Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang og Molly Allen for å teste ut forskjellige versjoner av LED-systemet mens det ble utviklet. Dette arbeidet ble støttet av Kavli Institute for Brain and Mind ved UC San Diego og Salk Institute, National Science Foundation gjennom NSF Center for Science of Information under Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 og NIH Grant R21DC018237.

1. Bygg den elektriske kretsen
MERK: Protokollen for å bygge en enkelt krets for en tilgjengelig LED er beskrevet her. Instruksjoner for å utvide dette til fire lysdioder er inkludert i tilleggsinformasjonen.
<ol><li>Slå på røykdemperen og loddejernet. Tilsett vann i tørkesvampen, ha loddet for hånden. FORSIKTIG: Sørg for å ta forholdsregler for å fjerne røyk og forhindre brannskader.</li>
	<li>Begynn loddekretskomponenter til kretskortet (PCB-kort) i den rekkefølgen som vises i tilleggspanelene. NOTAT: Bruk en liten mengde loddetinn på loddejernspissen for å varme metallet til komponenten og PCB-kortet først og smelt ekstra loddetinn direkte på komponentene; Flux kan hjelpe mye.</li>
	<li>Loddetråder og komponenter (tilleggsfigur 2 og tilleggsfigur 3).<ol><li>For startledningene (den isolerte ledningen som forbinder to punkter på kretskortet), bruk to stykker oransje [7,6 mm (0,3 tommer)] og gule [12 mm (0,4 tommer)] ledninger fra jumpersettet.</li>
		<li>Fest PCB-kortet på "hjelpende hender" og sett startledningene i følgende pinholes, bøy terminalene 45 grader og tilsett fluss (figur 2, tilleggsfigur 2 og tilleggsfigur 3): a1 og a3 → bakken (-) (oransje), a7 → strømforsyning (+) #7 (gul), d2 → d6 (gul).</li>
		<li>Lodd og trim deretter baksiden av ledningene.</li>
		<li>Sett LM317T spenningsregulator i følgende pinholes, bøy pinnene og legg til fluks (figur 2 og tilleggsfigur 4): Adj → e5, Vut → e6, Vi → e7.</li>
		<li>Lodd venstre og høyre terminaler først, trim dem, deretter lodd og trim midtterminalen.</li>
		<li>For å stille inn lavspenningsområdet for kretsen, sett inn en 820 Ω motstand helt ned i pinholes, lodd og trim c2 → c5 (figur 2 og tilleggsfigur 5).</li>
		<li>For å aktivere LED-styring av mikrokontrolleren, sett transistoren inn i b3–b5 (figur 2 og tilleggsfigur 6): Collector → b3, Base → b4, Emitter → b5. MERK: Vær oppmerksom på retningen til transistoren for å sette inn riktig; sjekk spesifikasjonene for å finne samler-, base- og emitterbetegnelsen.</li>
	</ol></li>
	<li>Lodd tråd-til-tråd-kontaktene for POT, LED, mikrokontroller og strømkilde. MERK: Vær oppmerksom på fargen på ledningene til tråd-til-tråd-kontaktene og om du bruker en kvinnelig eller mannlig tråd-til-ledningskontakt.<ol><li>Bestem om en "lavspenning" -krets eller "høyspenning" -krets er nødvendig for ønsket LED (figur 1C). MERK: Hvis LED-lampen er på "lavspenningslisten", er det nødvendig med en motstand parallelt med POT.</li>
		<li>For kretsen "lavspenning" eller "høyspenning", plasser ledningen fra en kvinnelig lednings-til-ledningskontakt gjennom hull a5 (tilleggsfigur 7). Ikke lodd på plass ennå hvis du lager lavspenningskretsen. MERK: Vri de nakne trådendene slik at de små trådhårene ikke flasser ut. Hvis ledningen virker for tykk til å presse gjennom knappenålshullet uten å frynse, klipper du 2–6 tråder og vrir dem sammen igjen (tilleggsfigur 7B–D).</li>
		<li>Hvis du lager "høyspent" -kretsen, hopper du til trinn 1.4.5. Hvis du lager "lavspenning" -kretsen, skyver du en 560Ω motstand gjennom samme hull (a5) og lodd med lednings-til-kabel-kontaktledningen.</li>
		<li>Koble den andre enden av motstanden til bakken (tilleggsfigur 7G).</li>
		<li>Sett inn den andre enden av den kvinnelige tråd-til-ledningskontakten loddet inn i et 5-hull, koble den til bakken og lodd den (tilleggsfigur 8A, B).</li>
		<li>For mikrokontrollertilkoblingen, sett den ene enden av en mannlig lednings-til-ledningskontakt inn i hull a4 og den andre i et hull som er koblet til bakken (tilleggsfigur 9A-C).</li>
		<li>For LED-tilkoblingen, sett den ene enden av en kvinnelig wire-to-wire-kontakt inn i hull a2 og den andre enden i et hull koblet til bakken (tilleggsfigur 9D, E).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bygg strømforsyning, manuell strømbryter, POTs og mikrokontrollertilkobling
<ol><li>Bygg strømforsyningen.<ol><li>Lodd en oransje [7,6 mm (0,3 tommer)] jumper fra a29 til bakken (tilleggsfigur 10).</li>
		<li>Lodd en hunntråd-til-kabel-kontakt fra a30 til strømforsyningen (+) (tilleggsfigur 11A–C).</li>
		<li>Lodd en mannlig tråd-til-ledningskontakt fra c29 til c30 (tilleggsfigur 11D–F).</li>
		<li>Klipp kontakten av en strømledning, vis ledningene og strip dem (tilleggsfigur 12A-C).</li>
		<li>Legg flux til ledningene før lodding ved hjelp av en flukspenn (tilleggsfigur 3G).</li>
		<li>Plasser et 3,18 mm (1/8 tommer) krympeslange rundt en mannlig tråd-til-tråd-kontakt og et tykkere stykke 4,76 mm (3/16 tommer) over strømforsyningsledningen (tilleggsfigur 12D).</li>
		<li>Vri ledningene fra strømforsyningen og den mannlige tråd-til-ledningskontakten sammen og lodd (tilleggsfigur 12E, 13A, B).</li>
		<li>Plasser krympeslangen med mindre diameter 3,18 mm (1/8 tommer) over tilkoblingene og krymp dem med en varmepistol (tilleggsfigur 13C, D).</li>
		<li>Plasser et krymperør med større diameter 4,76 mm (3/16 tommer) over det mindre krymperøret 3,18 mm (1/8 tommer) og varm opp igjen (tilleggsfigur 13E, F).</li>
	</ol></li>
	<li>Bygg den manuelle strømbryteren.<ol><li>Plasser krympeslangen 3,18 mm (1/8 tommer) over ledningene for bryteren (tilleggsfigur 14A).</li>
