Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

نود أن نشكر Yingxiao (Peter) Wang و Ziliang Huang و Molly Allen لاختبار إصدارات مختلفة من نظام LED أثناء تطويره. تم دعم هذا العمل من قبل معهد كافلي للدماغ والعقل في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو ومعهد سالك ، والمؤسسة الوطنية للعلوم من خلال مركز NSF لعلوم المعلومات بموجب منحة CCF-0939370 و NIH Grant NS060847 و NIH Grant R21DC018237.

<ol>
	<li>Klewer, L., Wu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+dimerization+approaches+to+control+cellular+processes.">Light-induced dimerization approaches to control cellular processes.</a> Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).</li><li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms.">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li><li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology.">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).</li><li>Kyriakakis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+orthogonal+molecules+using+ferredoxin+and+ferredoxin-NADP++reductase+systems+enables+genetically+encoded+PhyB+optogenetics.">Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).</li><li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics.">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li><li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptochrome,+phytochrome,+and+anthocyanin+production.">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li><li>Hern&#225;ndez-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+cryptochrome+2+(CRY2).">Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2).</a> Methods. 164-165, 81-90 (2019).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics.">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).</li><li>M&#252;ller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch.">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363 (2016).</li><li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells.">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779 (2013).</li><li>Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-triggered+protein+secretion+system.">A light-triggered protein secretion system.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).</li><li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains.">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li><li>Zhou, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-chain+photoswitchable+CRISPR-Cas9+architecture+for+light-inducible+gene+editing+and+transcription.">A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).</li><li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins.">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256 (2015).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li><li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques.">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li><li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase.">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>M&#252;ller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red/far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch+to+control+gene+expression+in+mammalian+cells.">A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Levskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+engineering+Escherichia+coli+to+see+light.">Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light.</a> Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).</li><li>Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+phytochrome-based+optogenetic+system+controllable+with+near-infrared+light.">A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light.</a> Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).</li><li>Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+optogenetic+pair+for+protein+regulation+and+spectral+multiplexing.">Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing.</a> Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).</li><li>Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+E.+coli+near-infrared+light+sensor.">Engineering an E. coli near-infrared light sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+with+a+photocleavable+protein,+PhoCl.">Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl.</a> Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain.">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li><li>Kim, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-gated+detection+of+protein-protein+interactions+with+transcriptional+readout.">Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

