Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

We willen Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang en Molly Allen bedanken voor het testen van verschillende versies van het LED-systeem terwijl het werd ontwikkeld. Dit werk werd ondersteund door het Kavli Institute for Brain and Mind aan UC San Diego en het Salk Institute, National Science Foundation via het NSF Center for Science of Information onder Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 en NIH Grant R21DC018237.

<ol>
	<li>Klewer, L., Wu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+dimerization+approaches+to+control+cellular+processes.">Light-induced dimerization approaches to control cellular processes.</a> Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).</li><li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms.">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li><li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology.">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).</li><li>Kyriakakis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+orthogonal+molecules+using+ferredoxin+and+ferredoxin-NADP++reductase+systems+enables+genetically+encoded+PhyB+optogenetics.">Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).</li><li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics.">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li><li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptochrome,+phytochrome,+and+anthocyanin+production.">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li><li>Hern&#225;ndez-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+cryptochrome+2+(CRY2).">Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2).</a> Methods. 164-165, 81-90 (2019).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics.">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).</li><li>M&#252;ller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch.">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363 (2016).</li><li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells.">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779 (2013).</li><li>Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-triggered+protein+secretion+system.">A light-triggered protein secretion system.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).</li><li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains.">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li><li>Zhou, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-chain+photoswitchable+CRISPR-Cas9+architecture+for+light-inducible+gene+editing+and+transcription.">A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).</li><li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins.">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256 (2015).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li><li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques.">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li><li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase.">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>M&#252;ller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red/far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch+to+control+gene+expression+in+mammalian+cells.">A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Levskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+engineering+Escherichia+coli+to+see+light.">Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light.</a> Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).</li><li>Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+phytochrome-based+optogenetic+system+controllable+with+near-infrared+light.">A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light.</a> Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).</li><li>Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+optogenetic+pair+for+protein+regulation+and+spectral+multiplexing.">Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing.</a> Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).</li><li>Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+E.+coli+near-infrared+light+sensor.">Engineering an E. coli near-infrared light sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+with+a+photocleavable+protein,+PhoCl.">Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl.</a> Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain.">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li><li>Kim, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-gated+detection+of+protein-protein+interactions+with+transcriptional+readout.">Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het hier beschreven LED-systeem is in ons lab gebruikt om verschillende optogenetische hulpmiddelen te optimaliseren, te karakteriseren en ermee te werken. In Kyriakakis et al.4 hebben we veel combinaties van PhyB-PIF-genschakelaars parallel getest. Vervolgens gebruikten we dit systeem om lichtpulsen op verschillende frequenties te testen om de kinetiek van de genschakelaar en de effectieve lichtintensiteit te meten. Dit systeem werd ook gebruikt om twee optogenetische systemen te optimaliseren en te karakteriseren die blauw licht gebruiken voor stimulatie 5,6. Omdat slechts één LED helder genoeg hoefde te zijn om de meeste optogenetische hulpmiddelen te activeren, is het niet altijd nodig om een systeem met grote aantallen LED's over elke put te kopen. Deze opstelling is goedkoop, betrouwbaar, eenvoudig opnieuw te configureren en vereist geen voorafgaande elektrische expertise om het montageprotocol te volgen.
In de aanvullende aanvullende figuren 31-38 beschrijven we hoe u maximaal vier LED's in het systeem kunt opnemen. Hoewel dit sommige experimenten kan beperken die een groot aantal parallelle omstandigheden vereisen, kunnen meer LED's worden toegevoegd door de 9 Volt-voeding die in dit protocol wordt gebruikt, te vervangen door een hoger wattage. Op dezelfde manier kunnen verschillende LED's met een lager vermogen parallel aan elk circuit worden aangesloten. In deze laatste opstelling zullen sommige LED's niet individueel worden aangestuurd, maar dit kan handig zijn wanneer er veel LED's nodig zijn om een groter gebied te bestrijken. Eenmaal bekend met de elektronica van dit systeem, zijn er veel manieren om het aan te passen. Aanvullende strategieën voor het aanpassen van het systeem omvatten het plaatsen van de LED verder of dichter bij het monster en het verlichten door filters / diffusers voor homogene verlichtingsomstandigheden of om verwarming te voorkomen zoals in (aanvullende figuur 23) en Allen et al.5. Een ander opvallend kenmerk van ons LED-ontwerp is dat het is ingekapseld in epoxy en een aanraaksluiting aan de achterkant heeft; hierdoor kan de LED vrijwel overal veilig en gemakkelijk worden geplaatst: in incubators, vistanks, dierenkooien, muren, enz.