		<li>Vri og lodd ledningene til en mannlig wire-to-wire-kontakt (tilleggsfigur 14B, C).</li>
		<li>Plasser krymperøret 3,18 mm (1/8 tommer) over loddede seksjoner og krymp med en varmepistol (tilleggsfigur 14D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Koble den mannlige wire-to-wire-kontakten til POT.<ol><li>Sløyfe den svarte ledningen til tråd-til-ledningskontakten rundt den midtre terminalen på POT (tilleggsfigur 15B).</li>
		<li>Vri ledningen som er sløyfet tett rundt terminalen og lodd den (tilleggsfigur 15C). MERK: Små presisjonstanger kan hjelpe til med å gjøre en stram vri.</li>
		<li>Gjenta med den røde ledningstilkoblingen til terminalen, som i tilleggsfigur 15D.</li>
		<li>Bruk tangen til å bryte metallfliken nær den røde pilen (tilleggsfigur 15E,F).</li>
	</ol></li>
	<li>Bygg mikrokontrollertilkoblingen (bare nødvendig for datastyrte lysdioder).<ol><li>Hvis du lager en LED-driver for mer enn én LED, kutter du de svarte ledningene fra alle unntatt én kvinnelig tråd-til-ledningskontakt (tilleggsfigur 16A).</li>
		<li>Krymp endene av tråd-til-tråd-kontaktene, som vist (tilleggsfigur 16B–D).</li>
		<li>Skyv de krympede endene gjennom den rektangulære kontakten (tilleggsfigur 16E).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bygg lysdiodene
<ol><li>Strip trådendene (~ 5 mm) og påfør fluks med en flukspenn som i tilleggsfigur 3G. NOTAT: For å effektivt lodde ledningene på LED-basen, må fluks legges til kontaktene på LED-basen og ledningene.</li>
	<li>Tinn ledningen ved å varme opp ledningen nedenfra og legge lodd fra toppen (tilleggsfigur 17B).</li>
	<li>Bruk flukspennen til å plassere fluss på overflatekontakten til LED-basen (tilleggsfigur 17C).</li>
	<li>Legg en sjenerøs mengde lodding på en stor loddespiss (~4–5 mm) (tilleggsfigur 17D), bruk den til å varme opp LED-basen ved kontakten (tilleggsfigur 17E). Etter noen sekunder drar du loddet over kontakten (tilleggsfigur 17F). Gjenta trinn 3.3–3.4 på den andre kontakten (tilleggsfigur 17G). FORSIKTIG: LED-basen kan bli veldig varm under lodding. Plasser LED-basen på en overflate som ikke smelter eller brenner.</li>
	<li>Fest den svarte ledningen på kontakten "C +" (katoden) ved hjelp av hårspennene (tilleggsfigur 18A).</li>
	<li>Legg en sjenerøs mengde lodding på den store loddespissen (tilleggsfigur 18B) og trykk den ned på ledningen til loddet på LED-basen smelter (tilleggsfigur 18C). Hold nede ledningen (tilleggsfigur 18D) og fjern loddebolten mens du holder ledningen på plass (tilleggsfigur 18E).</li>
	<li>Plasser en liten mengde loddepasta på putene for LED-tilkoblingene (tilleggsfigur 19A, B) og plasser LED-lampen over putene ved hjelp av tang (tilleggsfigur 19C). MERK: Hvis plasseringen er litt av, er det greit; Det vil gå på plass når loddepastaen smelter.</li>
	<li>Hold den røde ledningen på "A+" (anoden) og klipp den med en hårspenne (tilleggsfigur 20A–C).</li>
	<li>Plasser en sjenerøs mengde lodding på den store loddespissen (tilleggsfigur 20D) og trykk den ned på ledningen til loddet på LED-basen og loddepastaen under LED-lampen smelter (tilleggsfigur 20E). MERK: Etter at loddepastaen smelter, blir fargen sølv (tilleggsfigur 20H,I).</li>
	<li>Velg lengden på ledningen som trengs for ønsket oppsett. Strip LED-ledningene, og en mannlig wire-to-wire-kontakt (tilleggsfigur 21A), og legg deretter til flux som i tilleggsfigur 3G.</li>
	<li>Plasser krympeslangen over ledningene. Bruk et 3,18 mm (1/8 tommer) krympeslange over tråd-til-tråd-kontaktene og et 4,76 mm (3/16 tommer) krympeslange over ledningen (tilleggsfigur 21B).</li>
	<li>Fest tråd-til-tråd-kontakten med en "hjelpende hånd" og vri kontaktenden med ledningen (tilleggsfigur 21C) og lodd dem. Gjenta med den andre ledningen (tilleggsfigur 21D,E).</li>
	<li>Plasser krympeslangene på 3,18 mm (1/8 tommer) over loddet og krymp (tilleggsfigur 21F–G).</li>
	<li>Plasser krympeslangen på 4,76 mm (3/16 tommer) over krympeslangen på 3,18 mm (1/8 tommer) og krympeslange (tilleggsfigur 21H–I).</li>
	<li>Fest LED-lampene til "hjelpende hender" med tape under (tilleggsfigur 22A).</li>
	<li>Bland epoksy i henhold til produsentens instruksjoner og fordel over toppen av loddet LED (tilleggsfigur 22B). La stå over natten for å kurere.</li>
	<li>Hvis du monterer med et berøringsfeste, kutter du et lite stykke av berøringsfestet (tilleggsfigur 23A) og trykker det mot baksiden av LED-lampen i 30 sekunder.</li>
	<li>Bruk et høyhastighets roterende verktøy til å lage et hakk på lokket på en svart boks (tilleggsfigur 23C–E).</li>
	<li>Bygg en montering for en enkelt LED gjennom en personvernfilm.<ol><li>Bruk spadeborkronen til å bore et hull på 1,75 cm (11/16 tommer) gjennom toppen av en svart boks der LED-lampen skal plasseres (tilleggsfigur 24A).</li>
		<li>Bruk et høyhastighets roterende verktøy til å lage et hakk på den ene siden av hullet for å gi plass til LED-ledningen, som vist i tilleggsfigur 24A.</li>
		<li>Klipp et stykke personvernfilm (25–30 mm) og tape på innsiden av den svarte boksen som dekker hullet som LED-lampen vil lyse opp gjennom (tilleggsfigur 24A).</li>
		<li>Plasser LED-lampen utenfor den svarte boksen på toppen av hullet med personvernfilm og tape på plass med elektrisk tape (tilleggsfigur 24B–E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Plass til en svart boks som passer til belysningssystemet
<ol><li>For et fire LED-system, bor fire 0,83 cm (21/64 tommer) hull på lokket 3,81 cm (1,5 tommer) fra hverandre der potensiometrene skal festes (tilleggsfigur 25).</li>
