Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Vi vill tacka Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang och Molly Allen för att ha testat olika versioner av LED-systemet när det utvecklades. Detta arbete stöddes av Kavli Institute for Brain and Mind vid UC San Diego och Salk Institute, National Science Foundation genom NSF Center for Science of Information under Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 och NIH Grant R21DC018237.

1. Bygg den elektriska kretsen
OBS: Protokollet för att bygga en enda krets för en tillgänglig LED beskrivs här. Instruktioner för att utöka detta upp till fyra lysdioder ingår i tilläggsinformationen.
<ol><li>Slå på rökabsorbenten och lödkolven. Tillsätt vatten i torksvampen, ha lödet till hands. VARNING: Se till att vidta säkerhetsåtgärder för att ta bort rök och förhindra brännskador.</li>
	<li>Börja löda kretskomponenter till kretskortet (PCB-kort) i den ordning som visas i tilläggspanelerna. OBS: Använd en liten mängd löd på lödkolvspetsen för att värma komponentens metall och kretskortet först och smälta ytterligare löd direkt på komponenterna; Flux kan hjälpa mycket.</li>
	<li>Lödbygeltrådar och komponenter (kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3).<ol><li>För bygelkablarna (de isolerade ledningarna som förbinder två punkter på kretskortet), använd två bitar orange [7,6 mm (0,3 tum)] och gula [12 mm (0,4 tum)] ledningar från bygelsatsen.</li>
		<li>Fäst kretskortet på "hjälpande händer" och sätt in bygelkablarna i följande pinhål, böj terminalerna 45 grader och tillsätt flöde (figur 2, kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3): A1 och A3 → jord (-) (orange), A7 → strömförsörjning (+) #7 (gul), D2 → D6 (gul).</li>
		<li>Löd och trimma sedan baksidan av ledningarna.</li>
		<li>Sätt in LM317T spänningsregulator i följande pinhål, böj stiften och tillsätt flöde (figur 2 och kompletterande figur 4): Adj → e5, Vut → e6, Vi → e7.</li>
		<li>Löd först vänster och höger terminal, trimma dem, löd sedan och trimma mittterminalen.</li>
		<li>För att ställa in kretsens lågspänningsområde, sätt in ett 820 Ω motstånd hela vägen ner i pinhål, löd och trimma c2 → c5 (figur 2 och kompletterande figur 5).</li>
		<li>För att aktivera LED-styrning med mikrokontrollern, sätt in transistorn i b3–b5 (figur 2 och kompletterande figur 6): Samlare → b3, bas → b4, emitter → b5. OBS: Var medveten om transistorns orientering för att infoga korrekt; kontrollera specifikationerna för att hitta Collector-, Base- och Emitter-beteckningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Löd tråd-till-kabel-kontakterna för POT, LED, mikrokontroller och strömkälla. OBS: Var uppmärksam på färgen på ledningarna i tråd-till-kabel-kontakterna och om du använder en kvinnlig eller manlig tråd-till-tråd-kontakt.<ol><li>Bestäm om en "lågspänningskrets" eller "högspänningskrets" krävs för önskad lysdiod (figur 1C). OBS: Om lysdioden finns på listan "lågspänning" krävs ett motstånd parallellt med POT.</li>
		<li>För kretsen "lågspänning" eller "högspänning", placera ledningen från en honkontakt för tråd till tråd genom hål a5 (kompletterande figur 7). Löd inte på plats ännu om du gör lågspänningskretsen. OBS: Vrid de nakna trådändarna så att de små trådhåren inte flagnar ut. Om tråden verkar för tjock för att trycka igenom nålhålet utan att slita, klipp av 2–6 trådar och vrid dem sedan ihop igen (kompletterande figur 7B–D).</li>
