Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Vi vil gerne takke Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang og Molly Allen for at teste forskellige versioner af LED-systemet, da det blev udviklet. Dette arbejde blev støttet af Kavli Institute for Brain and Mind ved UC San Diego og Salk Institute, National Science Foundation gennem NSF Center for Science of Information under Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 og NIH Grant R21DC018237.

1. Byg det elektriske kredsløb
BEMÆRK: Protokollen til opbygning af et enkelt kredsløb til en tilgængelig LED er beskrevet her. Instruktioner til at udvide dette op til fire lysdioder er inkluderet i den supplerende info.
<ol><li>Tænd for røgdæmperen og loddejernet. Tilsæt vand til aftørringssvampen, hav loddet ved hånden. FORSIGTIG: Sørg for at tage sikkerhedsforanstaltninger for at fjerne røg og forhindre forbrændinger.</li>
	<li>Begynd lodning af kredsløbskomponenter til printkortet (printkort) i den rækkefølge, der vises i de supplerende paneler. BEMÆRK: Brug en lille mængde loddemetal på loddejernspidsen til først at opvarme komponentens metal og printkortet og smelte yderligere lodde direkte på komponenterne; Flux kan hjælpe meget.</li>
	<li>Loddejumperledninger og komponenter (supplerende figur 2 og supplerende figur 3).<ol><li>Til jumperledningerne (de isolerede ledninger, der forbinder to punkter på printkortet), brug to stykker orange [7.6 mm (0.3 tommer)] og gule [12 mm (0.4 tommer)] ledninger fra jumpersættet.</li>
		<li>Sæt printkortet på de "hjælpende hænder", og indsæt jumperledningerne i følgende pinholes, bøj klemmerne 45 grader og tilføj flux (figur 2, supplerende figur 2 og supplerende figur 3): a1 og a3 → jorden (-) (orange), a7 → strømforsyning (+) #7 (gul), d2 → d6 (gul). </li>
		<li>Lod og trim derefter bagsiden af ledningerne.</li>
		<li>Indsæt LM317T-spændingsregulatoren i følgende pinholes, bøj stifterne, og tilføj flux (figur 2 og supplerende figur 4): Adj → e5, Vud → e6, Vi → e7.</li>
		<li>Lod venstre og højre terminal først, trim dem, lod derefter og trim den midterste terminal.</li>
		<li>For at indstille kredsløbets lavspændingsområde skal du indsætte en 820 Ω modstand helt ned i pinholes, lodde og trim c2 → c5 (figur 2 og supplerende figur 5).</li>
		<li>For at aktivere LED-styring af mikrocontrolleren skal du indsætte transistoren i b3–b5 (figur 2 og supplerende figur 6): Kollektor → b3, base → b4, emitter → b5. BEMÆRK: Vær opmærksom på transistorens retning, der skal indsættes korrekt; tjek specifikationerne for at finde betegnelsen Collector, Base og Emitter.</li>
	</ol></li>
	<li>Lod ledning-til-ledning-stikkene til POT, LED, mikrocontroller og strømkilde. BEMÆRK: Vær opmærksom på farven på ledningerne på ledningerne til ledningerne, og om du bruger et hun- eller hanstik til ledning.<ol><li>Bestem, om der kræves et "lavspændingskredsløb" eller "højspændingskredsløb" til den ønskede LED (figur 1C). BEMÆRK: Hvis LED'en er på listen "lavspænding", kræves en modstand parallelt med POT.</li>
		<li>For kredsløbet "lavspænding" eller "højspænding" placeres ledningen fra et hunstik fra ledning til ledning gennem hul a5 (supplerende figur 7). Lod ikke på plads endnu, hvis du laver lavspændingskredsløbet. BEMÆRK: Drej de bare trådender, så de små trådhår ikke flager ud. Hvis ledningen virker for tyk til at skubbe gennem pinhullet uden at flosse, skal du skære 2-6 tråde og derefter dreje dem sammen igen (supplerende figur 7B-D).</li>
		<li>Hvis du laver "højspændingskredsløbet", skal du springe til trin 1.4.5. Hvis du laver "lavspændingskredsløbet", skal du skubbe en 560Ω modstand gennem det samme hul (a5) og lodde med ledning-til-ledning-stikledningen.</li>
		<li>Tilslut den anden ende af modstanden til jorden (supplerende figur 7G).</li>
		<li>Indsæt den anden ende af hun-loddetilslutningen i et 5-hul, der forbinder den med jorden, og lod den (supplerende figur 8A,B).</li>
		<li>For mikrocontrollerforbindelsen indsættes den ene ende af et hanstik fra ledning til ledning i hul a4 og den anden i et hul, der er forbundet med jorden (supplerende figur 9A-C).</li>
		<li>For LED-forbindelsen skal du indsætte den ene ende af et hunstik fra ledning til ledning i hul a2 og den anden ende i et hul, der er forbundet til jorden (supplerende figur 9D,E).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Byg strømforsyning, manuel afbryder, POT'er og mikrocontrollerforbindelse
<ol><li>Byg strømforsyningen.<ol><li>Lod en orange [7,6 mm (0,3 tommer)] jumper fra a29 til jorden (supplerende figur 10).</li>
		<li>Lod et hunstik fra a30 til strømforsyningen (+) (supplerende figur 11A-C).</li>
		<li>Lod et hanstik fra c29 til c30 (supplerende figur 11D-F).</li>
		<li>Klip stikket af en netledning, blotlæg ledningerne, og strip dem (supplerende figur 12A-C).</li>
		<li>Tilsæt flux til ledningerne inden lodning ved hjælp af en fluxpen (supplerende figur 3G).</li>
		<li>Placer et krympeslange på 3,18 mm (1/8 tomme) omkring et hanstik fra ledning til ledning og et tykkere stykke 4,76 mm (3/16 tommer) over strømforsyningsledningen (supplerende figur 12D).</li>
		<li>Drej ledningerne fra strømforsyningen og han-til-ledning-stikket sammen og loddet (supplerende figur 12E, 13A, B).</li>
		<li>Anbring krymperøret med mindre diameter 3,18 mm (1/8 tomme) over tilslutningerne, og krymp dem med en varmepistol (supplerende figur 13C, D).</li>
		<li>Anbring et krympeslange med større diameter 4,76 mm (3/16 tommer) over det mindre krympeslange 3,18 mm (1/8 tomme) og opvarm igen (supplerende figur 13E, F).</li>
	</ol></li>