	<li>Bruk et høyhastighets roterende verktøy til å kutte et 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 tommer x 0,75 tommer) rektangulært hull øverst til venstre (tilleggsfigur 25).</li>
	<li>Bruk spadeborkronen til å bore et 1,75 cm (11/16 tommer) hull på den svarte boksen (tilleggsfigur 26).</li>
	<li>Fil hullene og sett grommet inn i hullet som er boret inn (tilleggsfigur 26).</li>
	<li>For de datastyrte lysdiodene, sandpapir området der mikrokontrolleren skal limes i en svart boks, samt undersiden av mikrokontrollerholderen.</li>
	<li>Klikk mikrokontrolleren på holderen før du fester holderen i den svarte boksen, og epoksy dem deretter på plass (tilleggsfigur 27A).</li>
	<li>Bruk sandpapir til å slipe bunnen av to klips og området i en svart boks der kretsen skal plasseres og fest klipsene inne i den svarte boksen med epoksyen (tilleggsfigur 27A).</li>
	<li>Fest PCB-kortet i klips (tilleggsfigur 27B).</li>
	<li>Trykk strømbryteren gjennom det firkantede hullet i lokket som er laget i tilleggsfigur 25, og klikk den på plass (tilleggsfigur 28A).</li>
	<li>Skyv pottene gjennom hullene på lokket, skru på plass (tilleggsfigur 28A), og sett knappen på POT (tilleggsfigur 28B).</li>
</ol>5. Koble til alle ledninger og enheter
<ol><li>Merk tråd-til-tråd-kontaktene (f.eks. LED, POT, COM) (tilleggsfigur 29A).</li>
	<li>Fest de krympede kontaktene i trinn 2.4 (tilleggsfigur 16) til den mannlige tråd-til-kabel-kontakten mellom de to hunnkontaktene (POT og LED) (tilleggsfigur 7A og S37).</li>
	<li>Koble de krympede endene til mikrokontrolleren (tilleggsfigur 30).</li>
	<li>Trekk USB-kabelen gjennom grommet og koble den til mikrokontrolleren.</li>
	<li>Trekk ledningene til lysdiodene gjennom trommet og koble til hunnens lednings-til-ledningskontakt til venstre for mikrokontrollertilkoblingen (tilleggsfigur 9D og 38).</li>
	<li>Trekk ledningen til strømforsyningen gjennom tetningen og koble den til den mannlige tråd-til-ledningskontakten på høyre side av PCB-kortet (tilleggsfigur 11D).</li>
	<li>Koble den mannlige tråd-til-ledningskontakten fra strømbryteren til den kvinnelige tråd-til-ledningskontakten til høyre for kretskortet (tilleggsfigur 11A).</li>
	<li>Koble de mannlige tråd-til-ledningskontaktene fra POT-ene på lokket til hunnens lednings-til-tråd-kontakter på PCB-kortet (tilleggsfigur 8 og 36). NOTAT: Ikke slå på kretsen uten at potensiometrene er tilkoblet.</li>
</ol>6. Installer LED-kontrollprogramvaren
MERK: Se detaljerte instruksjoner for programvareinstallasjon i tilleggsfilen på Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces
<ol><li>Last ned og installer programvaren for programmering av mikrokontrolleren</li>
	<li>Last ned og installer pakkebehandleren.</li>
	<li>Programmer mikrokontrolleren.</li>
	<li>Last ned og installer kjøretidsmotoren.</li>
	<li>Last ned brukergrensesnittet.</li>
</ol>7. Stimuler cellene med lys
<ol><li>Transfekt HEK293 celler.<ol><li>Plate HEK293 celler på 100k celler per brønn i en 24-brønns plate.</li>
		<li>Bruk eksempeltabellen til å beregne serumfrie medier, polyetylenimin (PEI) og DNA-volum (tilleggsfigur 39) og transfekt ved hjelp av produsentens protokoll.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimulerende celler med lys. MERK: Celler må holdes i mørket etter transfeksjon eller håndteres ved hjelp av en lyskilde som ikke opphisser det optogenetiske systemet.<ol><li>Bestem hvilken type stimulering som skal brukes på cellene (kontinuerlig lys, pulserende intensitet, etc.).</li>
		<li>Når pottene er slått av (mot klokken), slår du på LED-strømforsyningen.</li>
		<li>Plasser en lysmåler inne i den svarte boksen der cellene skal plasseres, og plasser lokket med LED-lampen over måleren. Juster lysintensiteten etter behov.</li>
		<li>Hvis du bruker datamaskinen til å kontrollere lysdiodene, åpner du programvaren for brukergrensesnittet.</li>
		<li>Programmer brukergrensesnittet (figur 5A,B).<ol><li>På øverste venstre panel velger du COM-porten for mikrokontrolleren og klikker på Koble til.</li>
			<li>Bruk panelene til høyre for å programmere hver LED. For kontinuerlig lys, velg hvilken som helst tid unntatt null i "Tid på" og sett "Tid av" til null.</li>
			<li>På panelet nederst til høyre programmerer du hovedtidskontrollen.<ol><li>Hvis du vil forsinke belysningen, velger du en startforsinkelse (HH:MM).</li>
				<li>Hvis du vil slå av alle LED-lamper etter en angitt tid, velger du en kjøretid (HH:MM).</li>
				<li>Start belysningsprogrammet ved å klikke på Kjør-knappen (figur 5A).</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>8. Mål genuttrykk ved hjelp av en dobbel luciferase-analyse
<ol><li>Klargjør luciferasereagens ved å blande 10 ml luciferasebuffer med luciferasereagens og alikot i 1 ml rør som skal oppbevares ved -80 °C i opptil 1 år.</li>
	<li>Forbered lysisbuffer 5x i 1x for 100 μL for N + 2 brønner. for eksempel for 30 prøver, 30 x 20 μL 5X lysisbuffer og 30 x 80 μL MQH2O.</li>
	<li>Forbered Renilla-substratløsning: 20 μl Renilla-substrat for 1 ml Renilla-buffer (denne mengden er egnet for 10 analyser).</li>
	<li>Fjern celler fra inkubatoren, aspirer mediet, tilsett 100 μL 1x lysisbuffer per brønn og legg den på en shaker ved 100 RPM i 15 minutter.</li>
	<li>Plasser i -20 °C i minst 1 time.</li>
	<li>Tilsett 100 μL luciferasereagens per prøve i en brønn med en hvit 96-brønnsplate.</li>
	<li>Sett opp plateleseren for luminescens. Bruk armometermodulen til plateleseren til å stille integrasjonen til 1 s.</li>