تم استخدام نظام LED الموصوف هنا في مختبرنا لتحسين وتوصيف والعمل مع العديد من أدوات علم البصريات الوراثية. في Kyriakakis et al.4 ، اختبرنا العديد من مجموعات مفاتيح الجينات PhyB-PIF بالتوازي. ثم استخدمنا هذا النظام لاختبار نبضات الضوء على ترددات مختلفة لقياس حركية تبديل الجينات وشدة الضوء الفعالة. تم استخدام هذا النظام أيضا لتحسين وتوصيف نظامين بصريين وراثيين يستخدمان الضوء الأزرق للتحفيز 5,6. نظرا لأن مصباح LED واحد فقط يحتاج إلى أن يكون ساطعا بدرجة كافية لتنشيط معظم أدوات علم البصريات ، فإن شراء نظام به أعداد كبيرة من مصابيح LED فوق كل بئر ليس ضروريا دائما. هذا الإعداد غير مكلف وموثوق وسهل إعادة التكوين ولا يتطلب خبرة كهربائية مسبقة لاتباع بروتوكول التجميع.
في الأشكال التكميلية التكميلية 31-38 ، نصف كيفية دمج ما يصل إلى أربعة مصابيح LED في النظام. في حين أن هذا قد يحد من بعض التجارب التي تتطلب عددا كبيرا من الظروف المتوازية ، يمكن إضافة المزيد من مصابيح LED عن طريق استبدال مصدر الطاقة 9 فولت المستخدم في هذا البروتوكول بمصدر قوة كهربائية أعلى. وبالمثل ، يمكن توصيل العديد من مصابيح LED منخفضة الطاقة بالتوازي مع كل دائرة. في هذا الترتيب الأخير ، لن يتم التحكم في بعض مصابيح LED بشكل فردي ، ولكن هذا يمكن أن يكون مفيدا عندما تكون هناك حاجة إلى العديد من مصابيح LED لتغطية مساحة أكبر. بمجرد التعرف على إلكترونيات هذا النظام ، هناك العديد من الطرق لتخصيصه. تتضمن الاستراتيجيات الإضافية لتخصيص النظام وضع مؤشر LED بعيدا أو أقرب إلى العينة والإضاءة من خلال المرشحات / الناشرات لظروف الإضاءة المتجانسة أو لمنع التسخين كما في (الشكل التكميلي 23) و Allen et al.5. ميزة أخرى ملحوظة لتصميم LED الخاص بنا هي أنه مغلف بالإيبوكسي وله قفل يعمل باللمس في الخلف. يتيح ذلك وضع LED بشكل آمن في أي مكان تقريبا: في الحاضنات ، وخزانات الأسماك ، وأقفاص الحيوانات ، والجدران ، وما إلى ذلك.
غالبا ما تتطلب العديد من التجارب التي تستخدم علم البصريات الوراثي للتحكم في الجينات ومسارات الإشارات والأنشطة الخلوية الأخرى النبض أو تمتد على نطاقات زمنية كبيرة أو تحتاج إلى إجراؤها في حاضنة ، وبالتالي تتطلب الأتمتة أو التلاعب عن بعد بدون مجهر. تم اختبار نظام LED هذا بشكل مستمر لعدة أشهر داخل حاضنة CO2 مرطبة دون أي مشاكل. بالإضافة إلى ذلك ، مع الأنظمة القابلة للانعكاس مثل أنظمة PhyB البصرية الوراثية ، قد يحتاج المجرب إلى جداول إضاءة نابضة خاصة بالبرنامج. في عملنا السابق4 ، استخدمنا برامج النبض لاختبار ديناميكيات الانعكاس لمفتاح PhyB-PIF3 في خلايا الثدييات من خلال واجهة المستخدم. باستخدام المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة ، تعد برمجة بروتوكول النبض أمرا سهلا ، مما يوفر المرونة والاستقلالية اللازمة للعديد من أنواع التجارب البصرية الوراثية بطريقة سهلة الاستخدام.