	<li>Byg den manuelle afbryder.<ol><li>Krymperøret anbringes 3,18 mm (1/8 tomme) over ledningerne til afbryderen (supplerende figur 14A).</li>
		<li>Drej og lod ledningerne til et hanstik fra ledning til ledning (supplerende figur 14B,C).</li>
		<li>Krymperøret anbringes 3,18 mm (1/8 tomme) over loddede sektioner, og krympet med en varmepistol (supplerende figur 14D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Tilslut han-til-lednings-stikket til POT.<ol><li>Sløjf ledning-til-tråd-stikkets sorte ledning rundt om POT'ens midterste terminal (supplerende figur 15B).</li>
		<li>Drej ledningen, der er sløjfet tæt rundt om terminalen, og lod den (supplerende figur 15C). BEMÆRK: Små præcisionstrænger kan hjælpe med at lave et tæt twist.</li>
		<li>Gentag med den røde ledningsforbindelse til terminalen, som i supplerende figur 15D.</li>
		<li>Brug en tang til at bryde metaltappen nær den røde pil (supplerende figur 15E,F).</li>
	</ol></li>
	<li>Byg mikrocontrollerforbindelsen (kun nødvendig for computerstyrede lysdioder).<ol><li>Hvis du laver en LED-driver til mere end én LED, skal du afskære de sorte ledninger fra alle tråd-til-tråd-stik undtagen én hun (supplerende figur 16A).</li>
		<li>Krympning af enderne af wire-to-wire-konnektorerne som vist (supplerende figur 16B-D).</li>
		<li>Skub de krympede ender gennem det rektangulære stik (supplerende figur 16E).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Byg lysdioderne
<ol><li>Trådenderne fjernes (~5 mm), og flux påføres med en fluxpen som vist i supplerende figur 3G. BEMÆRK: For effektivt at lodde ledningerne på LED-basen, flux skal tilføjes til kontakterne på LED-basen og ledningerne.</li>
	<li>Dåse ledningen ved at opvarme ledningen nedefra og tilføje loddemetal fra toppen (supplerende figur 17B).</li>
	<li>Brug fluxpennen til at placere flux på LED-basens overfladekontakt (supplerende figur 17C).</li>
	<li>Anbring en generøs mængde loddemetal på en stor loddespids (~4–5 mm) (supplerende figur 17D), brug den til at opvarme LED-basen ved kontakten (supplerende figur 17E). Efter et par sekunder trækkes loddet hen over kontakten (supplerende figur 17F). Gentag trin 3.3-3.4 på den anden kontakt (supplerende figur 17G). FORSIGTIG: LED-basen kan blive meget varm under lodning. Placer LED-basen på en overflade, der ikke smelter eller brænder.</li>
	<li>Sæt den sorte ledning fast på kontakten "C+" (katoden) ved hjælp af hårklemmerne (supplerende figur 18A).</li>
	<li>Anbring en generøs mængde loddemetal på den store loddespids (supplerende figur 18B), og tryk den ned på ledningen, indtil loddet på LED-basen smelter (supplerende figur 18C). Hold ledningen nede (supplerende figur 18D), og fjern loddejernet, mens du holder ledningen på plads (supplerende figur 18E).</li>
	<li>Anbring en lille mængde loddepasta på puderne til LED-tilslutningerne (supplerende figur 19A, B), og placer LED'en over puderne med pincet (supplerende figur 19C). BEMÆRK: Hvis placeringen er lidt væk, er det okay; Det vil gå på plads, når loddepastaen smelter.</li>
	<li>Hold den røde ledning på "A+" (anoden) og klip den med en hårklemme (supplerende figur 20A-C).</li>
	<li>Placer en generøs mængde loddemetal på den store loddespids (supplerende figur 20D), og tryk den ned på ledningen, indtil loddet på LED-basen og loddepastaen under LED'en smelter (supplerende figur 20E). BEMÆRK: Når loddepastaen smelter, bliver farven sølv (supplerende figur 20H,I).</li>
	<li>Vælg længden på den ledning, der er nødvendig for den ønskede opsætning. Fjern LED-ledningerne og et hanstik fra ledning til ledning (supplerende figur 21A), og tilføj derefter flux som i supplerende figur 3G.</li>
	<li>Placer krymperøret over ledningerne. Brug et krympeslange på 3,18 mm (1/8 tommer) over ledning-til-tråd-stikkene og et krympeslange på 4,76 mm (3/16 tommer) over ledningen (supplerende figur 21B).</li>
	<li>Klip ledning-til-tråd-stikket med en "hjælpende hånd", drej stikkets ende med ledningen (supplerende figur 21C), og lod dem. Gentag med den anden ledning (supplerende figur 21D,E).</li>
	<li>Anbring krympeslangerne på 3,18 mm (1/8 tomme) over loddet, og krymp dem (supplerende figur 21F–G).</li>
	<li>Placer krymperøret på 4,76 mm (3/16 tommer) over krymperøret på 3,18 mm (1/8 tomme), og krymp (supplerende figur 21H–I).</li>
	<li>Klip LED-ledningerne til de "hjælpende hænder" med tape under den (supplerende figur 22A).</li>
	<li>Bland epoxy i henhold til producentens anvisninger og spred den over toppen af loddet LED (supplerende figur 22B). Forlad natten over for at helbrede.</li>
	<li>Hvis du monterer ved hjælp af en berøringslukning, skal du skære et lille stykke af berøringsfastgørelsen (supplerende figur 23A) og trykke det mod bagsiden af LED'en i 30 sekunder.</li>
	<li>Brug et højhastighedsdrejeværktøj til at lave et hak på låget af en sort boks (supplerende figur 23C-E).</li>
	<li>Byg en montering til en enkelt LED gennem en privatlivsfilm.<ol><li>Brug spadeboret til at bore et hul på 1,75 cm (11/16 tomme) gennem toppen af en sort boks, hvor LED'en placeres (supplerende figur 24A).</li>
		<li>Brug et højhastighedsdrejeværktøj til at lave et hak på den ene side af hullet for at gøre plads til LED-ledningen, som vist i supplerende figur 24A.</li>
		<li>Klip et stykke privatlivsfilm (25-30 mm) og tape på indersiden af den sorte boks, der dækker hullet, som LED'en lyser igennem (supplerende figur 24A).</li>
		<li>Placer LED'en uden for den sorte boks oven på hullet med privatlivsfilm og tape på plads med elektrisk tape (supplerende figur 24B–E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Tilpas en sort boks, der passer til belysningssystemet