	<li>Tilsett tinte lysater i brønner under luciferase-reagenset. Bruk en flerkanalspipette til å blande 20 mikrol prøve inn i luciferase-reagenset og måle luminescensen umiddelbart.</li>
	<li>Etter avlesningsplatået, tilsett 100 μL Renilla-substratløsning og skann igjen.</li>
	<li>Del Luciferase-signalet med Renilla-signalet for å ta hensyn til transfeksjonseffektiviteten.</li>
	<li>Sammenlign luciferase-signaler normalisert for transfeksjonseffektivitet (f.eks. Sammenlign signalet fra rødt lys opplyst og langt rødt lys opplyste prøver).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Klewer, L., Wu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+dimerization+approaches+to+control+cellular+processes.">Light-induced dimerization approaches to control cellular processes.</a> Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).</li><li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms.">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li><li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology.">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).</li><li>Kyriakakis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+orthogonal+molecules+using+ferredoxin+and+ferredoxin-NADP++reductase+systems+enables+genetically+encoded+PhyB+optogenetics.">Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).</li><li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics.">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li><li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptochrome,+phytochrome,+and+anthocyanin+production.">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li><li>Hern&#225;ndez-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+cryptochrome+2+(CRY2).">Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2).</a> Methods. 164-165, 81-90 (2019).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics.">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).</li><li>M&#252;ller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch.">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363 (2016).</li><li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells.">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779 (2013).</li><li>Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-triggered+protein+secretion+system.">A light-triggered protein secretion system.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).</li><li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains.">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li><li>Zhou, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-chain+photoswitchable+CRISPR-Cas9+architecture+for+light-inducible+gene+editing+and+transcription.">A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).</li><li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins.">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256 (2015).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li><li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques.">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li><li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase.">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>M&#252;ller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red/far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch+to+control+gene+expression+in+mammalian+cells.">A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Levskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+engineering+Escherichia+coli+to+see+light.">Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light.</a> Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).</li><li>Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+phytochrome-based+optogenetic+system+controllable+with+near-infrared+light.">A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light.</a> Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).</li><li>Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+optogenetic+pair+for+protein+regulation+and+spectral+multiplexing.">Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing.</a> Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).</li><li>Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+E.+coli+near-infrared+light+sensor.">Engineering an E. coli near-infrared light sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+with+a+photocleavable+protein,+PhoCl.">Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl.</a> Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain.">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li><li>Kim, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-gated+detection+of+protein-protein+interactions+with+transcriptional+readout.">Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

LED-systemet beskrevet her har blitt brukt i laboratoriet vårt for å optimalisere, karakterisere og arbeide med flere optogenetiske verktøy. I Kyriakakis et al.4 testet vi mange kombinasjoner av PhyB-PIF genbrytere parallelt. Vi brukte dette systemet til å teste lyspulser ved forskjellige frekvenser for å måle genbryterkinetikken og effektiv lysintensitet. Dette systemet ble også brukt til å optimalisere og karakterisere to optogenetiske systemer som bruker blått lys for stimulering 5,6. Siden bare en LED trengte å være lys nok til å aktivere de fleste optogenetiske verktøy, er det ikke alltid nødvendig å kjøpe et system med et stort antall lysdioder over hver brønn. Dette oppsettet er billig, pålitelig, enkelt å rekonfigurere og krever ingen tidligere elektrisk ekspertise for å følge monteringsprotokollen.