		<li>Om du gör "högspänningskretsen", hoppa till steg 1.4.5. Om du gör "lågspänningskretsen", tryck ett 560Ω-motstånd genom samma hål (a5) och löd med tråd-till-tråd-kontaktledningen.</li>
		<li>Anslut den andra änden av motståndet till marken (kompletterande figur 7G).</li>
		<li>Sätt i den andra änden av den kvinnliga tråd-till-tråd-kontakten lödd i ett 5-hål som förbinder den med marken och löd den (kompletterande figur 8A, B).</li>
		<li>För mikrokontrolleranslutningen, sätt in ena änden av en hankontakt tråd-till-tråd i hål a4 och den andra i ett hål anslutet till marken (kompletterande figur 9A–C).</li>
		<li>För LED-anslutningen, sätt in ena änden av en hona tråd-till-tråd-kontakt i hål a2 och den andra änden i ett hål anslutet till marken (kompletterande figur 9D, E).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bygg strömförsörjning, manuell strömbrytare, POT och mikrokontrolleranslutning
<ol><li>Bygg strömförsörjningen.<ol><li>Löd en orange [7,6 mm (0,3 tum)] bygel från a29 till marken (kompletterande figur 10).</li>
		<li>Löd en honkontakt från a30 till strömförsörjningen (+) (kompletterande figur 11A–C).</li>
		<li>Löd en hankontakt från kabel till tråd från c29 till c30 (kompletterande figur 11D–F).</li>
		<li>Klipp av kontakten från en nätsladd, exponera ledningarna och ta bort dem (kompletterande bild 12A–C).</li>
		<li>Tillsätt flussmedel till ledningarna före lödning med hjälp av en flusspenna (kompletterande figur 3G).</li>
		<li>Placera ett krymprör på 3,18 mm (1/8 tum) runt en hankontakt för tråd till tråd och en tjockare bit 4,76 mm (3/16 tum) över strömförsörjningskabeln (kompletterande bild 12D).</li>
		<li>Vrid ledningarna från strömförsörjningen och hankontakten tråd-till-tråd tillsammans och löd (kompletterande figur 12E, 13A, B).</li>
		<li>Placera krympröret med mindre diameter 3,18 mm (1/8 tum) över anslutningarna och krymp dem med en värmepistol (kompletterande figur 13C, D).</li>
		<li>Placera ett krymprör med större diameter 4,76 mm (3/16 tum) över det mindre krympröret 3,18 mm (1/8 tum) och värm igen (kompletterande figur 13E, F).</li>
	</ol></li>
	<li>Bygg den manuella strömbrytaren.<ol><li>Placera krympröret 3,18 mm (1/8 tum) över strömställarnas ledningar (kompletterande bild 14A).</li>
		<li>Vrid och löd ledningarna i en hankontakt tråd-till-tråd (kompletterande figur 14B, C).</li>
		<li>Placera krympröret 3,18 mm (1/8 tum) över lödda sektioner och krymp med en värmepistol (kompletterande figur 14D, E).</li>
	</ol></li>
	<li>Anslut hankontakten tråd-till-tråd till POT.<ol><li>Dra tråd-till-kabel-kontaktens svarta ledning runt POT: s mittterminal (kompletterande figur 15B).</li>
		<li>Vrid tråden som är slingrad tätt runt terminalen och löd den (kompletterande figur 15C). OBS: Små precisionstång kan hjälpa till att göra en snäv vridning.</li>
		<li>Upprepa med den röda kabelanslutningen till terminalen, som i kompletterande figur 15D.</li>
		<li>Använd en tång för att bryta metallfliken nära den röda pilen (kompletterande figur 15E,F).</li>
	</ol></li>
	<li>Bygg mikrokontrolleranslutningen (endast nödvändig för datorstyrda lysdioder).<ol><li>Om du gör en LED-drivrutin för mer än en LED, klipp av de svarta ledningarna från alla utom en kvinnlig tråd-till-tråd-kontakt (kompletterande figur 16A).</li>
		<li>Krymp ändarna på tråd-till-tråd-anslutningarna, som visas (kompletterande figur 16B–D).</li>
		<li>Tryck de krusade ändarna genom den rektangulära kontakten (kompletterande figur 16E).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bygg lysdioderna