<ol><li>For et fire LED-system skal du bore fire 0,83 cm (21/64 tommer) huller på låget 3,81 cm (1,5 tommer) fra hinanden, hvor potentiometrene vil blive fastgjort (supplerende figur 25).</li>
	<li>Brug et højhastighedsdrejeværktøj til at skære et rektangulært hul på 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 tommer x 0,75 tommer) i øverste venstre hjørne (supplerende figur 25).</li>
	<li>Brug spadeboret til at bore et hul på 1,75 cm (11/16 tomme) på den sorte boks (supplerende figur 26).</li>
	<li>Hullerne fileres, og stumpen indsættes i hullet, der er boret ind (supplerende figur 26).</li>
	<li>For de computerstyrede lysdioder skal du sandpapir det område, hvor mikrocontrolleren limes i en sort boks, samt undersiden af mikrocontrollerholderen.</li>
	<li>Klik mikrocontrolleren på holderen, før du fastgør holderen i den sorte boks, og epoxy dem derefter på plads (supplerende figur 27A).</li>
	<li>Brug sandpapir til at slibe bunden af to clips og området i en sort boks, hvor kredsløbet skal placeres, og fastgør clipsene inde i den sorte boks med epoxy (supplerende figur 27A).</li>
	<li>Fastgør printkortet i klip (supplerende figur 27B).</li>
	<li>Tryk afbryderen gennem det firkantede hul i låget i supplerende figur 25 , og klik den på plads (supplerende figur 28A).</li>
	<li>Skub POT'erne gennem hullerne på låget, skru dem på plads (supplerende figur 28A), og sæt knappen på POT (supplerende figur 28B).</li>
</ol>5. Tilslut alle ledninger og enheder
<ol><li>Mærk ledning-til-ledning-konnektorerne (f.eks. LED, POT, COM) (supplerende figur 29A).</li>
	<li>Fastgør de krympede konnektorer i trin 2.4 (supplerende figur 16) til han-stikket-til-ledning-konnektoren mellem de to hunstik (POT og LED) (supplerende figur 7A og S37).</li>
	<li>Tilslut de krympede ender til mikrocontrolleren (supplerende figur 30).</li>
	<li>Træk USB-kablet gennem grommet, og sæt det i mikrocontrolleren.</li>
	<li>Træk ledningerne til LED'erne gennem grommet, og tilslut til hun-til-tråd-stikket til venstre for mikrocontrollerforbindelsen (supplerende figur 9D og 38).</li>
	<li>Træk ledningen til strømforsyningen gennem grommet, og tilslut den til han-til-tråd-stikket på højre side af printkortet (supplerende figur 11D).</li>
	<li>Tilslut han-til-tråd-stikket fra afbryderen til hun-til-tråd-stikket til højre for printkortet (supplerende figur 11A).</li>
	<li>Tilslut han-til-tråd-konnektorerne fra POT'erne på låget til hun-til-tråd-stikkene på printkortet (supplerende figur 8 og 36). BEMÆRK: Tænd ikke kredsløbet, uden at potentiometrene er tilsluttet.</li>
</ol>6. Installer LED-styringssoftwaren
BEMÆRK: Se de detaljerede softwareinstallationsinstruktioner i den supplerende fil på Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces
<ol><li>Download og installer softwaren til programmering af mikrocontrolleren</li>
	<li>Download og installer pakkehåndteringen.</li>
	<li>Programmer mikrocontrolleren.</li>
	<li>Download og installer runtime-motoren.</li>
	<li>Download brugergrænsefladen.</li>
</ol>7. Stimuler cellerne med lys
<ol><li>Transfekt HEK293-celler.<ol><li>Plade HEK293-celler ved 100k celler pr. Brønd i en 24-brøndplade.</li>
		<li>Brug eksempeltabellen til at beregne serumfrie medier, polyethylenimin (PEI) og DNA-volumener (supplerende figur 39) og transfektere ved hjælp af producentens protokol.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimulerende celler med lys. BEMÆRK: Celler skal opbevares i mørke efter transfektion eller håndteres ved hjælp af en lyskilde, der ikke ophidser det optogenetiske system.<ol><li>Bestem, hvilken type stimulering der skal bruges på cellerne (kontinuerligt lys, pulserende intensitet osv.).</li>
		<li>Når POT'erne er slukket (mod uret), skal du tænde LED-strømforsyningen.</li>
		<li>Placer en lysmåler inde i den sorte boks, hvor cellerne skal placeres, og placer låget med LED'en over måleren. Juster lysintensiteten efter behov.</li>
		<li>Hvis du bruger computeren til at styre LED'erne, skal du åbne brugergrænsefladesoftwaren.</li>
		<li>Programmér brugergrænsefladen (figur 5A, B).<ol><li>På øverste venstre panel skal du vælge COM-porten til mikrocontrolleren og klikke på Opret forbindelse.</li>
			<li>Brug panelerne til højre til at programmere hver LED. For kontinuerligt lys skal du vælge ethvert tidspunkt undtagen nul i "Time On" og indstille "Time Off" til nul.</li>
			<li>På nederste højre panel skal du programmere hovedtimingkontrollen.<ol><li>Hvis du vil forsinke belysningen, skal du vælge en startforsinkelse (HH:MM).</li>
				<li>Hvis du vil slukke alle LED'er efter et angivet tidspunkt, skal du vælge en kørselstid (HH:MM).</li>
				<li>Start belysningsprogrammet ved at klikke på knappen Kør (figur 5A).</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>8. Mål genekspression ved hjælp af et dobbelt luciferase-assay
<ol><li>Der fremstilles luciferasereagens ved at blande 10 ml luciferasebuffer med luciferasereagens og en prøve i 1 ml reagensglas, der skal opbevares ved -80 °C i op til 1 år.</li>
	<li>Forbered lysisbuffer 5x i 1x til 100 μL til N + 2 huller. f.eks. til 30 prøver, 30 x 20 μL 5X lysisbuffer og 30 x 80 μL MQ H2O.</li>
	<li>Forbered Renilla-substratopløsning: 20 μL Renilla-substrat til 1 ml Renilla-buffer (denne mængde er egnet til 10 assays).</li>
	<li>Fjern celler fra inkubatoren, aspirer mediet, tilsæt 100 μL 1x lysisbuffer pr. Brønd og læg den på en ryster ved 100 RPM i 15 min.</li>
	<li>Anbring i -20 °C i mindst 1 time.</li>
	<li>Der tilsættes 100 μL luciferasereagens pr. prøve i et hul i en hvid plade med 96 huller.</li>