Veel experimenten die optogenetica gebruiken om genen, signaalroutes en andere cellulaire activiteit te regelen, vereisen vaak pulseren, overspannen grote tijdschalen of moeten worden uitgevoerd in een incubator, waardoor automatisering of manipulatie op afstand zonder microscoop vereist is. Dit LED-systeem is gedurende enkele maanden continu getest in een bevochtigde CO2-incubator zonder problemen. Bovendien, met omkeerbare systemen zoals PhyB optogenetische systemen, moet de experimentator mogelijk specifieke pulserende verlichtingsschema's programmeren. In ons vorige werk4 gebruikten we pulserende programma's om de reversibiliteitsdynamiek van een PhyB-PIF3-schakelaar in zoogdiercellen te testen via de gebruikersinterface. Met behulp van de methodologie die in dit manuscript wordt beschreven, is het programmeren van een pulserend protocol eenvoudig en biedt het de flexibiliteit en autonomie die nodig is voor vele soorten optogenetische experimenten op een gebruiksvriendelijke manier.
De meest kritieke stappen bij het bouwen van dit systeem zijn het samenstellen van het elektrische circuit op de printplaat en het aansluiten van de componenten, die worden beschreven in sectie 1 en sectie 2. Het is essentieel om elke stap in deze secties zorgvuldig te volgen en de pinhole-nummers regel voor regel te controleren voordat u elk onderdeel soldeert. In hoofdstuk 2 wordt uitgelegd hoe u de componenten instelt die op het circuit worden aangesloten. Om ervoor te zorgen dat de componenten in de juiste richting aansluiten, is het vooral belangrijk om ervoor te zorgen dat de kleuren van de zwarte en rode draden op de draad-naar-draad connectoren overeenkomen. Kleine vergissingen in deze twee secties zullen zeer waarschijnlijk van invloed zijn op de functionaliteit van het systeem. Inderdaad, de eerste stap bij het oplossen van problemen met deze methode is om te controleren of het circuit correct is gebouwd en of alle verbindingen aanwezig zijn. Ten tweede is het van bijzonder belang om de soldeerkwaliteit te controleren op losse verbindingen en de draden op affakkelende draden die het circuit kortsluiten. Een derde stap zou zijn om ervoor te zorgen dat de LED's correct werken, wat kan worden gedaan met behulp van een voeding of een 1,5 V-batterij door de twee aansluitingen van de LED met alligatorclips te knippen. Een andere potentieel kritische overweging is om verwarming te voorkomen (bij gebruik van de LED's op hoog vermogen) of het verspreiden van het licht voor een bredere spreadverlichting. Om deze overwegingen aan te pakken, kunnen de LED's buiten een zwarte doos worden gemonteerd met "privacyfilm" aan de binnenkant, zoals beschreven in aanvullende figuur 23 en Allen et al.5. Vanwege de eenvoud van dit systeem is het niet moeilijk om het uit elkaar te halen om modulaire componenten te verifiëren, aan te passen, te upgraden of te repareren.
Een andere kritische factor voor induceerbare gensystemen is om te overwegen hoeveel activering vereist is of hoeveel lekkage acceptabel is voor het biologische systeem dat wordt gecontroleerd. Zoals te zien is in figuur 6, kunnen deze variëren met de hoeveelheid reporter-DNA. Bovendien zal de transfectie-efficiëntie en dus het aantal reporterconstructies in elke cel variëren. Het kan voor sommige experimenten voordelig zijn om een cellijn te maken met een vaste hoeveelheid reporter- of PhyB-genschakelaarcomponenten en te screenen op klonen met het gewenste bereik van geïnduceerde expressie, zoals vaak wordt gedaan met induceerbare systemen voor geneesmiddelen. Vanwege de grootte en instabiliteit van lentivirale plasmide pPK-2304, maakten we ook niet-lentivirale plasmideversies van de PhyB-schakelaar in de pcDNA-backbone pPK-351 (Addgene #157921) en pPK-352 (Addgene #157922).