<ol><li>Ta bort trådändarna (~5 mm) och applicera flussmedel med en flusspenna som i kompletterande figur 3G. OBS: För att effektivt lödda ledningarna på LED-basen måste flöde läggas till kontakterna på LED-basen och ledningarna.</li>
	<li>Tenn tråden genom att värma tråden underifrån och lägga till löd uppifrån (kompletterande figur 17B).</li>
	<li>Använd flussstiftet för att placera flussmedel på LED-basens ytkontakt (kompletterande figur 17C).</li>
	<li>Placera en generös mängd löd på en stor lödspets (~ 4–5 mm) (kompletterande figur 17D), använd den för att värma LED-basen vid kontakten (kompletterande figur 17E). Efter några sekunder drar du lodet över kontakten (kompletterande bild 17F). Upprepa steg 3.3–3.4 på den andra kontakten (kompletterande figur 17G). VARNING: LED-basen kan bli mycket varm under lödningen. Placera LED-basen på en yta som inte smälter eller brinner.</li>
	<li>Fäst den svarta kabeln på kontakten "C+" (katoden) med hjälp av hårspännena (kompletterande figur 18A).</li>
	<li>Placera en generös mängd löd på den stora lödspetsen (kompletterande figur 18B) och tryck ner den på tråden tills lodet på LED-basen smälter (kompletterande figur 18C). Håll ner tråden (kompletterande figur 18D) och ta bort lödkolven medan du håller tråden på plats (kompletterande figur 18E).</li>
	<li>Placera en liten mängd lödpasta på dynorna för LED-anslutningarna (kompletterande figur 19A, B) och placera lysdioden över dynorna med pincett (kompletterande figur 19C). OBS: Om placeringen är lite off är det okej; Det kommer att gå på plats när lödpastan smälter.</li>
	<li>Håll den röda kabeln på "A +" (anoden) och klipp den med en hårklämma (kompletterande figur 20A-C).</li>
	<li>Placera en generös mängd löd på den stora lödspetsen (kompletterande figur 20D) och tryck ner den på tråden tills lodet på LED-basen och lödpastan under lysdioden smälter (kompletterande figur 20E). OBS: När lödpastan smälter blir färgen silver (kompletterande figur 20H, I).</li>
	<li>Välj längden på den tråd som behövs för önskad inställning. Ta bort LED-ledningarna och en hankontakt för tråd-till-tråd (kompletterande figur 21A) och lägg sedan till flöde som i kompletterande figur 3G.</li>
	<li>Placera krympröret över ledningarna. Använd ett krymprör på 3,18 mm (1/8 tum) över kabel-till-kabel-anslutningarna och ett krymprör på 4,76 mm (3/16 tum) över ledningen (kompletterande bild 21B).</li>
	<li>Fäst tråd-till-kabel-kontakten med en "hjälpande händer" och vrid kontaktens ände med ledningen (kompletterande figur 21C) och löd dem. Upprepa med den andra ledningen (kompletterande figur 21D,E).</li>
	<li>Placera krympslangarna på 3,18 mm (1/8 tum) över lodet och krymp (kompletterande figur 21F–G).</li>
	<li>Placera krympröret på 4,76 mm (3/16 tum) över krympröret på 3,18 mm (1/8 tum) och krymp (kompletterande figur 21H–I).</li>
	<li>Fäst LED-kablarna med "hjälpande händer" med tejp under den (kompletterande figur 22A).</li>
	<li>Blanda epoxi enligt tillverkarens anvisningar och sprid över toppen av den lödda lysdioden (kompletterande figur 22B). Lämna över natten för att bota.</li>
	<li>Om du monterar med ett beröringsfäste, skär en liten bit av beröringsfästet (kompletterande figur 23A) och tryck den mot lysdiodens baksida i 30 sekunder.</li>
	<li>Använd ett höghastighetsroterande verktyg för att göra ett hack på locket på en svart låda (kompletterande figur 23C–E).</li>