	<li>Konfigurer pladelæseren til luminescens. Brug luminometermodulet på pladelæseren til at indstille integrationen til 1 s.</li>
	<li>Der tilsættes optøede lysater i hullerne under luciferasereagenset. Ved hjælp af en multikanalpipette blandes 20 μL prøve i luciferasereagenset, og luminescensen måles straks.</li>
	<li>Efter aflæsningsplateauet tilsættes 100 μL Renilla-substratopløsning og scannes igen.</li>
	<li>Opdel Luciferase-signalet med Renilla-signalet for at tage højde for transfektionseffektivitet.</li>
	<li>Sammenlign luciferasesignaler normaliseret for transfektionseffektivitet (f.eks. Sammenlign signalet fra rødt lys oplyst og langt rødt lys belyste prøver).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Klewer, L., Wu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+dimerization+approaches+to+control+cellular+processes.">Light-induced dimerization approaches to control cellular processes.</a> Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).</li><li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms.">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li><li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology.">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).</li><li>Kyriakakis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+orthogonal+molecules+using+ferredoxin+and+ferredoxin-NADP++reductase+systems+enables+genetically+encoded+PhyB+optogenetics.">Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).</li><li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics.">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li><li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptochrome,+phytochrome,+and+anthocyanin+production.">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li><li>Hern&#225;ndez-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+cryptochrome+2+(CRY2).">Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2).</a> Methods. 164-165, 81-90 (2019).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics.">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).</li><li>M&#252;ller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch.">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363 (2016).</li><li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells.">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779 (2013).</li><li>Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-triggered+protein+secretion+system.">A light-triggered protein secretion system.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).</li><li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains.">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li><li>Zhou, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-chain+photoswitchable+CRISPR-Cas9+architecture+for+light-inducible+gene+editing+and+transcription.">A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).</li><li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins.">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256 (2015).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li><li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques.">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li><li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase.">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>M&#252;ller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red/far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch+to+control+gene+expression+in+mammalian+cells.">A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Levskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+engineering+Escherichia+coli+to+see+light.">Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light.</a> Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).</li><li>Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+phytochrome-based+optogenetic+system+controllable+with+near-infrared+light.">A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light.</a> Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).</li><li>Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+optogenetic+pair+for+protein+regulation+and+spectral+multiplexing.">Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing.</a> Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).</li><li>Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+E.+coli+near-infrared+light+sensor.">Engineering an E. coli near-infrared light sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+with+a+photocleavable+protein,+PhoCl.">Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl.</a> Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain.">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li><li>Kim, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-gated+detection+of+protein-protein+interactions+with+transcriptional+readout.">Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

LED-systemet beskrevet her er blevet brugt i vores laboratorium til at optimere, karakterisere og arbejde med flere optogenetiske værktøjer. I Kyriakakis et al.4 testede vi mange kombinationer af PhyB-PIF-genskift parallelt. Vi brugte derefter dette system til at teste lysimpulser ved forskellige frekvenser for at måle genskiftekinetikken og den effektive lysintensitet. Dette system blev også brugt til at optimere og karakterisere to optogenetiske systemer, der bruger blåt lys til stimulering 5,6. Da kun en LED skulle være lys nok til at aktivere de fleste optogenetiske værktøjer, er det ikke altid nødvendigt at købe et system med et stort antal lysdioder over hver brønd. Denne opsætning er billig, pålidelig, nem at omkonfigurere og kræver ingen forudgående elektrisk ekspertise for at følge monteringsprotokollen.