Door dit LED-verlichtingssysteem volgens dit protocol te bouwen, beschikken gebruikers over alle componenten die nodig zijn om een breed scala aan optogenetische experimenten in vitro en in vivo uit te voeren. In combinatie met de instructies voor het gebruik van PhyB-PIF3 in zoogdiercellen, zal dit protocol niet-ingenieurs en biologen in staat stellen om, flexibel en effectief, op PhyB gebaseerde optogenetica in verschillende contexten te gebruiken.

Optogenetische hulpmiddelen worden alomtegenwoordig en er wordt voortdurend nieuwe technologie ontwikkeld om biologische processen zoals genexpressie, celsignalering en nog veel meeroptisch te beheersen 1,2,3. De mogelijkheid om cellulaire processen met licht te regelen, zorgt voor snelle kinetiek, strakke ruimtelijke controle en dosisafhankelijke regulatie die kan worden geregeld door lichtintensiteit en blootstellingstijd. Om deze tools te gebruiken, is een apparaat nodig om deze parameters te regelen. We hebben onlangs een genetisch gecodeerde PhyB-PIF3 zoogdiergenschakelaar ontwikkeld die genen reversibel activeert en deactiveert met behulp van rood / verrood licht, respectievelijk4. Dit systeem werd getest in verschillende zoogdiercellijnen en maakte de ongeëvenaarde inductie van genexpressie mogelijk, zelfs met zeer kleine hoeveelheden licht, waaronder lichtpulsen. Onderzoekers die de PhyB-schakelaar en soortgelijke hulpmiddelen 5,6 willen gebruiken, vragen vaak om informatie over methoden om de intensiteit en duur van de verlichting te regelen. Daarom hebben we dit protocol ontwikkeld met stapsgewijze instructies om een bredere acceptatie van deze tools voor optogenetica mogelijk te maken.
Vóór het wijdverbreide gebruik van LED's werden breedbandlichtbronnen met filters gebruikt om lichtgevoelige eiwitten zoals fytochromen7 te bestuderen. Onlangs zijn sommige LED-verlichtingssystemen gepubliceerd samen met optogenetische hulpmiddelen 8,9,10,11,12, maar die protocollen kunnen aanzienlijke expertise in elektronica / software vereisen, gespecialiseerde apparatuur vereisen (bijv. 3D-printers, lasersnijmachines of fotomaskers), of bieden niet de stapsgewijze instructies die sommige onderzoekers nodig zouden hebben om in te zetten voor hun onderzoeksbehoeften. Hoewel onafhankelijke controle van individuele putten in een multiwellplaat nuttig kan zijn, is het vaak niet nodig wanneer onderzoekers slechts verschillende monsters in licht en donker of rood licht versus verrood licht hoeven te vergelijken. Ook zijn veel bestaande commerciële systemen duur, met beperkte aanpassingsmogelijkheden. De LED's die in dit protocol worden beschreven, zijn echter kosteneffectief, helder en kunnen op vele manieren worden gemonteerd; daarom kunnen ze worden gebruikt om verschillende soorten monsters te verlichten. Met het protocol en de meegeleverde software kunnen LED's variërend van ultraviolet (UV) tot NIR worden gebruikt en bestuurd met software om optogenetische experimenten uit te voeren met UVR813,14, Dronpa15,16,LOV-domeinen 17,18, Step Function Opsins19,20, CRY221,22, PhyB 4,23,24 ,25, bacteriële fytochromen 26,27,28,29 en andere lichtgevoelige systemen 30,31,32.
Dit protocol vormt een tutorial voor de assemblage van de circuits en andere hardware die nodig is om verschillende parameters voor lichtstimulatie te regelen, evenals de moleculaire / cellulaire hulpmiddelen om een optogenetisch experiment uit te voeren. Daarnaast rapporteren we plasmiden geoptimaliseerd van Kyriakakis et al.4 die kleiner en stabieler zijn voor klonen. Via dit protocol kunnen biologen zonder expertise in elektronica en optica verlichtingssystemen bouwen die flexibel en robuust zijn. Stap voor stap laten we zien hoe je LED-systemen bouwt, waardoor de technische bottleneck voor de bredere adoptie van optogenetische tools wordt weggenomen. Dit systeem kan gemakkelijk worden gebruikt in de meeste celkweekincubators, zelfs als ze geen draadpoorten bevatten. Zo hebben we het LED-systeem langer dan 6 maanden onafgebroken in een bevochtigde CO2-incubator gehouden zonder dat de prestaties afnemen. We leggen ook uit hoe je het LED-systeem op een computer aansluit en koppelt met open-source software die we op GitHub aanbieden (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Het bouwen van een systeem met behulp van dit protocol biedt onderzoekers de basiskennis om potentiële problemen op te lossen, onderdelen te vervangen en functionaliteiten te verbeteren / uit te breiden.