I tilleggsfigurene 31–38 beskriver vi hvordan opptil fire lysdioder kan integreres i systemet. Selv om dette kan begrense noen eksperimenter som krever et stort antall parallelle forhold, kan flere lysdioder legges til ved å erstatte 9 Volt strømforsyningen som brukes i denne protokollen med en høyere wattstyrke. På samme måte kan flere LED-lamper med lavere effekt kobles parallelt med hver krets. I sistnevnte arrangement vil noen lysdioder ikke styres individuelt, men dette kan være nyttig når mange lysdioder kreves for å dekke et større område. Når du er kjent med elektronikken til dette systemet, er det mange måter å tilpasse det på. Ytterligere strategier for å tilpasse systemet inkluderer å plassere LED-en lenger eller nærmere prøven og belyse gjennom filtre / diffusorer for homogene belysningsforhold eller for å forhindre oppvarming som i (tilleggsfigur 23) og Allen et al.5. Et annet bemerkelsesverdig trekk ved vår LED-design er at den er innkapslet i epoksy og har et berøringsfeste på baksiden; Dette gjør at LED-lampen enkelt kan plasseres sikkert nesten hvor som helst: i inkubatorer, fisketanker, dyrebur, vegger osv.
Mange eksperimenter som bruker optogenetikk til å kontrollere gener, signalveier og annen cellulær aktivitet, krever ofte pulserende, spenner over store tidsskalaer, eller må utføres i en inkubator, og krever derfor automatisering eller ekstern manipulering uten mikroskop. Dette LED-systemet har blitt testet kontinuerlig i flere måneder inne i en fuktet CO2 -inkubator uten problemer. I tillegg, med reversible systemer som PhyB optogenetiske systemer, kan eksperimentøren trenge å programspesifikke pulserende belysningsplaner. I vårt tidligere arbeid4 brukte vi pulserende programmer for å teste reversibilitetsdynamikken til en PhyB-PIF3-bryter i pattedyrceller gjennom brukergrensesnittet. Ved å bruke metodikken beskrevet i dette manuskriptet, er det enkelt å programmere en pulserende protokoll, og gir fleksibiliteten og autonomien som trengs for mange typer optogenetiske eksperimenter på en brukervennlig måte.
De mest kritiske trinnene i å bygge dette systemet inkluderer å sette sammen den elektriske kretsen på PCB-kortet og koble komponentene, som er beskrevet i avsnitt 1 og seksjon 2. Det er viktig å følge hvert trinn i disse seksjonene nøye og dobbeltsjekke knappenålstallene linje for linje før du lodder hver komponent. Avsnitt 2 forklarer hvordan du konfigurerer komponentene som skal kobles til kretsen. For at komponentene skal kobles i riktig retning, er det spesielt viktig å sikre at fargene på de svarte og røde ledningene på tråd-til-tråd-kontaktene stemmer overens. Små forglemmelser i disse to seksjonene vil med stor sannsynlighet påvirke systemets funksjonalitet. Faktisk vil det første trinnet i feilsøking av denne metoden være å kontrollere at kretsen ble bygget riktig og at alle tilkoblingene er på plass. For det andre er det spesielt viktig å kontrollere loddekvaliteten for løse tilkoblinger og ledningene for fakling av trådhår som kan kortslutte kretsen. Et tredje trinn vil være å sikre at lysdiodene fungerer som de skal, noe som kan gjøres ved hjelp av en strømforsyning eller et 1.5 V batteri ved å klippe lysdiodens to terminaler med alligatorklips. En annen potensielt kritisk vurdering er å forhindre oppvarming (når du bruker lysdiodene med høy effekt) eller diffuserer lyset for bredere spredt belysning. For å ivareta disse hensynene kan lysdiodene monteres utenfor en svart boks med "personvernfilm" på innsiden, som beskrevet i tilleggsfigur 23 og Allen et al.5. På grunn av enkelheten til dette systemet, er det ikke vanskelig å ta det fra hverandre for å verifisere, modifisere, oppgradere eller reparere modulære komponenter.
En annen kritisk faktor for induserbare gensystemer er å vurdere hvor mye aktivering som kreves eller hvor mye lekkasje som er akseptabelt for det biologiske systemet som kontrolleres. Som vist i figur 6, kan disse variere med mengden av reporter-DNA. I tillegg vil transfeksjonseffektiviteten og dermed kopinummeret til reporterkonstruksjoner i hver celle variere. Det kan være fordelaktig for noen eksperimenter å lage en cellelinje med en fast mengde reporter- eller PhyB-genbryterkomponenter og skjerm for kloner med ønsket utvalg av indusert uttrykk, slik det vanligvis gjøres med legemiddelinduserbare systemer. På grunn av størrelsen og ustabiliteten til lentiviralt plasmid pPK-2304, laget vi også ikke-lentivirale plasmidversjoner av PhyB-bryteren i pcDNA-ryggraden pPK-351 (Addgene #157921) og pPK-352 (Addgene #157922).