I de supplerende supplerende figurer 31-38 beskriver vi, hvordan op til fire lysdioder kan indbygges i systemet. Selvom dette kan begrænse nogle eksperimenter, der kræver et stort antal parallelle forhold, kan flere lysdioder tilføjes ved at erstatte 9 Volt strømforsyningen, der bruges i denne protokol, med en højere watt. På samme måde kan flere LED'er med lavere effekt tilsluttes parallelt med hvert kredsløb. I sidstnævnte arrangement styres nogle lysdioder ikke individuelt, men dette kan være nyttigt, når der kræves mange lysdioder for at dække et større område. Når du først er fortrolig med elektronikken i dette system, er der mange måder at tilpasse det på. Yderligere strategier til tilpasning af systemet inkluderer placering af LED'en længere eller tættere på prøven og belysning gennem filtre / diffusorer for homogene belysningsforhold eller for at forhindre opvarmning som i (supplerende figur 23) og Allen et al.5. Et andet bemærkelsesværdigt træk ved vores LED-design er, at det er indkapslet i epoxy og har en berøringslukning på bagsiden; dette gør det muligt at placere LED'en sikkert med lethed stort set overalt: i inkubatorer, akvarier, dyrebure, vægge osv.
Mange eksperimenter, der bruger optogenetik til at kontrollere gener, signalveje og anden cellulær aktivitet, kræver ofte pulsering, spænder over store tidsskalaer eller skal udføres i en inkubator, hvilket kræver automatisering eller fjernmanipulation uden mikroskop. Dette LED-system er blevet testet kontinuerligt i flere måneder inde i en befugtet CO2 -inkubator uden problemer. Derudover kan eksperimentatoren med reversible systemer såsom PhyB optogenetiske systemer muligvis programmere specifikke pulserende belysningsplaner. I vores tidligere arbejde4 brugte vi pulserende programmer til at teste reversibilitetsdynamikken af en PhyB-PIF3-switch i pattedyrceller gennem brugergrænsefladen. Ved hjælp af den metode, der er beskrevet i dette manuskript, er programmering af en pulserende protokol let, hvilket giver den fleksibilitet og autonomi, der er nødvendig for mange typer optogenetiske eksperimenter på en brugervenlig måde.
De mest kritiske trin i opbygningen af dette system inkluderer at sammensætte det elektriske kredsløb på printkortet og forbinde komponenterne, som er beskrevet i afsnit 1 og afsnit 2. Det er vigtigt nøje at følge hvert trin i disse sektioner og dobbelttjekke pinhole-numrene linje for linje, før du lodder hver komponent. Afsnit 2 forklarer, hvordan du konfigurerer de komponenter, der skal tilsluttes kredsløbet. For at komponenterne tilsluttes i den rigtige retning, er det især vigtigt at sikre, at farverne på de sorte og røde ledninger på ledning-til-tråd-stikkene matcher. Små forglemmelser i disse to sektioner vil meget sandsynligt påvirke systemets funktionalitet. Faktisk vil det første trin i fejlfinding af denne metode være at kontrollere, at kredsløbet blev bygget korrekt, og at alle forbindelser er på plads. For det andet er det særlig vigtigt at kontrollere loddekvaliteten for løse forbindelser og ledningerne til flaring af trådhår, der kan kortslutte kredsløbet. Et tredje trin ville være at sikre, at lysdioderne fungerer korrekt, hvilket kan gøres ved hjælp af en strømforsyning eller et 1,5 V batteri ved at klippe LED'ens to terminaler med alligatorklip. En anden potentielt kritisk overvejelse er at forhindre opvarmning (når du bruger LED'erne ved høj effekt) eller diffundere lyset for bredere spredt belysning. For at imødekomme disse overvejelser kan LED'erne monteres uden for en sort boks med "privatlivsfilm" på indersiden, som beskrevet i supplerende figur 23 og Allen et al.5. På grund af enkelheden i dette system er det ikke svært at skille det ad for at verificere, ændre, opgradere eller reparere modulære komponenter.
En anden kritisk faktor for inducerbare gensystemer er at overveje, hvor meget aktivering der kræves, eller hvor meget lækage der er acceptabel for det biologiske system, der kontrolleres. Som vist i figur 6 kan disse variere med mængden af reporter-DNA. Derudover vil transfektionseffektiviteten og derfor kopiantallet af reporterkonstruktioner i hver celle variere. Det kan være fordelagtigt for nogle eksperimenter at lave en cellelinje med en fast mængde reporter- eller PhyB-genkontaktkomponenter og screene for kloner med det ønskede interval af induceret ekspression, som det almindeligvis gøres med lægemiddelinducerbare systemer. På grund af størrelsen og ustabiliteten af lentiviral plasmid pPK-2304 lavede vi også ikke-lentivirale plasmidversioner af PhyB-kontakten i pcDNA-rygraden pPK-351 (Addgene #157921) og pPK-352 (Addgene #157922).
