Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang e Molly Allen per aver testato diverse versioni del sistema LED mentre era in fase di sviluppo. Questo lavoro è stato supportato dal Kavli Institute for Brain and Mind della UC San Diego e dal Salk Institute, National Science Foundation attraverso il NSF Center for Science of Information sotto Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 e NIH Grant R21DC018237.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il sistema LED qui descritto è stato utilizzato nel nostro laboratorio per ottimizzare, caratterizzare e lavorare con diversi strumenti optogenetici . In Kyriakakis et al.4, abbiamo testato molte combinazioni di interruttori del gene PhyB-PIF in parallelo. Abbiamo quindi usato questo sistema per testare impulsi di luce a frequenze diverse per misurare la cinetica dell'interruttore genico e l'effettiva intensità della luce. Questo sistema è stato utilizzato anche per ottimizzare e caratterizzare due sistemi optogenetici che utilizzano la luce blu per la stimolazione 5,6. Poiché solo un LED doveva essere abbastanza luminoso da attivare la maggior parte degli strumenti optogenetici non è sempre necessario acquistare un sistema con un gran numero di LED su ciascun pozzetto. Questa configurazione è economica, affidabile, facile da riconfigurare e non richiede alcuna esperienza elettrica precedente per seguire il protocollo di assemblaggio.
Nelle figure supplementari 31–38, descriviamo come incorporare fino a quattro LED nel sistema. Mentre questo può limitare alcuni esperimenti che richiedono un gran numero di condizioni parallele, più LED possono essere aggiunti sostituendo l'alimentatore a 9 Volt utilizzato in questo protocollo con uno di potenza superiore. Allo stesso modo, diversi LED a bassa potenza possono essere collegati in parallelo a ciascun circuito. In quest'ultima disposizione, alcuni LED non saranno controllati individualmente, ma questo può essere utile quando sono necessari molti LED per coprire un'area più ampia. Una volta acquisita familiarità con l'elettronica di questo sistema, ci sono molti modi per personalizzarlo. Ulteriori strategie per la personalizzazione del sistema includono il posizionamento del LED più lontano o più vicino al campione e l'illuminazione attraverso filtri / diffusori per condizioni di illuminazione omogenee o per prevenire il riscaldamento come in (Figura supplementare 23) e Allen et al.5. Un'altra caratteristica notevole del nostro design a LED è che è incapsulato in resina epossidica e ha una chiusura touch sul retro; ciò consente al LED di essere posizionato in modo sicuro e semplice praticamente ovunque: in incubatori, vasche per pesci, gabbie per animali, pareti, ecc.
Molti esperimenti che utilizzano l'optogenetica per controllare i geni, le vie di segnalazione e altre attività cellulari spesso richiedono pulsazioni, si estendono su grandi scale temporali o devono essere eseguiti in un incubatore, quindi richiedono automazione o manipolazione remota senza microscopio. Questo sistema LED è stato testato ininterrottamente per diversi mesi all'interno di un incubatore a CO2 umidificato senza problemi. Inoltre, con sistemi reversibili come i sistemi optogenetici PhyB, lo sperimentatore potrebbe aver bisogno di programmare programmi di illuminazione pulsante specifici. Nel nostro precedente lavoro4, abbiamo utilizzato programmi di pulsazione per testare la dinamica di reversibilità di uno switch PhyB-PIF3 in cellule di mammifero attraverso l'interfaccia utente. Utilizzando la metodologia descritta in questo manoscritto, la programmazione di un protocollo pulsato è facile, fornendo la flessibilità e l'autonomia necessarie per molti tipi di esperimenti optogenetici in modo user-friendly.
I passaggi più critici nella costruzione di questo sistema includono la messa insieme del circuito elettrico sulla scheda PCB e il collegamento dei componenti, che sono dettagliati nella sezione 1 e nella sezione 2. È essenziale seguire attentamente ogni passaggio in queste sezioni e ricontrollare i numeri stenopeici riga per riga prima di saldare ogni componente. La sezione 2 spiega come impostare i componenti che saranno collegati al circuito. Affinché i componenti si colleghino con l'orientamento corretto, è particolarmente importante assicurarsi che i colori dei fili nero e rosso sui connettori filo-filo corrispondano. Piccole sviste in queste due sezioni molto probabilmente influenzeranno la funzionalità del sistema. In effetti, il primo passo nella risoluzione dei problemi di questo metodo sarà verificare che il circuito sia stato costruito correttamente e che tutte le connessioni siano a posto. In secondo luogo, è di particolare importanza controllare la qualità di saldatura per le connessioni allentate e i fili per i peli di filo svasati che potrebbero cortocircuitare il circuito. Un terzo passo sarebbe quello di assicurarsi che i LED funzionino correttamente, cosa che può essere fatta utilizzando un alimentatore o una batteria da 1,5 V tagliando i due terminali del LED con clip a coccodrillo. Un'altra considerazione potenzialmente critica è quella di prevenire il riscaldamento (quando si utilizzano i LED ad alta potenza) o la diffusione della luce per un'illuminazione più ampia. Per rispondere a queste considerazioni, i LED possono essere montati all'esterno di una scatola nera con "pellicola per la privacy" all'interno, come descritto nella Figura supplementare 23 e Allen et al.5. A causa della semplicità di questo sistema, smontarlo per verificare, modificare, aggiornare o riparare componenti modulari non è difficile.
