Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
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Gostaríamos de agradecer a Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang e Molly Allen por testarem diferentes versões do sistema LED à medida que ele estava sendo desenvolvido. Este trabalho foi apoiado pelo Kavli Institute for Brain and Mind da UC San Diego e pelo Salk Institute, National Science Foundation através do NSF Center for Science of Information sob o Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 e NIH Grant R21DC018237.

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O sistema LED descrito aqui foi usado em nosso laboratório para otimizar, caracterizar e trabalhar com várias ferramentas optogenéticas. Em Kyriakakis et al.4, testamos muitas combinações de switches do gene PhyB-PIF em paralelo. Em seguida, usamos esse sistema para testar pulsos de luz em diferentes frequências para medir a cinética do interruptor genético e a intensidade efetiva da luz. Esse sistema também foi utilizado para otimizar e caracterizar dois sistemas optogenéticos que utilizam luz azul para estimulação 5,6. Como apenas um LED precisava ser brilhante o suficiente para ativar a maioria das ferramentas optogenéticas, comprar um sistema com um grande número de LEDs sobre cada poço nem sempre é necessário. Essa configuração é barata, confiável, fácil de reconfigurar e não requer conhecimento prévio em eletricidade para seguir o protocolo de montagem.
Nas Figuras Suplementares suplementares 31–38, descrevemos como incorporar até quatro LEDs no sistema. Embora isso possa limitar alguns experimentos que exigem um grande número de condições paralelas, mais LEDs podem ser adicionados substituindo a fonte de alimentação de 9 Volts usada neste protocolo por uma de maior potência. Da mesma forma, vários LEDs de menor potência podem ser conectados em paralelo a cada circuito. Neste último arranjo, alguns LEDs não serão controlados individualmente, mas isso pode ser útil quando muitos LEDs são necessários para cobrir uma área maior. Uma vez familiarizado com a eletrônica deste sistema, existem muitas maneiras de personalizá-lo. Estratégias adicionais para personalizar o sistema incluem colocar o LED mais longe ou mais perto da amostra e iluminar através de filtros/difusores para condições de iluminação homogêneas ou para evitar o aquecimento, como em (Figura Suplementar 23) e Allen et al.5. Outra característica notável do nosso design LED é que ele é encapsulado em epóxi e tem um fixador de toque na parte de trás; isso permite que o LED seja colocado com segurança com facilidade praticamente em qualquer lugar: em incubadoras, tanques de peixes, gaiolas de animais, paredes, etc.
Muitos experimentos que usam optogenética para controlar genes, vias de sinalização e outras atividades celulares geralmente exigem pulsação, abrangem grandes escalas de tempo ou precisam ser realizados em uma incubadora, exigindo automatização ou manipulação remota sem um microscópio. Este sistema LED foi testado continuamente por vários meses dentro de uma incubadora de CO2 umidificada sem problemas. Além disso, com sistemas reversíveis, como os sistemas optogenéticos PhyB, o experimentador pode precisar programar cronogramas de iluminação pulsante específicos. Em nosso trabalho anterior4, usamos programas pulsantes para testar a dinâmica de reversibilidade de um switch PhyB-PIF3 em células de mamíferos através da interface do usuário. Usando a metodologia descrita neste manuscrito, programar um protocolo pulsante é fácil, proporcionando a flexibilidade e autonomia necessárias para muitos tipos de experimentos optogenéticos de maneira amigável.
As etapas mais críticas na construção deste sistema incluem a montagem do circuito elétrico na placa PCB e a conexão dos componentes, que são detalhados nas seções 1 e 2. É essencial seguir cuidadosamente cada passo nessas seções e verificar novamente os números do pinhole linha por linha antes de soldar cada componente. A seção 2 explica como configurar os componentes que serão conectados ao circuito. Para que os componentes se conectem na orientação correta, é particularmente importante garantir que as cores dos fios preto e vermelho nos conectores fio a fio correspondam. Pequenos descuidos nessas duas seções provavelmente afetarão a funcionalidade do sistema. De fato, o primeiro passo na solução de problemas desse método será verificar se o circuito foi construído corretamente e se todas as conexões estão no lugar. Em segundo lugar, verificar a qualidade da solda para conexões soltas e os fios para queimar pelos de arame que podem estar em curto-circuito é de particular importância. Um terceiro passo seria garantir que os LEDs estejam funcionando corretamente, o que pode ser feito usando uma fonte de alimentação ou uma bateria de 1,5 V, cortando os dois terminais do LED com clipes de jacaré. Outra consideração potencialmente crítica é evitar o aquecimento (ao usar os LEDs em alta potência) ou difundir a luz para uma iluminação mais ampla. Para abordar essas considerações, os LEDs podem ser montados fora de uma caixa preta com "filme de privacidade" no interior, conforme descrito na Figura Suplementar 23 e Allen et al.5. Devido à simplicidade deste sistema, desmontá-lo para verificar, modificar, atualizar ou reparar componentes modulares não é difícil.
Outro fator crítico para sistemas genéticos induzíveis é considerar quanta ativação é necessária ou quanto vazamento é aceitável para o sistema biológico que está sendo controlado. Como mostrado na Figura 6, estes podem variar com a quantidade de DNA do repórter. Além disso, a eficiência da transfecção e, portanto, o número de cópias das construções do repórter em cada célula variam. Pode ser vantajoso para alguns experimentos fazer uma linhagem celular com uma quantidade fixa de componentes de interruptor de genes Repórter ou PhyB e rastrear clones com a faixa desejada de expressão induzida, como é comumente feito com sistemas induzíveis de drogas. Devido ao tamanho e instabilidade do plasmídeo lentiviral pPK-2304, também fizemos versões plasmídicas não lentivirais do interruptor PhyB na espinha dorsal do pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) e pPK-352 (Addgene #157922).
Ao construir este sistema de iluminação LED seguindo este protocolo, os usuários têm todos os componentes necessários para realizar uma ampla gama de experimentos de optogenética in vitro e in vivo. Combinado com as instruções para o uso de PhyB-PIF3 em células de mamíferos, este protocolo permitirá que não-engenheiros e biólogos usem, de forma flexível e eficaz, optogenética baseada em PhyB em uma variedade de contextos.