تشمل أهم الخطوات في بناء هذا النظام تجميع الدائرة الكهربائية على لوحة ثنائي الفينيل متعدد الكلور وتوصيل المكونات ، والتي تم تفصيلها في القسم 1 والقسم 2. من الضروري اتباع كل خطوة في هذه الأقسام بعناية والتحقق مرة أخرى من أرقام الثقب سطرا تلو الآخر قبل لحام كل مكون. يشرح القسم 2 كيفية إعداد المكونات التي سيتم توصيلها بالدائرة. حتى يتم توصيل المكونات في الاتجاه الصحيح ، من المهم بشكل خاص التأكد من تطابق ألوان الأسلاك السوداء والحمراء على الموصلات من سلك إلى سلك. من المحتمل جدا أن تؤثر عمليات الإشراف الصغيرة في هذين القسمين على وظائف النظام. في الواقع ، ستكون الخطوة الأولى في استكشاف أخطاء هذه الطريقة وإصلاحها هي التحقق من أن الدائرة قد تم بناؤها بشكل صحيح وأن جميع التوصيلات في مكانها الصحيح. ثانيا ، يعد التحقق من جودة اللحام بحثا عن التوصيلات السائبة والأسلاك الخاصة بحرق الشعيرات السلكية التي قد تقصر الدائرة ذات أهمية خاصة. تتمثل الخطوة الثالثة في التأكد من أن مصابيح LED تعمل بشكل صحيح ، والتي يمكن القيام بها باستخدام مصدر طاقة أو بطارية 1.5 فولت عن طريق قص طرفي LED بمشابك التمساح. هناك اعتبار آخر يحتمل أن يكون حاسما وهو منع التسخين (عند استخدام مصابيح LED بطاقة عالية) أو نشر الضوء للحصول على إضاءة أوسع انتشارا. لمعالجة هذه الاعتبارات ، يمكن تركيب مصابيح LED خارج الصندوق الأسود مع "فيلم الخصوصية" في الداخل ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 23 و Allen et al.5. نظرا لبساطة هذا النظام ، فإن تفكيكه للتحقق من المكونات المعيارية أو تعديلها أو ترقيتها أو إصلاحها ليس بالأمر الصعب.
عامل حاسم آخر لأنظمة الجينات المستحثة هو النظر في مقدار التنشيط المطلوب أو مقدار التسرب المقبول للنظام البيولوجي الذي يتم التحكم فيه. كما هو موضح في الشكل 6 ، يمكن أن تختلف هذه مع كمية الحمض النووي للمراسل. بالإضافة إلى ذلك ، ستختلف كفاءة النقل ، وبالتالي ، سيختلف عدد نسخ بنيات المراسل في كل خلية. قد يكون من المفيد لبعض التجارب إنشاء خط خلوي بكمية ثابتة من مكونات تبديل الجينات PhyB أو PhyB وفحص الحيوانات المستنسخة ذات النطاق المطلوب من التعبير المستحث ، كما هو شائع مع الأنظمة المحرضة للأدوية. نظرا لحجم وعدم استقرار البلازميد العدسي الفيروسي pPK-2304 ، فقد صنعنا أيضا إصدارات بلازميد غير فيروسية من مفتاح PhyB في العمود الفقري ل pcDNA pPK-351 (Addgene # 157921) و pPK-352 (Addgene # 157922).
من خلال بناء نظام إضاءة LED هذا باتباع هذا البروتوكول ، يكون لدى المستخدمين جميع المكونات اللازمة لإجراء مجموعة واسعة من تجارب البصريات الوراثية في المختبر وفي الجسم الحي. إلى جانب تعليمات استخدام PhyB-PIF3 في خلايا الثدييات ، سيسمح هذا البروتوكول لغير المهندسين وعلماء الأحياء ، بمرونة وفعالية ، باستخدام علم البصريات الوراثي القائم على PhyB في مجموعة متنوعة من السياقات.