Un altro fattore critico per i sistemi genici inducibili è considerare quanta attivazione è richiesta o quanta perdita è accettabile per il sistema biologico controllato. Come mostrato nella Figura 6, questi possono variare con la quantità di DNA del reporter. Inoltre, l'efficienza di trasfezione e, quindi, il numero di copie dei costrutti del reporter in ogni cella varierà. Può essere vantaggioso per alcuni esperimenti creare una linea cellulare con una quantità fissa di componenti reporter o PhyB gene-switch e selezionare cloni con l'intervallo desiderato di espressione indotta, come viene comunemente fatto con i sistemi inducibili da farmaci. A causa delle dimensioni e dell'instabilità del plasmide lentivirale pPK-2304, abbiamo anche realizzato versioni plasmidiche non lentivirali dello switch PhyB nella dorsale pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) e pPK-352 (Addgene #157922).
Costruendo questo sistema di illuminazione a LED seguendo questo protocollo, gli utenti hanno tutti i componenti necessari per eseguire una vasta gamma di esperimenti di optogenetica in vitro e in vivo. In combinazione con le istruzioni per l'uso di PhyB-PIF3 nelle cellule di mammifero, questo protocollo consentirà ai non ingegneri e ai biologi di, in modo flessibile ed efficace, utilizzare l'optogenetica basata su PhyB in una varietà di contesti.

Gli strumenti optogenetici stanno diventando onnipresenti e nuove tecnologie vengono costantemente sviluppate per controllare otticamente i processi biologici come l'espressione genica, la segnalazione cellulare e molti altri 1,2,3. La capacità di controllare i processi cellulari con la luce consente una cinetica rapida, uno stretto controllo spaziale e una regolazione dose-dipendente che può essere controllata dall'intensità della luce e dal tempo di esposizione. Per utilizzare questi strumenti, è necessario un dispositivo per controllare questi parametri. Abbiamo recentemente sviluppato un interruttore genico geneticamente codificato PhyB-PIF3 per i mammiferi che attiva e disattiva in modo reversibile i geni utilizzando luce rossa / rossa lontana, rispettivamente4. Questo sistema è stato testato in diverse linee cellulari di mammiferi e ha permesso l'induzione senza precedenti dell'espressione genica anche con quantità molto piccole di luce, compresi impulsi di luce. I ricercatori che desiderano utilizzare l'interruttore PhyB e strumenti simili 5,6 richiedono frequentemente informazioni sui metodi per controllare l'intensità e la durata dell'illuminazione. Pertanto, abbiamo sviluppato questo protocollo con istruzioni passo-passo per consentire una più ampia adozione di questi strumenti per l'optogenetica.
Prima dell'uso diffuso dei LED, le sorgenti luminose a banda larga con filtri venivano utilizzate per studiare proteine sensibili alla luce come i fitocromi7. Recentemente, alcuni sistemi di illuminazione a LED sono stati pubblicati insieme agli strumenti optogenetici 8,9,10,11,12, ma tali protocolli possono richiedere una significativa esperienza in elettronica / software, richiedere attrezzature specializzate (ad esempio, stampanti 3D, macchine da taglio laser o fotomaschere) o non fornire le istruzioni passo-passo che alcuni ricercatori dovrebbero implementare per le loro esigenze di ricerca. Mentre il controllo indipendente dei singoli pozzetti in una piastra multipozzetto può essere utile, spesso non è necessario quando i ricercatori hanno solo bisogno di confrontare diversi campioni in luce chiara e scura o luce rossa rispetto alla luce rossa lontana. Inoltre, molti sistemi commerciali esistenti sono costosi, con capacità di personalizzazione limitate. Tuttavia, i LED descritti in questo protocollo sono economici, luminosi e possono essere montati in molti modi; Pertanto, possono essere utilizzati per illuminare diversi tipi di campioni. Con il protocollo e il software fornito, i LED che vanno dall'ultravioletto (UV) al NIR possono essere utilizzati e controllati con software per eseguire esperimenti optogenetici utilizzando UVR8 13,14, Dronpa 15,16, domini LOV 17,18, Step Function Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, fitocromi batterici26,27,28,29 e altri sistemi sensibili alla luce 30,31,32.