As ferramentas optogenéticas estão se tornando onipresentes e novas tecnologias estão sendo constantemente desenvolvidas para controlar opticamente processos biológicos, como expressão gênica, sinalização celular e muitos outros 1,2,3. A capacidade de controlar os processos celulares com luz permite cinética rápida, controle espacial rígido e regulação dependente da dose que pode ser controlada pela intensidade da luz e pelo tempo de exposição. Para usar essas ferramentas, é necessário um dispositivo para controlar esses parâmetros. Recentemente, desenvolvemos um interruptor genético de mamíferos PhyB-PIF3 geneticamente codificado que ativa e desativa reversivelmente genes usando luz vermelha/vermelho-distante, respectivamente4. Este sistema foi testado em várias linhagens celulares de mamíferos e permitiu a indução incomparável da expressão gênica, mesmo com quantidades muito pequenas de luz, incluindo pulsos de luz. Pesquisadores que desejam utilizar o interruptor PhyB e ferramentas similares 5,6 frequentemente solicitam informações sobre métodos para controlar a intensidade e a duração da iluminação. Portanto, desenvolvemos este protocolo com instruções passo-a-passo para permitir uma adoção mais ampla dessas ferramentas para a optogenética.
Antes do uso generalizado de LEDs, fontes de luz de banda larga com filtros eram usadas para estudar proteínas responsivas à luz, como os fitocromos7. Recentemente, alguns sistemas de iluminação LED foram publicados juntamente com ferramentas optogenéticas 8,9,10,11,12, mas esses protocolos podem exigir conhecimentos significativos em eletrônica / software, exigir equipamentos especializados (por exemplo, impressoras 3D, máquinas de corte a laser ou fotomáscaras) ou não fornecer as instruções passo a passo que alguns pesquisadores precisariam implantar para suas necessidades de pesquisa. Embora o controle independente de poços individuais em uma placa de vários poços possa ser útil, muitas vezes é desnecessário quando os pesquisadores só precisam comparar várias amostras diferentes em luz clara e escura ou vermelha versus luz vermelha distante. Além disso, muitos sistemas comerciais existentes são caros, com capacidade de personalização limitada. No entanto, os LEDs descritos neste protocolo são econômicos, brilhantes e podem ser montados de várias maneiras; portanto, eles podem ser usados para iluminar vários tipos diferentes de amostras. Com o protocolo e o software fornecidos, LEDs que vão desde ultravioleta (UV) até NIR podem ser utilizados e controlados com software para realizar experimentos optogenéticos utilizando UVR8 13,14, Dronpa 15,16, domínios LOV 17,18, opsinas de função de passo 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, fitocromos bacterianos26,27,28,29 e outros sistemas responsivos à luz 30,31,32.
Este protocolo constitui um tutorial para a montagem dos circuitos e outros hardwares necessários para controlar diferentes parâmetros para a estimulação da luz, bem como as ferramentas moleculares / celulares para executar um experimento optogenético. Além disso, relatamos plasmídeos otimizados de Kyriakakis et al.4 que são menores e mais estáveis para clonagem. Através deste protocolo, biólogos sem experiência em eletrônica e óptica podem construir sistemas de iluminação que são flexíveis e robustos. De forma passo a passo, mostramos como construir sistemas LED, removendo o gargalo técnico para a adoção mais ampla de ferramentas optogenéticas. Este sistema pode ser facilmente utilizado na maioria das incubadoras de cultura celular, mesmo que não contenham portas de arame. Por exemplo, mantivemos o sistema LED em uma incubadora de CO2 umidificada continuamente por mais de 6 meses, sem diminuição no desempenho. Também explicamos como conectar o sistema LED a um computador e interagi-lo com o software de código aberto que fornecemos no GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). A construção de um sistema usando esse protocolo fornece aos pesquisadores o conhecimento básico para depurar possíveis problemas, substituir peças e melhorar/estender funcionalidades.