Overzicht van het systeem
Het bouwen van het verlichtingssysteem omvat (1) het bouwen van het elektronische circuit, (2) het bouwen van de randapparatuur (voedingskabel, aan / uit-schakelaar, enz.), (3) het bouwen van de LED's, (4) het assembleren van al deze componenten en (5) het installeren van de software om de LED's te bedienen met een gebruikersinterface (figuur 1A). Eenmaal voltooid, kan het verlichtingssysteem maximaal vier LED's onafhankelijk van elkaar bedienen met een gebruikersinterface (figuur 1B). De gebruikersinterface stelt elke LED in staat om met bepaalde tijdsintervallen te pulseren en na een bepaalde tijd uit te schakelen. Er is ook een start-vertraging om verlichtingsprogramma's op een bepaald tijdstip te starten. Potentiometers (POTs) regelen de intensiteit van elke LED onafhankelijk of kunnen worden gebruikt voor handmatige LED-besturing zonder computer. De draden naar de LED's kunnen elke aangepaste lengte hebben, waardoor ze gemakkelijk in een incubator of laboratoriumruimte kunnen worden geplaatst. Vanwege het hoge vermogen van deze LED's kunnen ze worden gebruikt om een groot gebied met een enkele LED van een afstand te verlichten.
LED driver beschrijving
Om de intensiteit van de LED's van stroom te voorzien en te regelen, doorloopt dit protocol stappen om een "LED-stuurprogramma" te bouwen. Elke LED heeft een reeks spanningen waarin het werkt (figuur 1C). Tijdens bedrijf kan de uitgangsspanning van de regelaar, die de lichtintensiteit regelt, worden afgestemd door een potentiometer. De POT varieert de weerstand en past de uitgangsspanning/helderheid aan. Tuning met een 1kΩ (1 kilo-ohm) POT geeft wat we het "hoogspanningscircuit" noemen en heeft een bereik van 1,35 V tot 2,9 V. Aangezien 2,9 V te hoog is voor het bedienen van de LED's met lagere spanning (figuur 1C), tonen we een enkele wijziging (weerstand 3 of "R3" aanvullende figuur 1A) die het bereik beperkt om overeen te komen met de laagspannings-LED's. R3 dient om de maximale spanning die op de LED's wordt toegepast te verlagen tot 1,85 V (assemblage beschreven in aanvullende figuur 8) wanneer deze parallel loopt met de potentiometer. Door spanning te gebruiken om de helderheid te regelen in plaats van stroom, is het systeem flexibeler voor LED's met verschillende bedrijfsspanningen. Figuur 1C bevat een lijst van de hoog- en laagspannings-LED's om de optimale circuitselectie te begeleiden. Dit ontwerp houdt de minimale spanning laag genoeg zodat de LED volledig uit is wanneer de potentiometer is uitgeschakeld en de spanning niet boven de typische bedrijfsspanning van de LED kan komen. Voor PhyB-optogenetica gebruiken we dieprode en verrode LED's, die het laagspanningscircuit gebruiken.
Beschrijving van het LED-computerbesturingssysteem
Het LED-verlichtingssysteem kan worden gebruikt voor constante verlichting zonder een computer of microcontroller. Voor pulserende programma's en voor het regelen van individuele LED-timing moet echter een microcontroller worden geïnstalleerd. Om een microcontroller te gebruiken om de LED's te bedienen, is een transistor nodig om de microcontroller op het circuit aan te sluiten. Deze transistor detecteert spanning van de microcontroller en schakelt over van geleidend of isolerend. Om de "aan" en "uit" te regelen, gebruiken we een zogenaamde "NPN switching type transistor" (2N2222) als een controleerbare shunt over R2 (aanvullende figuur 1A). Wanneer de spanning van de microcontroller wordt toegepast op de transistorbasis, wordt de transistor geleidend en maakt de LED-spanning laag, waardoor de LED wordt uitgeschakeld. Zo worden de LED- en transistor-aan- en uit-toestanden rechtstreeks bestuurd door de microcontroller, die wordt bestuurd door de software die op de pc is geïnstalleerd.