Questo protocollo costituisce un tutorial per l'assemblaggio dei circuiti e di altro hardware necessario per controllare diversi parametri per la stimolazione della luce, nonché gli strumenti molecolari / cellulari per eseguire un esperimento optogenetico. Inoltre, riportiamo plasmidi ottimizzati da Kyriakakis et al.4 che sono più piccoli e più stabili per la clonazione. Attraverso questo protocollo, i biologi senza esperienza in elettronica e ottica possono costruire sistemi di illuminazione flessibili e robusti. In modo graduale, mostriamo come costruire sistemi LED, rimuovendo il collo di bottiglia tecnico per l'adozione più ampia di strumenti optogenetici. Questo sistema può essere facilmente utilizzato nella maggior parte degli incubatori per colture cellulari, anche se non contengono porte a filo. Ad esempio, abbiamo mantenuto il sistema LED in un incubatore a CO2 umidificato ininterrottamente per più di 6 mesi senza alcun calo delle prestazioni. Spieghiamo anche come collegare il sistema LED a un computer e interfacciarlo con il software open source che forniamo su GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). La costruzione di un sistema utilizzando questo protocollo fornisce ai ricercatori le conoscenze di base per eseguire il debug di potenziali problemi, sostituire parti e migliorare/estendere le funzionalità.
Panoramica del sistema
La costruzione del sistema di illuminazione comporta (1) la costruzione del circuito elettronico, (2) la costruzione delle periferiche (cavo di alimentazione, interruttore di alimentazione, ecc.), (3) la costruzione dei LED, (4) l'assemblaggio di tutti questi componenti e (5) l'installazione del software per controllare i LED con un'interfaccia utente (Figura 1A). Una volta completato, il sistema di illuminazione può controllare fino a quattro LED in modo indipendente con un'interfaccia utente (Figura 1B). L'interfaccia utente consente a ciascun LED di lampeggiare a intervalli di tempo specificati e di spegnersi dopo un tempo specificato. C'è anche un ritardo di avvio per iniziare i programmi di illuminazione in un momento specificato. I potenziometri (POT) regolano l'intensità di ciascun LED in modo indipendente o possono essere utilizzati per il controllo manuale dei LED senza un computer. I fili ai LED possono essere di qualsiasi lunghezza personalizzata, consentendo loro di essere facilmente collocati in un incubatore o in uno spazio di laboratorio. Grazie all'elevata potenza di questi LED, possono essere utilizzati per illuminare una vasta area con un singolo LED a distanza.
Descrizione del driver LED
Per alimentare e controllare l'intensità dei LED, questo protocollo passerà attraverso passaggi per costruire un "driver LED". Ogni LED ha una gamma di tensioni in cui opera (Figura 1C). Durante il funzionamento, la tensione di uscita del regolatore, che controlla l'intensità della luce, può essere regolata da un potenziometro. Il POT varia la resistenza, regolando la tensione/luminosità di uscita. La sintonizzazione con un POT da 1 kΩ (1 kilo-ohm) fornisce quello che chiamiamo il "circuito ad alta tensione" e ha un intervallo da 1,35 V a 2,9 V. Poiché 2,9 V è troppo alto per il funzionamento dei LED a bassa tensione (Figura 1C), mostriamo una singola modifica (Resistore 3 o "R3" Figura supplementare 1A) che limita la portata per abbinare i LED a bassa tensione. R3 serve a ridurre la tensione massima applicata ai LED a 1,85 V (assemblaggio dettagliato nella Figura supplementare 8) quando in parallelo con il potenziometro. Utilizzando la tensione per controllare la luminosità anziché la corrente, il sistema è più flessibile per i LED con diverse tensioni operative. La Figura 1C contiene un elenco dei LED ad alta e bassa tensione per guidare la selezione ottimale del circuito. Questo design mantiene la tensione minima abbastanza bassa in modo che il LED sia completamente spento quando il potenziometro è spento e non consente alla tensione di superare la tensione operativa tipica del LED. Per l'optogenetica PhyB, utilizziamo LED rosso intenso e rosso lontano, che utilizzano il circuito a bassa tensione.