Ved å bygge dette LED-belysningssystemet etter denne protokollen, har brukerne alle komponentene som er nødvendige for å utføre et bredt spekter av optogenetikkeksperimenter in vitro og in vivo. Kombinert med instruksjonene for bruk av PhyB-PIF3 i pattedyrceller, vil denne protokollen tillate ikke-ingeniører og biologer å, fleksibelt og effektivt, bruke PhyB-basert optogenetikk i en rekke sammenhenger.

Optogenetiske verktøy blir allestedsnærværende og ny teknologi utvikles stadig for å optisk kontrollere biologiske prosesser som genuttrykk, cellesignalering og mange flere 1,2,3. Evnen til å kontrollere cellulære prosesser med lys muliggjør rask kinetikk, stram romlig kontroll og doseavhengig regulering som kan styres av lysintensitet og eksponeringstid. For å bruke disse verktøyene er det nødvendig med en enhet for å kontrollere disse parametrene. Vi har nylig utviklet en genetisk kodet PhyB-PIF3 pattedyrgenbryter som reversibelt aktiverer og deaktiverer gener ved hjelp av henholdsvis rødt/langt rødt lys4. Dette systemet ble testet i flere pattedyrcellelinjer og muliggjorde uovertruffen induksjon av genuttrykk selv med svært små mengder lys, inkludert lyspulser. Forskere som ønsker å bruke PhyB-bryteren og lignende verktøy 5,6 ber ofte om informasjon om metoder for å kontrollere belysningsintensitet og varighet. Derfor utviklet vi denne protokollen med trinnvise instruksjoner for å muliggjøre bredere bruk av disse verktøyene for optogenetikk.
Før den utbredte bruken av lysdioder ble bredbåndslyskilder med filtre brukt til å studere lysresponsive proteiner som fytokrom7. Nylig har noen LED-belysningssystemer blitt publisert sammen med optogenetiske verktøy 8,9,10,11,12, men disse protokollene kan kreve betydelig kompetanse innen elektronikk / programvare, kreve spesialutstyr (f.eks. 3D-skrivere, laserskjæringsmaskiner eller fotomasker), eller gir ikke trinnvise instruksjoner som noen forskere trenger å distribuere for deres forskningsbehov. Mens uavhengig kontroll av enkeltbrønner i en flerbrønnsplate kan være nyttig, er det ofte unødvendig når forskere bare trenger å sammenligne flere forskjellige prøver i lys og mørkt eller rødt lys versus langt rødt lys. Mange eksisterende kommersielle systemer er også dyre, med begrenset tilpasningsevne. Lysdiodene beskrevet i denne protokollen er imidlertid kostnadseffektive, lyse og kan monteres på mange måter; Derfor kan de brukes til å belyse flere forskjellige typer prøver. Med protokollen og programvaren som følger med, kan lysdioder fra ultrafiolett (UV) til NIR brukes og styres med programvare for å utføre optogenetiske eksperimenter ved hjelp av UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV domener 17,18, Step Function Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, bakterielle fytokrom26,27,28,29 og andre lysresponsive systemer 30,31,32.
Denne protokollen utgjør en opplæring for montering av kretsene og annen maskinvare som trengs for å kontrollere forskjellige parametere for lysstimulering, samt molekylære / cellulære verktøy for å kjøre et optogenetisk eksperiment. I tillegg rapporterer vi plasmider optimalisert fra Kyriakakis et al.4 som er mindre og mer stabile for kloning. Gjennom denne protokollen kan biologer uten kompetanse innen elektronikk og optikk bygge belysningssystemer som er fleksible og robuste. På en trinnvis måte viser vi hvordan man bygger LED-systemer, og fjerner den tekniske flaskehalsen for bredere bruk av optogenetiske verktøy. Dette systemet kan enkelt brukes i de fleste cellekulturinkubatorer, selv om de ikke inneholder ledningsporter. For eksempel har vi holdt LED-systemet i en fuktet CO2 -inkubator kontinuerlig i mer enn 6 måneder uten reduksjon i ytelse. Vi forklarer også hvordan du kobler LED-systemet til en datamaskin og grensesnitt det med åpen kildekode-programvare vi tilbyr på GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Å bygge et system ved hjelp av denne protokollen gir forskere grunnleggende kunnskap til å feilsøke potensielle problemer, erstatte deler og forbedre / utvide funksjonalitet.
Oversikt over systemet
Bygging av belysningssystemet innebærer (1) å bygge den elektroniske kretsen, (2) bygge periferiutstyret (strømledning, strømbryter, etc.), (3) bygge lysdiodene, (4) montere alle disse komponentene, og (5) installere programvaren for å kontrollere lysdiodene med et brukergrensesnitt (figur 1A). Når belysningssystemet er ferdig, kan det styre opptil fire lysdioder uavhengig av hverandre med et brukergrensesnitt (figur 1B). Brukergrensesnittet gjør det mulig for hver LED å pulsere ved angitte tidsintervaller og slå seg av etter en bestemt tid. Det er også en startforsinkelse for å starte belysningsprogrammer på et bestemt tidspunkt. Potensiometre (POT) regulerer hver LEDs intensitet uavhengig eller kan brukes til manuell LED-kontroll uten datamaskin. Ledningene til lysdiodene kan være hvilken som helst tilpasset lengde, slik at de enkelt kan plasseres i en inkubator eller laboratorieplass. På grunn av disse lysdiodenes høye effekt kan de brukes til å belyse et stort område med en enkelt LED på avstand.