Voor het maken van het verlichtingssysteem zijn de volgende stappen vereist: Bouw het elektrische circuit; bouw de voeding, handmatige aan/ uit-schakelaar, POP's en microcontrolleraansluiting; bouw de LED's; een zwarte doos te plaatsen die past bij het verlichtingssysteem; sluit alle bedrading en apparaten aan; installeer de LED-besturingssoftware, stimuleer de cellen met licht; genexpressie meten met behulp van een dubbele luciferasetest.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18AWG 2pin RED Black wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>15M-28AWG-2468</td>
			<td>Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1K Ohm potentiometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>52161500</td>
			<td>2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge Silicone JST Connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIM&#38;NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG solid jumper wires</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

Het beheersen van biologische processen met behulp van licht heeft de nauwkeurigheid en snelheid waarmee onderzoekers veel biologische processen kunnen manipuleren verhoogd. Optische controle zorgt voor een ongekend vermogen om de functie te ontleden en heeft het potentieel om nieuwe genetische therapieën mogelijk te maken. Optogenetische experimenten vereisen echter adequate lichtbronnen met ruimtelijke, temporele of intensiteitscontrole, vaak een knelpunt voor onderzoekers. Hier beschrijven we hoe u een goedkoop en veelzijdig LED-verlichtingssysteem kunt bouwen dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende beschikbare optogenetische hulpmiddelen. Dit systeem is configureerbaar voor handmatige of computerbesturing met instelbare LED-intensiteit. We bieden een geïllustreerde stapsgewijze handleiding voor het bouwen van het circuit, het computergestuurd maken en het construeren van de LED's. Om de montage van dit apparaat te vergemakkelijken, bespreken we ook enkele basissoldeertechnieken en leggen we de circuits uit die worden gebruikt om de LED's te besturen. Met behulp van onze open-source gebruikersinterface kunnen gebruikers nauwkeurige timing en pulseren van licht op een pc of een goedkope tablet automatiseren. Deze automatisering maakt het systeem nuttig voor experimenten die LED's gebruiken om genen, signaalroutes en andere cellulaire activiteiten te regelen die grote tijdschalen overspannen. Voor dit protocol is geen voorafgaande expertise in elektronica vereist om alle benodigde onderdelen te bouwen of om het verlichtingssysteem te gebruiken om optogenetische experimenten uit te voeren.

Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Dit protocol beschrijft hoe optogenetische experimenten kunnen worden uitgevoerd voor het beheersen van genexpressie met rood en verrood licht met behulp van PhyB en PIF3. Inbegrepen zijn stapsgewijze instructies voor het bouwen van een eenvoudig en flexibel verlichtingssysteem, dat de controle van genexpressie of andere optogenetica met een computer mogelijk maakt.

Het bouwen van een eenvoudig en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Het systeem stelt onderzoekers in staat om eenvoudig een goedkoop en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten te bouwen. Voordelen van deze techniek zijn onder meer de mogelijkheid om de LED-verlichtingstiming te programmeren met beschikbare golflengten die het zichtbare nabij-IR-spectrum overspannen, en dat de LED's in verschillende contexten kunnen worden gebruikt Om een elektrisch circuit te bouwen, klemt u de printplaat op de helpende handen en plaatst u de jumperdraden, verbindt u ze om de A1- en A3-gaatjes op de grond te vormen, de D2 jumper draad in de D6 pinhole, en de voeding plus nummer zeven jumper draden in de A7 pinhole. Buig de terminals 45 graden en voeg flux toe.Na het solderen knipt u de achterkanten van de draden bij. Steek het ene uiteinde van de gesoldeerde vrouwelijke draad naar de draadconnector in het A5-gat. Sluit vervolgens het ene uiteinde van de weerstand aan op het A5-gat.Sluit het andere uiteinde van de connector aan op de massa. Sluit vervolgens het andere uiteinde van de weerstand aan op de massa en soldeer de verbinding. Voor de Arduino-connector krimpt u de uiteinden van de draad naar draadconnectoren en duwt u de gekrompen uiteinden door de rechthoekige connector.Om de LED's op te zetten, kunt u een draad tin door van onderaf te verwarmen terwijl u soldeer van bovenaf toevoegt. Plaats een royale hoeveelheid soldeermiddel over de