleriyle tanımlanan reaksiyonları ekleyin. Reaksiyon ekleyin ve gen ilişkisini değiştirin.iRC1080 modelini içeren dizine gidin ve modeli yüklemek için komutları çalıştırın. Yeniden adlandırın ve yeni bir reaksiyon ve ilişkili geni ekleyin. Metabolit hücre içi olarak üretilmediği, ancak ortamdan alındığı bazı durumlarda, metabolitleri hücre dışı ortama girmek veya çıkarmak için ekle/değiştir reaksiyonu işlevi kullanılarak yeni metabolitler için taşıma reaksiyonlarının modele eklenmesi gerekir.Yeni sonuç ve modelin davranışını test edin, örneğin, iBD1106, akı dengesi analizi yaparak, FBA, işlev optimize CB modelini ışık ve karanlık koşullar altında kullanarak nesne işlevi olarak biyokütlenin en üst düzeye çıkarılması için. Diğerlerinin yanı sıra, FBA çözümü reaksiyon akılarını, metabolit gölge fiyatlarını ve reaksiyonun maliyetleri düşürdüğü üç vektörü çıkışı sağlar. Burada, her modelde hesaba katılan değişikliklere ve metabolitlere biyokütle nesnel işlevinin hassasiyetini temsil eden gölge fiyatları elde ederek iRC1080 modelinin rafine sürümü iBD1106 ile karşılaştırıldığı bir örnek verilmiştir.Burada sırasıyla deniz mavisi renginde ve mor renkte boş ve CC-503 için karbon kaynaklarının ve azot kaynaklarının test plakalarının solunum XY arazilerini ve seviye çizelgelerini gösteriyoruz. Her kuyuda, solunum eğrileri zamanın işlevi olarak azaltılarak boya dönüşümünü temsil eder. Panel A'da vurgulanan tepe noktası, asetatın chlamydomonas literatürü ile tutarlı olan bu plakadan elde edilen tek karbon kaynağı olarak algılanmasını temsil eder.İyi küratörlüğünü yapılan Chlamydomonas metabolik modeli olan iRC1080, GC-TOF uçuşunun gaz kromatografi süresi ve fenotip mikroarray denemesi olmak üzere üç farklı yöntem kullanılarak tanımlanan metabolit sayısının karşılaştırılması, üç set arasında sadece altı metabolit çakışması olduğunu, 149'unun ise iRC1080 ile fenotip mikroarray assay kümesi arasında yaygın olduğunu göstermektedir. Bu, her teknolojinin metabolik profilleme araştırmasına karşı bir gücü olsa da, fenotip mikroarray test setinin önemli bir yeni metabolik bilgi kaynağı olabileceğini göstermektedir. Elde edilen bilgiler metabolik ağ modeli iRC1080'i genişletmek ve iyileştirmek için kullanıldı.Burada, iRC1080 modelinin içeriğini ve reaksiyon sayısı, metabolit sayısı ve gen sayısı dahil olmak üzere genişletilmiş model iBD1106'yı karşılaştırıyoruz. Model rafine etmemizin yeni ortaya çıkan ağa 254'ün üzerinde reaksiyon eklediğini gösteriyoruz. Bu reaksiyonlar amino asitler, dipeptitler, tripeptitler ve taşıma reaksiyonları olarak sınıflandırılır.Yeni tanımlanan metabolitler metabolik ağ genişlemesi ve mevcut Chlamydomonas reinhardtii metabolik modelinin iyileştirilmesi için kullanılmıştır. Fenotip mikroarray tahlilleri, mevcut ve yeni izole edilmiş suşların metabolik fenotiplerini karakterize etmek için kullanılabilir. Ek olarak, mikro algler bağlamında kullandığımız protokol, diğer türlerin metabolik modellerinin iyileştirilmesine rehberlik edebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...