LED driver beskrivelse
For å drive og kontrollere lysdiodenes intensitet, vil denne protokollen gå gjennom trinn for å bygge en "LED-driver". Hver LED har en rekke spenninger der den opererer (figur 1C). Under drift kan regulatorens utgangsspenning, som styrer lysintensiteten, stilles inn av et potensiometer. POT varierer motstanden og justerer utgangsspenningen/lysstyrken. Tuning med en 1kΩ (1 kilo-ohm) POT gir det vi kaller "høyspenningskretsen" og har et område på 1.35 V til 2.9 V. Siden 2.9 V er for høyt for drift av de lavere spennings-LED-ene (figur 1C), viser vi en enkelt modifikasjon (motstand 3 eller "R3" tilleggsfigur 1A) som begrenser rekkevidden for å matche lavspenningslysdiodene. R3 tjener til å redusere maksimal spenning på lysdiodene til 1,85 V (montering detaljert i tilleggsfigur 8) når den er parallell med potensiometeret. Ved å bruke spenning til å kontrollere lysstyrke i stedet for strøm, er systemet mer fleksibelt for lysdioder med forskjellige driftsspenninger. Figur 1C inneholder en liste over høy- og lavspennings-LED-er for å veilede det optimale kretsvalget. Denne utformingen holder minimumsspenningen lav nok til at LED-lampen er helt av når potensiometeret er slått av og ikke lar spenningen gå over den typiske driftsspenningen til LED-en. For PhyB-optogenetikk bruker vi dyprøde og langt røde lysdioder, som bruker lavspenningskretsen.
Beskrivelse av LED-datastyringssystem
LED-belysningssystemet kan brukes til konstant belysning uten datamaskin eller mikrokontroller. For pulserende programmer og for å kontrollere individuell LED-timing, må det imidlertid installeres en mikrokontroller. For å bruke en mikrokontroller for å styre lysdiodene, er det nødvendig med en transistor for å koble mikrokontrolleren til kretsen. Denne transistoren registrerer spenning fra mikrokontrolleren og bytter fra å være ledende eller isolerende. For å styre "på" og "av" bruker vi det som kalles en "NPN-brytertypetransistor" (2N2222) som en kontrollerbar shunt over R2 (tilleggsfigur 1A). Når spenningen fra mikrokontrolleren påføres transistorbasen, blir transistoren ledende og gjør LED-spenningen lav, og slår av LED-en. Dermed styres LED og transistoren av og på-tilstandene direkte av mikrokontrolleren, som styres av programvaren som er installert på PC-en.
For å lage belysningssystemet kreves følgende trinn: Bygg den elektriske kretsen; bygge strømforsyningen, manuell strømbryter, POTs og mikrokontrollertilkobling; bygg lysdiodene; imøtekomme en svart boks som passer til belysningssystemet; koble alle ledninger og enheter; installer LED-kontrollprogramvaren, stimuler cellene med lys; Mål genuttrykk ved hjelp av en dobbel luciferase-analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18AWG 2pin RED Black wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>15M-28AWG-2468</td>
			<td>Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1K Ohm potentiometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>52161500</td>
			<td>2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge Silicone JST Connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIM&#38;NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG solid jumper wires</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

Styring av biologiske prosesser ved hjelp av lys har økt nøyaktigheten og hastigheten som forskere kan manipulere mange biologiske prosesser med. Optisk kontroll muliggjør en enestående evne til å dissekere funksjon og har potensial for å muliggjøre nye genetiske terapier. Imidlertid krever optogenetiske eksperimenter tilstrekkelige lyskilder med romlig, tidsmessig eller intensitetskontroll, ofte en flaskehals for forskere. Her beskriver vi hvordan du bygger et rimelig og allsidig LED-belysningssystem som enkelt kan tilpasses for forskjellige tilgjengelige optogenetiske verktøy. Dette systemet kan konfigureres for manuell eller datastyring med justerbar LED-intensitet. Vi gir en illustrert trinnvis veiledning for å bygge kretsen, gjøre den datastyrt og konstruere lysdiodene. For å lette monteringen av denne enheten, diskuterer vi også noen grunnleggende loddeteknikker og forklarer kretsene som brukes til å kontrollere lysdiodene. Ved hjelp av vårt brukergrensesnitt med åpen kildekode kan brukerne automatisere presis timing og pulsering av lys på en personlig datamaskin (PC) eller et billig nettbrett. Denne automatiseringen gjør systemet nyttig for eksperimenter som bruker lysdioder til å kontrollere gener, signalveier og andre cellulære aktiviteter som spenner over store tidsskalaer. For denne protokollen kreves det ingen tidligere ekspertise innen elektronikk for å bygge alle delene som trengs eller for å bruke belysningssystemet til å utføre optogenetiske eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Denne protokollen beskriver hvordan man utfører optogenetiske eksperimenter for å kontrollere genuttrykk med rødt og langt rødt lys ved hjelp av PhyB og PIF3. Inkludert er trinnvise instruksjoner for å bygge et enkelt og fleksibelt belysningssystem, som muliggjør kontroll av genuttrykk eller annen optogenetikk med en datamaskin.