grote soldeerpunt en gebruik de punt om de LED-basis te verwarmen bij het contact met flux. Sleep na een paar seconden het soldeer individueel over elk contact en bevestig de zwarte draad op de kathode met behulp van een haarclip.Plaats een royale hoeveelheid soldeer op de grote soldeerpunt en druk de punt op de draad totdat het soldeer op de LED-basis smelt. Houd de draad ingedrukt en verwijder de soldeerbout terwijl u de draad op zijn plaats houdt. Plaats een kleine hoeveelheid soldeerpasta op de pads voor de LED-aansluitingen en gebruik een tang om de LED over de pads te plaatsen.Houd de voorgeklikte rode draad op de anode en gebruik een haarclip om de draad te knippen. Voeg soldeer toe aan de grote punt zoals gedemonstreerd en druk de punt op de aansluiting totdat het soldeer op de LED-basis smelt en de soldeerpasta smelt en zilver wordt. Voor het maken van de LED-draden plaatst u een krimpbuis van 4,76 millimeter over de op lengte gesneden draad en een krimpbuis van 3,18 millimeter over de draad-naar-draadconnector.Strip en voeg flux toe aan de draaduiteinden. Gebruik de helpende handen om de draad naar de draadconnector te knippen en draai het connectoruiteinde met één draaduiteinde. Soldeer de materialen aan elkaar en bevestig de andere draad op dezelfde manier aan de opstelling en soldeer.Klem vervolgens de LED-draden aan de helpende handen met tape onder de LED-basis. Meng vervolgens epoxy volgens de instructies van de fabrikant en verdeel de epoxy over de bovenkant van de gesoldeerde LED. Boor met behulp van de spadeboor een gat van 1,5 centimeter door de bovenkant van de doos waarop de LED wordt geplaatst en gebruik een snel roterend gereedschap om een inkeping aan één kant van het gat te maken om ruimte te maken voor de LED-draad.Plak een stuk privacyfilm van 25 tot 30 millimeter op de zwarte doos die het gat bedekt waar de LED doorheen zal branden en plak de LED buiten de zwarte doos op het gat. Boor voor een vier LED-besturingssysteem vier gaten van 0,83 centimeter op 3,81 centimeter afstand van elkaar in het deksel van de doos en gebruik een snel roterend gereedschap om een rechthoekig gat van 1,19 bij 1,90 centimeter in de linkerbovenhoek te snijden. Boor met behulp van een spadeboor een gat van 1,5 centimeter in de achterkant van de doos en steek een grommet in het gat.Schuur voor de computergestuurde LED's het gebied waar de microcontroller in de doos wordt gelijmd en de onderkant van de microcontrollerhouder. Klik de microcontroller op de houder en epoxy vervolgens de houder en de doos samen voordat u de houder in de zwarte doos vastzet. Plaats vervolgens dubbelzijdige tape op de clip en bevestig de clip in de doos.In monsters die zijn getransfecteerd om fytochroom B tot expressie te brengen, maar niet fycocyanine biline, neemt de lekheid toe naarmate de hoeveelheid reporter-DNA toeneemt. Bovendien, wanneer de volledige fytochroom B-genschakelaar inclusief de phycocyanine bilin chromofour producerende plasmide wordt verlicht met ver rood licht, neemt luciferase-expressie ook toe met de toenemende hoeveelheden reporterconstructie binnen de transfectiemix. Evenzo, wanneer de lichtgevoelige cellen worden verlicht met rood licht, neemt de luciferase-expressie ook toe met een verhoogde hoeveelheid reporter.Bij het vergelijken van inductieniveaus van de met rood licht behandelde cellen met de met rood licht behandelde cellen, wordt een kleine afname van de vouwactivering gevonden bij toenemende hoeveelheden reporter. Het is essentieel om elke stap zorgvuldig te volgen bij het bouwen van het elektrische circuit en om de pinhole-nummers regel voor regel te controleren voordat u elk onderdeel soldeert. Dit protocol kan worden gebruikt voor de optische stimulatie van vele soorten monsters of optogenetische hulpmiddelen met behulp van een verscheidenheid aan golflengten en maakt het programmeren van verlichtingsschema's mogelijk.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopie op hoge snelheid met meerdere kleuren

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Een eenvoudige en schaalbare Fabrication Methode voor biologisch Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex genoom bewerking van Saccharomyces cerevisiae en de creatie van gist pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Toepassingen voor open source Microplate-compatibele verlichtings panelen

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Eenvoudige, betaalbare en modulaire patronen van cellen met behulp van DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...