أصبحت أدوات علم البصريات الوراثية في كل مكان ويتم تطوير تقنية جديدة باستمرار للتحكم بصريا في العمليات البيولوجية مثل التعبير الجيني وإشارات الخلية وغيرها الكثير1،2،3. تسمح القدرة على التحكم في العمليات الخلوية بالضوء بالحركية السريعة والتحكم المكاني المحكم والتنظيم المعتمد على الجرعة الذي يمكن التحكم فيه من خلال شدة الضوء ووقت التعرض. لاستخدام هذه الأدوات ، من الضروري وجود جهاز للتحكم في هذه المعلمات. لقد طورنا مؤخرا مفتاح جين ثديي PhyB-PIF3 مشفر وراثيا ينشط الجينات ويعطل تنشيطها بشكل عكسي باستخدام الضوء الأحمر / الأحمر البعيد ، على التوالي4. تم اختبار هذا النظام في العديد من خطوط خلايا الثدييات ومكن من تحريض التعبير الجيني بشكل لا مثيل له حتى مع وجود كميات صغيرة جدا من الضوء ، بما في ذلك نبضات الضوء. كثيرا ما يطلب الباحثون الذين يرغبون في استخدام مفتاح PhyB والأدوات المماثلة 5,6 معلومات حول طرق التحكم في شدة الإضاءة ومدتها. لذلك ، قمنا بتطوير هذا البروتوكول مع تعليمات خطوة بخطوة لتمكين اعتماد أوسع لهذه الأدوات لعلم البصريات الوراثي.
قبل الاستخدام الواسع النطاق لمصابيح LED ، تم استخدام مصادر الضوء ذات النطاق العريض مع المرشحات لدراسة البروتينات المستجيبة للضوء مثل phytochromes7. في الآونة الأخيرة ، تم نشر بعض أنظمة إضاءة LED جنبا إلى جنب مع أدوات البصرياتالوراثية 8،9،10،11،12 ، ولكن هذه البروتوكولات يمكن أن تتطلب خبرة كبيرة في الإلكترونيات / البرامج ، أو تتطلب معدات متخصصة (على سبيل المثال ، طابعات 3D ، آلات القطع بالليزر ، أو الأقنعة الضوئية) ، أو لا توفر التعليمات خطوة بخطوة التي قد يحتاجها بعض الباحثين لنشرها لتلبية احتياجاتهم البحثية. في حين أن التحكم المستقل في الآبار الفردية في لوحة متعددة الآبار يمكن أن يكون مفيدا ، إلا أنه غالبا ما يكون غير ضروري عندما يحتاج الباحثون فقط إلى مقارنة عدة عينات مختلفة في الضوء والضوء الداكن أو الأحمر مقابل الضوء الأحمر البعيد. أيضا ، العديد من الأنظمة التجارية الحالية باهظة الثمن ، مع قدرة تخصيص محدودة. ومع ذلك ، فإن مصابيح LED الموصوفة في هذا البروتوكول فعالة من حيث التكلفة ومشرقة ويمكن تركيبها بعدة طرق ؛ لذلك ، يمكن استخدامها لإلقاء الضوء على عدة أنواع مختلفة من العينات. مع البروتوكول والبرامج المقدمة ، يمكن استخدام مصابيح LED التي تتراوح من الأشعة فوق البنفسجية (UV) إلى NIR والتحكم فيها باستخدام برنامج لإجراء تجارب بصرية وراثية باستخدام UVR8 13,14 و Dronpa 15,16 ومجالات LOV 17,18 و Step Function Opsins 19,20 و CRY2 21,22 و PhyB 4,23,24 ، 25 ، فيتوكروم البكتيرية26،27،28،29 وغيرها من الأنظمة المستجيبة للضوء30،31،32.
يشكل هذا البروتوكول برنامجا تعليميا لتجميع الدوائر والأجهزة الأخرى اللازمة للتحكم في المعلمات المختلفة لتحفيز الضوء بالإضافة إلى الأدوات الجزيئية / الخلوية لإجراء تجربة بصرية وراثية. بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا عن البلازميدات المحسنة من Kyriakakis et al.4 الأصغر حجما والأكثر استقرارا للاستنساخ. من خلال هذا البروتوكول ، يمكن لعلماء الأحياء الذين ليس لديهم خبرة في الإلكترونيات والبصريات بناء أنظمة إضاءة مرنة وقوية. بطريقة خطوة بخطوة ، نوضح كيفية بناء أنظمة LED ، وإزالة عنق الزجاجة التقني لاعتماد أدوات البصريات الوراثية على نطاق أوسع. يمكن استخدام هذا النظام بسهولة في معظم حاضنات زراعة الخلايا ، حتى لو لم تكن تحتوي على منافذ سلكية. على سبيل المثال ، احتفظنا بنظام LED في حاضنة CO2 مرطبة بشكل مستمر لأكثر من 6 أشهر دون أي انخفاض في الأداء. نوضح أيضا كيفية توصيل نظام LED بجهاز كمبيوتر وربطه ببرنامج مفتوح المصدر نقدمه على GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). يوفر بناء نظام باستخدام هذا البروتوكول للباحثين المعرفة الأساسية لتصحيح المشكلات المحتملة واستبدال الأجزاء وتحسين / توسيع الوظائف.
نظرة عامة على النظام