Bygge et enkelt og allsidig belysningssystem for optogenetiske eksperimenter

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Systemet gjør det mulig for forskere å enkelt konstruere et billig og allsidig belysningssystem for optogenetiske eksperimenter. Fordelene med denne teknikken inkluderer muligheten til å programmere LED-belysningstimingen med tilgjengelige bølgelengder som spenner over det synlige nær IR-spekteret, og at lysdiodene kan brukes i en rekke sammenhenger For å bygge en elektrisk krets, fest kretskortet på de hjelpende hendene og sett inn startledningene, koble dem til å danne A1- og A3-pinholes til bakken, D2-starterledningen inn i D6-knappenålshullet, og strømforsyningen pluss nummer syv startledninger i A7-knappenålshullet. Bøy terminalene 45 grader og legg til fluss.Etter lodding, trim baksiden av ledningene. Sett den ene enden av den loddede kvinnelige ledningen til ledningskontakten inn i A5-hullet. Koble deretter den ene enden av motstanden til A5-hullet.Koble den andre enden av kontakten til bakken. Koble deretter den andre enden av motstanden til bakken og lodd forbindelsen. For Arduino-kontakten, krymp endene av ledningen til ledningskontaktene og skyv de krympede endene gjennom den rektangulære kontakten.For å sette opp lysdiodene, tinn en ledning ved å varme opp nedenfra mens du legger lodd fra toppen. Plasser en sjenerøs mengde lodding over den store loddespissen og bruk spissen til å varme opp LED-basen ved kontakten som inneholder fluks. Etter noen sekunder drar du loddet individuelt over hver kontakt og fester den svarte ledningen på katoden ved hjelp av en hårspenne.Plasser en sjenerøs mengde lodding på den store loddespissen, og trykk spissen på ledningen til loddet på LED-basen smelter. Hold nede ledningen og fjern loddejernet mens du holder ledningen på plass. Plasser en liten mengde loddepasta på putene for LED-tilkoblingene og bruk tang for å plassere LED-lampen over putene.Hold den fortinnede røde ledningen på anoden og bruk en hårspenne for å feste ledningen. Legg lodd til den store spissen som demonstrert, og trykk spissen på tilkoblingen til loddet på LED-basen smelter og loddepastaen smelter og blir sølv. For å lage LED-ledningene, plasser et 4,76 millimeter krymperør over ledningen kuttet i lengde og et 3,18 millimeter krympeslange over ledningen til ledningskontakten.Strip og legg flux til ledningsendene. Bruk hjelpende hender til å feste ledningen til ledningskontakten og vri kontaktenden med en ledningsende. Lodd materialene sammen og fest den andre ledningen til oppsettet på samme måte og loddetinn.Fest deretter LED-ledningene til hjelpende hender med tape under LED-basen. Bland deretter epoksy i henhold til produsentens instruksjoner og spre epoksyen over toppen av loddet LED. Bruk spadeborkronen, bor et 1,5 centimeter hull gjennom toppen av boksen som LED-lampen skal plasseres på, og bruk et høyhastighets roterende verktøy for å lage et hakk på den ene siden av hullet for å gi plass til LED-ledningen.Teip en 25 til 30 millimeter stykke personvernfilm på den svarte boksen som dekker hullet som LED-lampen vil lyse gjennom, og teip LED-lampen utenfor den svarte boksen på toppen av hullet. For et fire LED-kontrollsystem, bor fire 0.83 centimeter hull 3.81 centimeter fra hverandre i lokket på boksen og bruk et høyhastighets roterende verktøy for å kutte et rektangulært hull på 1.19 x 1.90 centimeter i øverste venstre hjørne. Bruk en spadeborkrone, bor et 1,5 centimeter hull på baksiden av boksen og sett inn en grommet i hullet.For de datastyrte lysdiodene, sandpapir området der mikrokontrolleren skal limes i esken, så vel som undersiden av mikrokontrollerholderen. Fest mikrokontrolleren på holderen, og epoxy deretter holderen og boksen sammen før du fester holderen i den svarte boksen. Legg deretter dobbeltsidig tape på klippet og fest klipsen inne i esken.I prøver transfeksjonert for å uttrykke fytokrom B, men ikke phycocyanin bilin, øker lekkasjen når mengden av reporter-DNA øker. I tillegg, når hele fytokrom B-genbryteren inkludert phycocyanin bilin chromofour produserende plasmid er opplyst med langt rødt lys, øker luciferase-uttrykket også med de økende mengdene reporterkonstruksjon i transfeksjonsblandingen. På samme måte, når de lysfølsomme cellene belyses med rødt lys, øker luciferase-uttrykket også med økt rapporteringsmengde.Når man sammenligner induksjonsnivåene til de røde lysbehandlede cellene med de langt røde lysbehandlede cellene, blir det funnet en liten reduksjon i foldaktiveringen med økende mengder reporter. Det er viktig å følge hvert trinn nøye når du bygger den elektriske kretsen og å dobbeltsjekke knappenålstallene linje for linje før du lodder hver komponent. Denne protokollen kan brukes til optisk stimulering av mange typer prøver eller optogenetiske verktøy ved hjelp av en rekke bølgelengder og tillater programmering av belysningsplaner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En allsidig Automated Plattform for Micro-skala Cell Stimulering Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Microfluidic Chip for Allsidig Kjemisk analyse av enkeltceller

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

En guide til Strukturert Illumination TIRF Mikros i høy hastighet med flere farger

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

En enkel og skalerbar Fabrication Metode for Organiske Elektroniske enheter på Tekstil

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

En allsidig Måte mønster Proteiner og celler

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorør som et allsidig verktøy for å studere Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering av Saccharomyces cerevisiae og opprettelse av gjær pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Søknader om åpen kilde Mikroplate-kompatibel belysning paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Enkel, rimelig og modulær mønster av celler ved hjelp av DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...