Descrizione del sistema di controllo del computer a LED
Il sistema di illuminazione a LED può essere utilizzato per un'illuminazione costante senza un computer o un microcontrollore. Tuttavia, per i programmi pulsanti e per il controllo della temporizzazione dei singoli LED, è necessario installare un microcontrollore. Per utilizzare un microcontrollore per controllare i LED, è necessario un transistor per collegare il microcontrollore al circuito. Questo transistor rileva la tensione dal microcontrollore e passa dall'essere conduttivo o isolante. Per controllare "on" e "off", usiamo quello che viene chiamato un "transistor di tipo a commutazione NPN" (2N2222) come shunt controllabile attraverso R2 (Figura supplementare 1A). Quando la tensione del microcontrollore viene applicata alla base del transistor, il transistor diventa conduttivo e abbassa la tensione del LED, spegnendo il LED. Pertanto, gli stati di accensione e spegnimento del LED e del transistor sono controllati direttamente dal microcontrollore, che è controllato dal software installato sul PC.
Per realizzare il sistema di illuminazione, sono necessari i seguenti passaggi: Costruire il circuito elettrico; costruire l'alimentatore, l'interruttore di alimentazione manuale, i POT e la connessione del microcontrollore; costruire i LED; ospitare una scatola nera per adattarsi al sistema di illuminazione; collegare tutti i cablaggi e i dispositivi; installare il software di controllo LED, stimolare le cellule con la luce; Misurare l'espressione genica utilizzando un doppio test di luciferasi.

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		</tr>
		<tr>
			<td>1K Ohm potentiometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>52161500</td>
			<td>2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge Silicone JST Connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIM&#38;NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG solid jumper wires</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

Il controllo dei processi biologici utilizzando la luce ha aumentato l'accuratezza e la velocità con cui i ricercatori possono manipolare molti processi biologici. Il controllo ottico consente una capacità senza precedenti di sezionare la funzione e ha il potenziale per consentire nuove terapie genetiche. Tuttavia, gli esperimenti optogenetici richiedono adeguate fonti di luce con controllo spaziale, temporale o di intensità, spesso un collo di bottiglia per i ricercatori. Qui descriviamo in dettaglio come costruire un sistema di illuminazione a LED versatile e a basso costo che sia facilmente personalizzabile per diversi strumenti optogenetici disponibili. Questo sistema è configurabile per il controllo manuale o computerizzato con intensità LED regolabile. Forniamo una guida passo-passo illustrata per costruire il circuito, renderlo controllato dal computer e costruire i LED. Per facilitare l'assemblaggio di questo dispositivo, discutiamo anche alcune tecniche di saldatura di base e spieghiamo i circuiti utilizzati per controllare i LED. Utilizzando la nostra interfaccia utente open source, gli utenti possono automatizzare la temporizzazione precisa e il pulsare della luce su un personal computer (PC) o un tablet economico. Questa automazione rende il sistema utile per gli esperimenti che utilizzano i LED per controllare geni, percorsi di segnalazione e altre attività cellulari che si estendono su ampie scale temporali. Per questo protocollo, non è richiesta alcuna esperienza preliminare in elettronica per costruire tutte le parti necessarie o per utilizzare il sistema di illuminazione per eseguire esperimenti optogenetici.

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Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti optogenetici per controllare l'espressione genica con luce rossa e rossa lontana utilizzando PhyB e PIF3. Sono incluse istruzioni dettagliate per la costruzione di un sistema di illuminazione semplice e flessibile, che consente il controllo dell'espressione genica o di altre optogenetiche con un computer.