Visão geral do sistema
A construção do sistema de iluminação envolve (1) a construção do circuito eletrônico, (2) a construção dos periféricos (cabo da fonte de alimentação, interruptor de alimentação, etc.), (3) a construção dos LEDs, (4) a montagem de todos esses componentes e (5) a instalação do software para controlar os LEDs com uma interface de usuário (Figura 1A). Uma vez concluído, o sistema de iluminação pode controlar até quatro LEDs de forma independente com uma interface de usuário (Figura 1B). A interface do usuário permite que cada LED pulse em intervalos de tempo especificados e se desligue após um tempo especificado. Há também um atraso de início para iniciar programas de iluminação em um horário especificado. Os potenciômetros (POTs) regulam a intensidade de cada LED de forma independente ou podem ser usados para controle manual de LED sem um computador. Os fios para os LEDs podem ter qualquer comprimento personalizado, permitindo que eles sejam facilmente colocados em uma incubadora ou espaço de laboratório. Devido à alta potência desses LEDs, eles podem ser usados para iluminar uma grande área com um único LED à distância.
Descrição do driver LED
Para alimentar e controlar a intensidade dos LEDs, este protocolo passará por etapas para construir um "driver LED". Cada LED tem uma faixa de tensões em que opera (Figura 1C). Durante a operação, a tensão de saída do regulador, que controla a intensidade da luz, pode ser ajustada por um potenciômetro. O POT varia a resistência, ajustando a tensão/brilho de saída. A sintonia com um POT de 1kΩ (1 quilo-ohm) dá o que chamamos de "circuito de alta tensão" e tem uma faixa de 1,35 V a 2,9 V. Como 2,9 V é muito alto para operar os LEDs de baixa tensão (Figura 1C), mostramos uma única modificação (Resistor 3 ou "R3" Figura 1A Suplementar) que limita a faixa para corresponder aos LEDs de baixa tensão. O R3 serve para diminuir a tensão máxima aplicada aos LEDs para 1,85 V (montagem detalhada na Figura Suplementar 8) quando em paralelo com o potenciômetro. Ao usar tensão para controlar o brilho em vez de corrente, o sistema é mais flexível para LEDs com diferentes tensões de operação. A Figura 1C contém uma lista dos LEDs de alta e baixa tensão para orientar a seleção ideal do circuito. Este projeto mantém a tensão mínima baixa o suficiente para que o LED esteja completamente desligado quando o potenciômetro estiver desligado e não permita que a tensão ultrapasse a tensão de operação típica do LED. Para a optogenética PhyB, usamos LEDs vermelhos profundos e vermelhos distantes, que usam o circuito de baixa tensão.
Descrição do sistema de controle do computador LED
O sistema de iluminação LED pode ser usado para iluminação constante sem um computador ou microcontrolador. No entanto, para programas pulsantes e para controlar o tempo de LED individual, um microcontrolador deve ser instalado. Para usar um microcontrolador para controlar os LEDs, é necessário um transistor para conectar o microcontrolador ao circuito. Este transistor detecta a tensão do microcontrolador e os interruptores de serem condutores ou isolantes. Para controlar o "on" e o "off", usamos o que é chamado de "transistor do tipo de comutação NPN" (2N2222) como um shunt controlável através do R2 (Figura 1A Suplementar). Quando a tensão do microcontrolador é aplicada à base do transistor, o transistor torna-se condutor e torna a tensão do LED baixa, desligando o LED. Assim, os estados de LED e transistor ligado e desligado são diretamente controlados pelo microcontrolador, que é controlado pelo software instalado no PC.
Para fazer o sistema de iluminação, são necessárias as seguintes etapas: Construir o circuito elétrico; construir a fonte de alimentação, o interruptor de alimentação manual, os POTs e a conexão do microcontrolador; construir os LEDs; acomodar uma caixa preta para caber no sistema de iluminação; conectar toda a fiação e dispositivos; instalar o software de controle LED, estimular as células com luz; medir a expressão gênica usando um ensaio de luciferase dupla.