Ved at opbygge dette LED-belysningssystem efter denne protokol, brugere har alle de nødvendige komponenter til at udføre en bred vifte af optogenetiske eksperimenter in vitro og in vivo. Kombineret med instruktionerne til brug af PhyB-PIF3 i pattedyrceller vil denne protokol give ikke-ingeniører og biologer mulighed for fleksibelt og effektivt at bruge PhyB-baseret optogenetik i en række sammenhænge.

Optogenetiske værktøjer bliver allestedsnærværende, og ny teknologi udvikles konstant til optisk styring af biologiske processer såsom genekspression, cellesignalering og mange flere 1,2,3. Evnen til at styre cellulære processer med lys giver mulighed for hurtig kinetik, stram rumlig kontrol og dosisafhængig regulering, der kan styres af lysintensitet og eksponeringstid. For at bruge disse værktøjer er en enhed til styring af disse parametre nødvendig. Vi har for nylig udviklet en genetisk kodet PhyB-PIF3 pattedyrs genkontakt, der reversibelt aktiverer og deaktiverer gener ved hjælp af henholdsvis rødt/langt rødt lys4. Dette system blev testet i flere pattedyrcellelinjer og muliggjorde uovertruffen induktion af genekspression selv med meget små mængder lys, herunder lysimpulser. Forskere, der ønsker at bruge PhyB-kontakten og lignende værktøjer 5,6, anmoder ofte om oplysninger om metoder til styring af belysningens intensitet og varighed. Derfor udviklede vi denne protokol med trinvise instruktioner for at muliggøre bredere anvendelse af disse værktøjer til optogenetik.
Før den udbredte anvendelse af lysdioder blev bredbåndslyskilder med filtre brugt til at studere lysresponsive proteiner såsom fytokromer7. For nylig, nogle LED-belysningssystemer er blevet offentliggjort sammen med optogenetiske værktøjer 8,9,10,11,12, men disse protokoller kan kræve betydelig ekspertise inden for elektronik / software, kræve specialudstyr (f.eks. 3D-printere, laserskæremaskiner eller fotomasker) eller giver ikke de trinvise instruktioner, som nogle forskere skal implementere til deres forskningsbehov. Mens uafhængig kontrol af individuelle brønde i en multibrøndplade kan være nyttig, er det ofte unødvendigt, når forskere kun behøver at sammenligne flere forskellige prøver i lyst og mørkt eller rødt lys versus langt rødt lys. Mange eksisterende kommercielle systemer er også dyre med begrænset tilpasningsevne. Imidlertid er LED'erne beskrevet i denne protokol omkostningseffektive, lyse, og kan monteres på mange måder; Derfor kan de bruges til at belyse flere forskellige typer prøver. Med protokollen og den medfølgende software kan lysdioder, der spænder fra ultraviolet (UV) til NIR, bruges og styres med software til at udføre optogenetiske eksperimenter ved hjælp af UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV-domæner 17,18, Step Function Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, bakterielle fytokromer26,27,28,29 og andre lysfølsomme systemer 30,31,32.
Denne protokol udgør en tutorial til samling af kredsløb og anden hardware, der er nødvendig for at kontrollere forskellige parametre til lysstimulering samt de molekylære / cellulære værktøjer til at køre et optogenetisk eksperiment. Derudover rapporterer vi plasmider optimeret fra Kyriakakis et al.4 , der er mindre og mere stabile til kloning. Gennem denne protokol kan biologer uden ekspertise inden for elektronik og optik bygge belysningssystemer, der er fleksible og robuste. På en trinvis måde viser vi, hvordan man bygger LED-systemer og fjerner den tekniske flaskehals for en bredere anvendelse af optogenetiske værktøjer. Dette system kan let bruges i de fleste cellekulturinkubatorer, selvom de ikke indeholder trådporte. For eksempel har vi opbevaret LED-systemet i en befugtet CO2 -inkubator kontinuerligt i mere end 6 måneder uden fald i ydeevnen. Vi forklarer også, hvordan du forbinder LED-systemet til en computer og forbinder det med open source-software, vi leverer på GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Opbygning af et system ved hjælp af denne protokol giver forskere den grundlæggende viden til at fejlfinde potentielle problemer, udskifte dele og forbedre / udvide funktionaliteter.
Systemoversigt
Opbygning af belysningssystemet involverer (1) opbygning af det elektroniske kredsløb, (2) opbygning af periferiudstyr (strømforsyningsledning, afbryder osv.), (3) opbygning af lysdioderne, (4) samling af alle disse komponenter og (5) installation af softwaren til styring af lysdioderne med en brugergrænseflade (figur 1A). Når belysningssystemet er færdigt, kan det styre op til fire lysdioder uafhængigt med en brugergrænseflade (figur 1B). Brugergrænsefladen gør det muligt for hver LED at pulsere med bestemte tidsintervaller og slukke efter et bestemt tidspunkt. Der er også en startforsinkelse for at starte belysningsprogrammer på et bestemt tidspunkt. Potentiometre (POT'er) regulerer hver LED's intensitet uafhængigt eller kan bruges til manuel LED-kontrol uden en computer. Ledningerne til lysdioderne kan være enhver brugerdefineret længde, så de let kan placeres i en inkubator eller laboratorieplads. På grund af disse lysdioders høje effekt kan de bruges til at belyse et stort område med en enkelt LED på afstand.