يتضمن بناء نظام الإضاءة (1) بناء الدائرة الإلكترونية ، (2) بناء الأجهزة الطرفية (سلك إمداد الطاقة ، مفتاح الطاقة ، إلخ) ، (3) بناء مصابيح LED ، (4) تجميع كل هذه المكونات ، و (5) تثبيت البرنامج للتحكم في مصابيح LED بواجهة مستخدم (الشكل 1 أ). بمجرد الانتهاء ، يمكن لنظام الإضاءة التحكم في ما يصل إلى أربعة مصابيح LED بشكل مستقل باستخدام واجهة مستخدم (الشكل 1B). تتيح واجهة المستخدم لكل مؤشر LED النبض على فترات زمنية محددة وإيقاف تشغيله بعد وقت محدد. هناك أيضا تأخير بدء لبدء برامج الإضاءة في وقت محدد. تنظم مقاييس الجهد (POTs) شدة كل مصباح LED بشكل مستقل أو يمكن استخدامها للتحكم اليدوي في LED بدون جهاز كمبيوتر. يمكن أن تكون الأسلاك إلى مصابيح LED بأي طول مخصص ، مما يسمح بوضعها بسهولة في حاضنة أو مساحة مختبر. نظرا للطاقة العالية لمصابيح LED هذه ، يمكن استخدامها لإضاءة مساحة كبيرة باستخدام مصباح LED واحد من مسافة بعيدة.
وصف سائق LED
لتشغيل شدة مصابيح LED والتحكم فيها ، سيمر هذا البروتوكول بخطوات لبناء "برنامج تشغيل LED". يحتوي كل مصباح LED على مجموعة من الفولتية التي يعمل فيها (الشكل 1C). أثناء التشغيل ، يمكن ضبط جهد خرج المنظم ، الذي يتحكم في شدة الضوء ، بواسطة مقياس الجهد. يغير POT المقاومة ، ويضبط جهد الخرج / السطوع. يعطي الضبط باستخدام وعاء 1kΩ (1 كيلو أوم) ما نسميه "دائرة الجهد العالي" وله نطاق من 1.35 فولت إلى 2.9 فولت. نظرا لأن 2.9 فولت مرتفع جدا لتشغيل مصابيح LED ذات الجهد المنخفض (الشكل 1C) ، فإننا نعرض تعديلا واحدا (المقاوم 3 أو "R3" الشكل التكميلي 1A) يحد من النطاق ليتناسب مع مصابيح LED ذات الجهد المنخفض. يعمل R3 على تقليل الحد الأقصى للجهد المطبق على مصابيح LED إلى 1.85 فولت (التجميع المفصل في الشكل التكميلي 8) عندما يكون بالتوازي مع مقياس الجهد. باستخدام الجهد للتحكم في السطوع بدلا من التيار ، يكون النظام أكثر مرونة لمصابيح LED ذات جهد التشغيل المختلفة. يحتوي الشكل 1C على قائمة بمصابيح LED ذات الجهد العالي والمنخفض لتوجيه اختيار الدائرة الأمثل. يحافظ هذا التصميم على الحد الأدنى للجهد منخفضا بدرجة كافية بحيث يكون مؤشر LED مغلقا تماما عند إيقاف تشغيل مقياس الجهد ولا يسمح للجهد بتجاوز جهد التشغيل النموذجي لمصباح LED. بالنسبة لعلم البصريات الوراثي PhyB ، نستخدم مصابيح LED حمراء عميقة وحمراء بعيدة ، والتي تستخدم دائرة الجهد المنخفض.
وصف نظام التحكم في الكمبيوتر LED
يمكن استخدام نظام إضاءة LED للإضاءة المستمرة بدون جهاز كمبيوتر أو متحكم دقيق. ومع ذلك ، بالنسبة للبرامج النابضة وللتحكم في توقيت LED الفردي ، يجب تثبيت متحكم دقيق. لاستخدام متحكم دقيق للتحكم في مصابيح LED ، يلزم وجود ترانزستور لتوصيل المتحكم الدقيق بالدائرة. يستشعر هذا الترانزستور الجهد من المتحكم الدقيق ويتحول من كونه موصلا أو عازلا. للتحكم في "التشغيل" و "الإيقاف" ، نستخدم ما يسمى "ترانزستور من نوع تبديل NPN" (2N2222) كتحويلة يمكن التحكم فيها عبر R2 (الشكل التكميلي 1A). عندما يتم تطبيق الجهد من المتحكم الدقيق على قاعدة الترانزستور ، يصبح الترانزستور موصلا ويجعل جهد LED منخفضا ، مما يؤدي إلى إيقاف تشغيل مؤشر LED. وبالتالي ، يتم التحكم في حالات تشغيل وإيقاف LED والترانزستور مباشرة بواسطة المتحكم الدقيق ، والذي يتم التحكم فيه بواسطة البرنامج المثبت على جهاز الكمبيوتر.
لصنع نظام الإضاءة ، يلزم اتباع الخطوات التالية: بناء الدائرة الكهربائية ؛ بناء مصدر الطاقة ، ومفتاح الطاقة اليدوي ، و POTs ، واتصال المتحكم الدقيق ؛ بناء المصابيح. استيعاب صندوق أسود ليناسب نظام الإضاءة ؛ توصيل جميع الأسلاك والأجهزة ؛ تثبيت برنامج التحكم LED ، وتحفيز الخلايا بالضوء ؛ قياس التعبير الجيني باستخدام مقايسة لوسيفيراز مزدوجة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18AWG 2pin RED Black wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>15M-28AWG-2468</td>
			<td>Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1K Ohm potentiometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>52161500</td>
			<td>2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge Silicone JST Connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIM&#38;NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG solid jumper wires</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