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			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

O controle de processos biológicos usando a luz aumentou a precisão e a velocidade com que os pesquisadores podem manipular muitos processos biológicos. O controle óptico permite uma capacidade sem precedentes de dissecar a função e tem o potencial de permitir novas terapias genéticas. No entanto, experimentos optogenéticos requerem fontes de luz adequadas com controle espacial, temporal ou de intensidade, muitas vezes um gargalo para os pesquisadores. Aqui detalhamos como construir um sistema de iluminação LED versátil e de baixo custo que seja facilmente personalizável para diferentes ferramentas optogenéticas disponíveis. Este sistema é configurável para controle manual ou de computador com intensidade LED ajustável. Fornecemos um guia passo-a-passo ilustrado para a construção do circuito, tornando-o controlado por computador e construindo os LEDs. Para facilitar a montagem deste dispositivo, também discutimos algumas técnicas básicas de solda e explicamos os circuitos usados para controlar os LEDs. Usando nossa interface de usuário de código aberto, os usuários podem automatizar o tempo preciso e o pulsar da luz em um computador pessoal (PC) ou em um tablet barato. Essa automação torna o sistema útil para experimentos que usam LEDs para controlar genes, vias de sinalização e outras atividades celulares que abrangem grandes escalas de tempo. Para este protocolo, nenhum conhecimento prévio em eletrônica é necessário para construir todas as peças necessárias ou usar o sistema de iluminação para realizar experimentos optogenéticos.

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Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Este protocolo descreve como realizar experimentos optogenéticos para controlar a expressão gênica com luz vermelha e vermelha distante usando PhyB e PIF3. Estão incluídas instruções passo-a-passo para a construção de um sistema de iluminação simples e flexível, que permite o controle da expressão gênica ou outra optogenética com um computador.

Construindo um sistema de iluminação simples e versátil para experimentos optogenéticos