Beskrivelse af LED-driver
For at drive og kontrollere LED'ernes intensitet gennemgår denne protokol trin for at opbygge en "LED-driver". Hver LED har en række spændinger, hvor den fungerer (figur 1C). Under drift kan regulatorens udgangsspænding, som styrer lysintensiteten, indstilles af et potentiometer. POT varierer modstanden og justerer udgangsspændingen/lysstyrken. Tuning med en 1kΩ (1 kilo-ohm) POT giver det, vi kalder "højspændingskredsløbet" og har en rækkevidde på 1,35 V til 2,9 V. Da 2,9 V er for høj til betjening af lavspændings-LED'erne (figur 1C), viser vi en enkelt ændring (modstand 3 eller "R3" supplerende figur 1A), der begrænser rækkevidden til at matche lavspændings-LED'erne. R3 tjener til at reducere den maksimale spænding, der påføres LED'erne, til 1,85 V (samling beskrevet i supplerende figur 8), når den er parallel med potentiometeret. Ved at bruge spænding til at styre lysstyrken i stedet for strøm er systemet mere fleksibelt til lysdioder med forskellige driftsspændinger. Figur 1C indeholder en liste over høj- og lavspændings-LED'er til at guide det optimale kredsløbsvalg. Dette design holder minimumsspændingen lav nok, så LED'en er helt slukket, når potentiometeret er slukket, og tillader ikke, at spændingen går over LED'ens typiske driftsspænding. Til PhyB-optogenetik bruger vi dybe røde og langt røde lysdioder, der bruger lavspændingskredsløbet.
Beskrivelse af LED-computerstyringssystem
LED-belysningssystemet kan bruges til konstant belysning uden computer eller mikrocontroller. Til pulserende programmer og til styring af individuel LED-timing skal der dog installeres en mikrocontroller. For at bruge en mikrocontroller til at styre lysdioderne kræves en transistor for at forbinde mikrocontrolleren til kredsløbet. Denne transistor registrerer spænding fra mikrocontrolleren og skifter fra at være ledende eller isolerende. For at styre "on" og "off" bruger vi det, der kaldes en "NPN switching type transistor" (2N2222) som en kontrollerbar shunt over R2 (supplerende figur 1A). Når spændingen fra mikrocontrolleren påføres transistorbasen, transistoren bliver ledende og gør LED-spændingen lav og slukker LED'en. Således styres LED og transistorens tænd og sluk-tilstande direkte af mikrocontrolleren, som styres af den software, der er installeret på pc'en.
For at fremstille belysningssystemet kræves følgende trin: Byg det elektriske kredsløb; bygge strømforsyningen, manuel afbryder, POT'er og mikrocontrollerforbindelse; bygge lysdioderne; rumme en sort boks, der passer til belysningssystemet; tilslut alle ledninger og enheder; installer LED-styringssoftwaren, stimulere cellerne med lys; Mål genekspression ved hjælp af et dobbelt luciferase-assay.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18AWG 2pin RED Black wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>15M-28AWG-2468</td>
			<td>Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1K Ohm potentiometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>52161500</td>
			<td>2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge Silicone JST Connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIM&#38;NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG solid jumper wires</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

Kontrol af biologiske processer ved hjælp af lys har øget nøjagtigheden og hastigheden, hvormed forskere kan manipulere mange biologiske processer. Optisk kontrol giver mulighed for en hidtil uset evne til at dissekere funktion og har potentialet til at muliggøre nye genetiske terapier. Imidlertid kræver optogenetiske eksperimenter tilstrækkelige lyskilder med rumlig, tidsmæssig eller intensitetskontrol, ofte en flaskehals for forskere. Her beskriver vi, hvordan man bygger et billigt og alsidigt LED-belysningssystem, der let kan tilpasses til forskellige tilgængelige optogenetiske værktøjer. Dette system kan konfigureres til manuel eller computerstyring med justerbar LED-intensitet. Vi leverer en illustreret trin-for-trin guide til opbygning af kredsløbet, hvilket gør det computerstyret og konstruerer lysdioderne. For at lette samlingen af denne enhed diskuterer vi også nogle grundlæggende loddeteknikker og forklarer kredsløbet, der bruges til at styre lysdioderne. Ved hjælp af vores open source-brugergrænseflade kan brugerne automatisere præcis timing og pulsering af lys på en personlig computer (pc) eller en billig tablet. Denne automatisering gør systemet nyttigt til eksperimenter, der bruger lysdioder til at kontrollere gener, signalveje og andre cellulære aktiviteter, der spænder over store tidsskalaer. For denne protokol kræves der ingen forudgående ekspertise inden for elektronik for at bygge alle de nødvendige dele eller bruge belysningssystemet til at udføre optogenetiske eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører optogenetiske eksperimenter til kontrol af genekspression med rødt og langt rødt lys ved hjælp af PhyB og PIF3. Inkluderet er trinvise instruktioner til opbygning af et enkelt og fleksibelt belysningssystem, som muliggør kontrol af genekspression eller anden optogenetik med en computer.