Costruire un sistema di illuminazione semplice e versatile per esperimenti optogenetici

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Il sistema consente ai ricercatori di costruire facilmente un sistema di illuminazione economico e versatile per esperimenti optogenetici. I vantaggi di questa tecnica includono la possibilità di programmare la temporizzazione dell'illuminazione dei LED con lunghezze d'onda disponibili che coprono lo spettro IR vicino visibile e che i LED possono essere utilizzati in una varietà di contesti. Per costruire un circuito elettrico, agganciare il circuito stampato alle mani di aiuto e inserire i fili del ponticello, collegandoli per formare i fori A1 e A3 a terra, il cavo del ponticello D2 nel foro stenopeico D6 e l'alimentatore più i fili del ponticello numero sette nel foro stenopeico A7. Piegare i terminali di 45 gradi e aggiungere flusso.Dopo la saldatura, tagliare il dorso dei fili. Inserire un'estremità del connettore femmina saldato da filo a filo nel foro A5. Quindi collegare un'estremità del resistore al foro A5.Collegare l'altra estremità del connettore a terra. Quindi collegare l'altra estremità del resistore alla massa e saldare la connessione. Per il connettore Arduino, crimpare le estremità dei connettori da filo a filo e spingere le estremità crimpate attraverso il connettore rettangolare.Per impostare i LED, stagnare un filo riscaldando dal basso mentre si aggiunge la saldatura dall'alto. Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande e utilizzare la punta per riscaldare la base del LED al contatto contenente il flusso. Dopo alcuni secondi, trascinare individualmente la saldatura su ciascun contatto e fissare il filo nero sul catodo usando un fermaglio per capelli.Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande e premere la punta sul filo fino a quando la saldatura sulla base del LED si scioglie. Tenere premuto il filo e rimuovere il saldatore tenendo il filo in posizione. Posizionare una piccola quantità di pasta saldante sui pad per le connessioni LED e utilizzare una pinza per posizionare il LED sopra i pad.Tenere il filo rosso pre-stagnato sull'anodo e utilizzare un fermaglio per capelli per tagliare il filo. Aggiungere la saldatura alla punta grande come dimostrato e premere la punta sulla connessione fino a quando la saldatura sulla base del LED si scioglie e la pasta saldante si scioglie e diventa argento. Per realizzare i fili LED, posizionare un tubo termoretraibile da 4,76 millimetri sul filo tagliato a misura e un tubo termoretraibile da 3,18 millimetri sul connettore filo-filo.Striscia e aggiungi flusso alle estremità del filo. Utilizzare le mani di aiuto per agganciare il connettore filo a filo e ruotare l'estremità del connettore con un'estremità del filo. Saldare insieme i materiali e collegare l'altro filo alla configurazione nello stesso modo e saldare.Quindi agganciare i fili del LED alle mani di aiuto con del nastro adesivo sotto la base del LED. Quindi, mescolare la resina epossidica secondo le istruzioni del produttore e distribuire la resina epossidica sulla parte superiore del LED saldato. Utilizzando la punta del trapano a vanga, praticare un foro di 1,5 centimetri attraverso la parte superiore della scatola su cui verrà posizionato il LED e utilizzare uno strumento rotante ad alta velocità per creare una tacca su un lato del foro per fare spazio al filo LED.Fissare un pezzo di pellicola per la privacy da 25 a 30 millimetri sulla scatola nera che copre il foro attraverso il quale il LED si illuminerà e fissare il LED all'esterno della scatola nera sulla parte superiore del foro. Per un sistema di controllo a quattro LED, praticare quattro fori da 0,83 centimetri a 3,81 centimetri di distanza nel coperchio della scatola e utilizzare uno strumento rotante ad alta velocità per tagliare un foro rettangolare da 1,19 per 1,90 centimetri nell'angolo in alto a sinistra. Utilizzando una punta a vanga, praticare un foro di 1,5 centimetri nella parte posteriore della scatola e inserire un occhiello nel foro.Per i LED controllati dal computer, carta vetrata l'area in cui il microcontrollore sarà incollato nella scatola e il lato inferiore del supporto del microcontrollore. Collegare il microcontrollore al supporto, quindi unire il supporto epossidico e la scatola prima di fissare il supporto nella scatola nera. Quindi posizionare il nastro biadesivo sulla clip e fissare la clip all'interno della scatola.Nei campioni trasfettati per esprimere il fitocromo B ma non la ficocianina bilina, la perdita aumenta all'aumentare della quantità di DNA del reporter. Inoltre, quando l'intero interruttore del gene del fitocromo B, incluso il plasmide che produce il cromoquattro della ficocianina bilina, viene illuminato con luce rossa lontana, l'espressione della luciferasi aumenta anche con l'aumentare della quantità di costrutto reporter all'interno del mix di trasfezione. Allo stesso modo, quando le cellule sensibili alla luce sono illuminate con luce rossa, anche l'espressione della luciferasi aumenta con l'aumentare della quantità di reporter.Quando si confrontano i livelli di induzione delle cellule trattate con luce rossa con le cellule trattate con luce rossa, si riscontra una piccola diminuzione dell'attivazione della piega con quantità crescenti di reporter. È essenziale seguire attentamente ogni passaggio durante la costruzione del circuito elettrico e ricontrollare i numeri stenopeici riga per riga prima di saldare ogni componente. Questo protocollo può essere utilizzato per la stimolazione ottica di molti tipi di campioni o strumenti optogenetici utilizzando una varietà di lunghezze d'onda e consente la programmazione dei programmi di illuminazione.

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