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

O sistema permite que os pesquisadores construam facilmente um sistema de iluminação barato e versátil para experimentos optogenéticos. As vantagens desta técnica incluem a capacidade de programar o tempo de iluminação LED com comprimentos de onda disponíveis que abrangem o espectro visível perto do IR, e que os LEDs podem ser usados em uma variedade de contextos Para construir um circuito elétrico, prender a placa de circuito impresso nas mãos amigas e inserir os fios do jumper, conectando-os para formar os orifícios A1 e A3 ao solo, o fio do jumper D2 no orifício D6 e a fonte de alimentação mais os fios do jumper número sete no orifício A7. Dobre os terminais 45 graus e adicione fluxo.Após a solda, apare as costas dos fios. Insira uma extremidade do conector fêmea fio a fio soldado no orifício A5. Em seguida, conecte uma extremidade do resistor ao orifício A5.Conecte a outra extremidade do conector ao aterramento. Em seguida, conecte a outra extremidade do resistor ao solo e solde a conexão. Para o conector Arduino, aperte as extremidades dos conectores fio a fio e empurre as extremidades crimpadas através do conector retangular.Para configurar os LEDs, estanhe um fio aquecendo por baixo enquanto adiciona solda a partir do topo. Coloque uma quantidade generosa de solda sobre a grande ponta de solda e use a ponta para aquecer a base do LED no contato que contém o fluxo. Depois de alguns segundos, arraste individualmente a solda em cada contato e fixe o fio preto no cátodo usando um grampo de cabelo.Coloque uma quantidade generosa de solda na grande ponta de solda e pressione a ponta no fio até que a solda na base do LED derreta. Segure o fio e remova o ferro de solda enquanto mantém o fio no lugar. Coloque uma pequena quantidade de pasta de solda nas almofadas para as conexões LED e use fórceps para colocar o LED sobre as almofadas.Segure o fio vermelho pré-estanhado no ânodo e use um grampo de cabelo para prender o fio. Adicione solda à ponta grande, conforme demonstrado, e pressione a ponta na conexão até que a solda na base do LED derreta e a pasta de solda derreta e se torne prata. Para fazer os fios de LED, coloque um tubo de encolhimento de 4,76 milímetros sobre o fio cortado no comprimento e um tubo de encolhimento de 3,18 milímetros sobre o conector fio a fio.Retire e adicione fluxo às extremidades do fio. Use as mãos que ajudam para prender o conector fio a fio e torça a extremidade do conector com uma extremidade de fio. Solde os materiais juntos e prenda o outro fio à configuração da mesma maneira e solde.Em seguida, prenda os fios de LED para as mãos de ajuda com fita adesiva sob a base do LED. Em seguida, misture o epóxi de acordo com as instruções do fabricante e espalhe o epóxi sobre a parte superior do LED soldado. Usando a broca de pá, faça um furo de 1,5 centímetro através da parte superior da caixa na qual o LED será colocado e use uma ferramenta rotativa de alta velocidade para fazer um entalhe em um lado do furo para abrir espaço para o fio LED.Cole um pedaço de filme de privacidade de 25 a 30 milímetros na caixa preta que cobre o orifício através do qual o LED acenderá e cole o LED fora da caixa preta em cima do buraco. Para um sistema de controle de quatro LEDs, faça quatro furos de 0,83 centímetro a 3,81 centímetros de distância na tampa da caixa e use uma ferramenta rotativa de alta velocidade para cortar um orifício retangular de 1,19 por 1,90 centímetro no canto superior esquerdo. Usando uma broca de pá, faça um furo de 1,5 centímetro na parte de trás da caixa e insira um grommet no furo.Para os LEDs controlados por computador, lixa a área onde o microcontrolador será colado na caixa, bem como o lado inferior do suporte do microcontrolador. Encaixe o microcontrolador no suporte epóxi e, em seguida, epóxi o suporte e a caixa juntos antes de prender o suporte na caixa preta. Em seguida, coloque fita dupla face no clipe e prenda o clipe dentro da caixa.Em amostras transfectadas para expressar o fitocromo B, mas não a ficocianina bilina, o vazamento aumenta à medida que a quantidade de DNA do repórter aumenta. Além disso, quando todo o interruptor do gene do fitocromo B, incluindo o plasmídeo produtor do cromoquatro bilina ficocianina, é iluminado com luz vermelha distante, a expressão de luciferase também aumenta com as quantidades crescentes de construção do repórter dentro da mistura de transfecção. Da mesma forma, quando as células sensíveis à luz são iluminadas com luz vermelha, a expressão de luciferase também aumenta com o aumento da quantidade de repórteres.Ao comparar os níveis de indução das células tratadas com a luz vermelha com as células tratadas com a luz vermelha distante, uma pequena diminuição na ativação da dobra é encontrada com quantidades crescentes de repórter. É essencial seguir cuidadosamente cada passo ao construir o circuito elétrico e verificar novamente os números do pinhole linha por linha antes de soldar cada componente. Este protocolo pode ser usado para a estimulação óptica de muitos tipos de amostras ou ferramentas optogenéticas usando uma variedade de comprimentos de onda e permite a programação de horários de iluminação.

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