Opbygning af et enkelt og alsidigt belysningssystem til optogenetiske eksperimenter

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Systemet giver forskere mulighed for nemt at konstruere et billigt og alsidigt belysningssystem til optogenetiske eksperimenter. Fordele ved denne teknik inkluderer evnen til at programmere LED-belysningstiming med tilgængelige bølgelængder, der spænder over det synlige nær IR-spektrum, og at lysdioderne kan bruges i forskellige sammenhænge For at opbygge et elektrisk kredsløb, klip printkortet på hjælpehænderne og indsæt jumperledningerne, forbinder dem for at danne A1 og A3 pinholes til jorden, D2-jumperledningen ind i D6-pinhullet, og strømforsyningen plus nummer syv jumperledninger ind i A7-pinhullet. Bøj klemmerne 45 grader og tilføj flux.Efter lodning skal du trimme bagsiden af ledningerne. Indsæt den ene ende af den loddede hunledning til ledningsforbindelse i A5-hullet. Tilslut derefter den ene ende af modstanden til A5-hullet.Tilslut den anden ende af stikket til jorden. Tilslut derefter den anden ende af modstanden til jorden og lod forbindelsen. For Arduino-stikket skal du krympe enderne af ledningen til ledningsstik og skubbe de krympede ender gennem det rektangulære stik.For at indstille lysdioderne skal du tin en ledning ved opvarmning nedenfra, mens du tilføjer lodning fra toppen. Placer en generøs mængde lodning over den store loddespids, og brug spidsen til at opvarme LED-basen ved kontakten, der indeholder flux. Efter et par sekunder skal du trække loddet individuelt hen over hver kontakt og fastgøre den sorte ledning på katoden ved hjælp af en hårklemme.Placer en generøs mængde lodning på den store loddespids, og tryk spidsen på ledningen, indtil loddet på LED-basen smelter. Hold ledningen nede, og fjern loddejernet, mens du holder ledningen på plads. Placer en lille mængde loddepasta på puderne til LED-tilslutningerne, og brug tang til at placere LED'en over puderne.Hold den fortinnede røde ledning på anoden, og brug en hårklemme til at klippe ledningen. Tilsæt lodning til den store spids som vist, og tryk spidsen på forbindelsen, indtil loddet på LED-basen smelter, og loddepastaen smelter og bliver sølv. For at fremstille LED-ledningerne skal du placere et 4.76 millimeter krymperør over ledningen, der er skåret i længden, og et 3.18 millimeter krymperør over ledningen til ledningsstikket.Strip og tilsæt flux til trådenderne. Brug hjælpende hænder til at klemme ledningen til ledningsstikket og drej stikkets ende med den ene ledningsende. Lod materialerne sammen og fastgør den anden ledning til opsætningen på samme måde og lodde.Sæt derefter LED-ledningerne fast til de hjælpende hænder med tape under LED-basen. Bland derefter epoxy i henhold til producentens anvisninger og spred epoxy over toppen af loddet LED. Brug spadeboret til at bore et hul på 1,5 centimeter gennem toppen af kassen, hvorpå LED'en skal placeres, og brug et højhastighedsdrejeværktøj til at lave et hak på den ene side af hullet for at gøre plads til LED-ledningen.Sæt et 25 til 30 millimeter stykke privatlivsfilm på den sorte boks, der dækker hullet, som LED'en lyser igennem, og tape LED'en uden for den sorte boks oven på hullet. For et fire LED-styresystem skal du bore fire 0,83 centimeter huller 3,81 centimeter fra hinanden i låget på kassen og bruge et højhastighedsroterende værktøj til at skære et rektangulært hul på 1,19 x 1,90 centimeter i øverste venstre hjørne. Brug et spadebor til at bore et hul på 1,5 centimeter bag på kassen og indsætte en grommet i hullet.For de computerstyrede lysdioder skal du sandpapir det område, hvor mikrocontrolleren limes i kassen, samt undersiden af mikrocontrollerholderen. Klik mikrocontrolleren på holderen, og epoxy derefter holderen og kassen sammen, før du fastgør holderen i den sorte boks. Placer derefter dobbeltklæbende tape på clipsen, og fastgør clipsen inde i kassen.I prøver, der transfekteres for at udtrykke fytokrom B, men ikke phycocyaninbilin, øges utætheden, når mængden af reporter-DNA øges. Derudover, når hele phytochrome B-genkontakten inklusive phycocyaninbilinkromotourproducerende plasmid belyses med langt rødt lys, øges luciferaseekspressionen også med de stigende mængder reporterkonstruktion inden for transfektionsblandingen. Tilsvarende, når de lysfølsomme celler belyses med rødt lys, øges luciferase-ekspressionen også med øget reportermængde.Når man sammenligner induktionsniveauer af de røde lysbehandlede celler med de langt røde lysbehandlede celler, et lille fald i foldaktiveringen findes med stigende mængder reporter. Det er vigtigt at følge hvert trin nøje, når du bygger det elektriske kredsløb, og at dobbelttjekke pinhole-numrene linje for linje, før du lodder hver komponent. Denne protokol kan bruges til optisk stimulering af mange typer prøver eller optogenetiske værktøjer ved hjælp af forskellige bølgelængder og tillader programmering af belysningsplaner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En alsidig Automatiseret platform for Micro-skala cellestimulering Eksperimenter

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Mikrofluid Chip til Alsidig kemisk analyse af enkelte celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

En guide til Structured Illumination TIRF Mikroskopi på High Speed ​​med flere farver

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering af en automatiseret lysende, Dyrkning, og Sampling System for Mikrobiel optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

En simpel og skalerbar Fabrication Metode til Økologisk Elektroniske enheder om tekstiler

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Et alsidigt Metode til mønstring Proteiner og celler

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorør som et alsidigt værktøj til at studere Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex Genome redigering af Saccharomyces cerevisiae og skabelsen af gær pixel kunst

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer til Open Source-Mikroplade kompatible belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Enkel, overkommelig og modulær mønstre af celler ved hjælp af DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...