أدى التحكم في العمليات البيولوجية باستخدام الضوء إلى زيادة الدقة والسرعة التي يمكن للباحثين من خلالها التعامل مع العديد من العمليات البيولوجية. يسمح التحكم البصري بقدرة غير مسبوقة على تشريح الوظيفة ويحمل القدرة على تمكين علاجات جينية جديدة. ومع ذلك ، تتطلب التجارب البصرية الوراثية مصادر ضوء كافية مع التحكم المكاني أو الزماني أو الكثافة ، وغالبا ما تكون عنق الزجاجة للباحثين. نوضح هنا بالتفصيل كيفية بناء نظام إضاءة LED منخفض التكلفة ومتعدد الاستخدامات يمكن تخصيصه بسهولة لمختلف أدوات البصريات الوراثية المتاحة. هذا النظام قابل للتكوين للتحكم اليدوي أو الكمبيوتر مع كثافة LED قابلة للتعديل. نحن نقدم دليلا مصورا خطوة بخطوة لبناء الدائرة ، وجعلها يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، وبناء مصابيح LED. لتسهيل تجميع هذا الجهاز ، نناقش أيضا بعض تقنيات اللحام الأساسية ونوضح الدوائر المستخدمة للتحكم في مصابيح LED. باستخدام واجهة المستخدم مفتوحة المصدر الخاصة بنا ، يمكن للمستخدمين أتمتة التوقيت الدقيق ونبض الضوء على جهاز كمبيوتر شخصي (PC) أو جهاز لوحي غير مكلف. تجعل هذه الأتمتة النظام مفيدا للتجارب التي تستخدم مصابيح LED للتحكم في الجينات ومسارات الإشارات والأنشطة الخلوية الأخرى التي تمتد عبر نطاقات زمنية كبيرة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، لا يلزم وجود خبرة سابقة في مجال الإلكترونيات لبناء جميع الأجزاء اللازمة أو لاستخدام نظام الإضاءة لإجراء تجارب البصريات الوراثية.

Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تجارب بصرية وراثية للتحكم في التعبير الجيني بالضوء الأحمر والأحمر البعيد باستخدام PhyB و PIF3. يتضمن إرشادات خطوة بخطوة لبناء نظام إضاءة بسيط ومرن ، والذي يتيح التحكم في التعبير الجيني أو علم البصريات الوراثي الآخر باستخدام الكمبيوتر.

بناء نظام إضاءة بسيط ومتعدد الاستخدامات لتجارب البصريات الوراثية

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

يسمح النظام للباحثين ببناء نظام إضاءة غير مكلف ومتعدد الاستخدامات بسهولة للتجارب البصرية الوراثية. تشمل مزايا هذه التقنية القدرة على برمجة توقيت إضاءة LED بأطوال موجية متاحة تمتد عبر طيف الأشعة تحت الحمراء المرئي بالقرب من الأشعة تحت الحمراء ، وأنه يمكن استخدام مصابيح LED في مجموعة متنوعة من السياقات لبناء دائرة كهربائية ، قم بقص لوحة الدوائر المطبوعة على أيدي المساعدة وأدخل أسلاك العبور ، وربطها لتشكيل ثقوب A1 و A3 على الأرض ، سلك العبور D2 في الثقب D6 ، ومصدر الطاقة بالإضافة إلى أسلاك العبور رقم سبعة في الثقب A7. ثني المحطات 45 درجة وإضافة تدفق.بعد اللحام ، قم بقص ظهور الأسلاك. أدخل أحد طرفي السلك الأنثوي الملحوم إلى موصل السلك في فتحة A5. ثم قم بتوصيل أحد طرفي المقاوم بفتحة A5.قم بتوصيل الطرف الآخر من الموصل بالأرض. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر من المقاوم بالأرض ولحام الاتصال. بالنسبة لموصل Arduino ، قم بتجعيد أطراف السلك إلى موصلات الأسلاك وادفع الأطراف المجعدة عبر الموصل المستطيل.لإعداد مصابيح LED ، قم بقص سلك عن طريق التسخين من الأسفل مع إضافة لحام من الأعلى. ضع كمية وفيرة من اللحام فوق طرف اللحام الكبير واستخدم الطرف لتسخين قاعدة LED عند التلامس الذي يحتوي على تدفق. بعد بضع ثوان ، اسحب اللحام بشكل فردي عبر كل جهة اتصال وقم بتثبيت السلك الأسود على الكاثود باستخدام مشبك شعر.ضع كمية وفيرة من اللحام على طرف اللحام الكبير ، واضغط على الطرف على السلك حتى يذوب اللحام الموجود على قاعدة LED. اضغط باستمرار على السلك وقم بإزالة مكواة اللحام أثناء تثبيت السلك في مكانه. ضع كمية صغيرة من معجون اللحام على الوسادات لتوصيلات LED واستخدم ملقط لوضع مؤشر LED فوق الوسادات.امسك السلك الأحمر المعلب مسبقا على الأنود واستخدم مشبك شعر لقص السلك. أضف اللحام إلى الطرف الكبير كما هو موضح واضغط على الطرف الموجود على الوصلة حتى يذوب اللحام الموجود على قاعدة LED ويذوب معجون اللحام ويصبح فضيا. لصنع أسلاك LED ، ضع أنبوب انكماش 4.76 ملم فوق السلك المقطوع بالطول وأنبوب انكماش 3.18 ملم فوق موصل السلك إلى السلك.قطاع وإضافة تدفق إلى نهايات الأسلاك. استخدم أيدي المساعدة لقص السلك إلى موصل السلك ولف طرف الموصل بنهاية سلك واحد. لحام المواد معا وإرفاق السلك الآخر إلى الإعداد بنفس الطريقة واللحام.ثم قم بقص أسلاك LED على أيدي المساعدة بشريط أسفل قاعدة LED. بعد ذلك ، امزج الإيبوكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وانشر الإيبوكسي فوق الجزء العلوي من مصباح LED الملحوم. باستخدام مثقاب الأشياء بأسمائها الحقيقية ، قم بحفر ثقب 1.5 سم من خلال الجزء العلوي من الصندوق الذي سيتم وضع LED عليه واستخدم أداة دوارة عالية السرعة لعمل شق على جانب واحد من الفتحة لإفساح المجال لسلك LED.قم بلصق قطعة من 25 إلى 30 ملم من فيلم الخصوصية على الصندوق الأسود الذي يغطي الفتحة التي سيضيء مؤشر LED من خلالها وقم بلصق مؤشر LED خارج الصندوق الأسود أعلى الفتحة. بالنسبة لنظام التحكم بأربعة مصابيح LED ، قم بحفر أربعة ثقوب بطول 0.83 سم بمسافة 3.81 سم في غطاء الصندوق واستخدم أداة دوارة عالية السرعة لقطع ثقب مستطيل 1.19 × 1.90 سم في الزاوية اليسرى العليا. باستخدام مثقاب بأسمائها الحقيقية ، قم بحفر ثقب 1.5 سم في الجزء الخلفي من الصندوق وأدخل جروميت في الحفرة.بالنسبة لمصابيح LED التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، قم بصنفرة المنطقة التي سيتم فيها لصق المتحكم الدقيق في الصندوق بالإضافة إلى الجانب السفلي من حامل المتحكم الدقيق. قم بتثبيت المتحكم الدقيق على الحامل ثم قم بإيبوكسي الحامل والصندوق معا قبل تثبيت الحامل في الصندوق الأسود. ثم ضع شريطا على الوجهين على المشبك وقم بتأمين المقطع داخل الصندوق.في العينات المنقولة للتعبير عن فيتوكروم ب ولكن ليس فيكوسيانين بيلين ، يزداد التسرب مع زيادة كمية الحمض النووي للمراسل. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يضيء مفتاح جين phytochrome B بالكامل بما في ذلك البلازميد المنتج ل phycocyanin bilin chromofour بالضوء الأحمر البعيد ، يزداد تعبير luciferase أيضا مع زيادة كميات بناء المراسل داخل مزيج النقل. وبالمثل ، عندما تضيء الخلايا الحساسة للضوء بالضوء الأحمر ، يزداد تعبير لوسيفيراز أيضا مع زيادة كمية المراسلين.عند مقارنة مستويات الحث للخلايا المعالجة بالضوء الأحمر بالخلايا المعالجة بالضوء الأحمر البعيد ، تم العثور على انخفاض طفيف في تنشيط الطي مع زيادة كميات المراسل. من الضروري اتباع كل خطوة بعناية عند بناء الدائرة الكهربائية ومضاعفة التحقق من أرقام الثقب سطرا سطرا قبل لحام كل مكون. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحفيز البصري للعديد من أنواع العينات أو أدوات علم البصريات باستخدام مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية ويسمح ببرمجة جداول الإضاءة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

دليل لهيكلة الإضاءة TIRF المجهري بسرعة عالية مع الألوان متعددة

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

وبسيطة وقابلة للتطوير أسلوب تلفيق لعضوي الأجهزة الإلكترونية بشأن المنسوجات

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

منهج تنوعا من الزخرفة البروتينات والخلايا

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

كريسبر / Cas12a متعددة الجينوم التحرير من Saccharomyces سيريفيسياي وخلق الخميرة بكسل الفن

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

تطبيقات للواح الاضاءه المتوافقة مع اللوحة المفتوحة المصدر

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

بسيطة، بأسعار معقولة، ونمط وحدات من الخلايا باستخدام الحمض النووي

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...