	<li>Bygg en montering för en enda LED genom en sekretessfilm.<ol><li>Använd spadborren och borra ett hål på 1,75 cm (11/16 tum) genom toppen av en svart låda där lysdioden kommer att placeras (kompletterande figur 24A).</li>
		<li>Använd ett höghastighetsroterande verktyg och gör ett hack på ena sidan av hålet för att göra plats för LED-ledningen, som visas i kompletterande figur 24A.</li>
		<li>Klipp ut en bit sekretessfilm (25–30 mm) och tejpa fast på insidan av den svarta lådan som täcker hålet som lysdioden lyser igenom (kompletterande figur 24A).</li>
		<li>Placera lysdioden utanför den svarta lådan ovanpå hålet med sekretessfilm och tejp på plats med elektrisk tejp (kompletterande figur 24B–E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Rymma en svart låda för att passa belysningssystemet
<ol><li>För ett fyra LED-system, borra fyra 0,83 cm (21/64 tum) hål på locket 3,81 cm (1,5 tum) från varandra där potentiometrarna kommer att fästas (kompletterande figur 25).</li>
	<li>Använd ett höghastighetsroterande verktyg och skär ett rektangulärt hål på 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 tum x 0,75 tum) i det övre vänstra hörnet (kompletterande figur 25).</li>
	<li>Använd spadborren och borra ett hål på 1,75 cm (11/16 tum) på den svarta lådan (kompletterande figur 26).</li>
	<li>Fila hålen och sätt in genomföringen i hålet som borrats in (kompletterande figur 26).</li>
	<li>För de datorstyrda lysdioderna, sandpapper området där mikrokontrollern kommer att limmas i en svart låda, liksom undersidan av mikrokontrollerhållaren.</li>
	<li>Fäst mikrokontrollern på hållaren innan du fäster hållaren i den svarta lådan och epoxi dem sedan på plats (kompletterande figur 27A).</li>
	<li>Använd sandpapper för att slipa botten av två klämmor och området i en svart låda där kretsen kommer att placeras och säkra klämmorna inuti den svarta lådan med epoxin (kompletterande figur 27A).</li>
	<li>Fäst kretskortet i klämmor (kompletterande figur 27B).</li>
	<li>Tryck strömbrytaren genom det fyrkantiga hålet i locket i kompletterande figur 25 och snäpp fast den på plats (kompletterande figur 28A).</li>
	<li>Tryck POTs genom hålen på locket, skruva på plats (kompletterande figur 28A) och sätt vredet på POT (kompletterande figur 28B).</li>
</ol>5. Anslut alla ledningar och enheter
<ol><li>Märk kabel-till-kabel-kontakterna (t.ex. LED, POT, COM) (kompletterande figur 29A).</li>
	<li>Fäst de krusade kontaktdonen i steg 2.4 (kompletterande figur 16) på hankontakten tråd-till-tråd mellan de två honkontakterna (POT och LED) (kompletterande figur 7A och S37).</li>
	<li>Anslut de krympta ändarna till mikrokontrollern (kompletterande figur 30).</li>
	<li>Dra USB-kabeln genom genomföringen och anslut den till mikrokontrollern.</li>
	<li>Dra ledningarna för lysdioderna genom genomföringen och anslut till honkontakten till vänster om mikrokontrolleranslutningen (kompletterande figurer 9D och 38).</li>
	<li>Dra kabeln för strömförsörjningen genom genomföringen och anslut den till hanens tråd-till-tråd-kontakt på höger sida av kretskortet (kompletterande figur 11D).</li>
	<li>Anslut den manliga tråd-till-kabel-kontakten från strömbrytaren till den kvinnliga tråd-till-kabel-kontakten till höger om kretskortet (kompletterande figur 11A).</li>
	<li>Anslut de trådbundna hankontakterna från POT:erna på locket till de trådbundna honkontakterna på kretskortet (kompletterande figur 8 och 36). OBS: Slå inte på kretsen utan att potentiometrarna är anslutna.</li>
</ol>6. Installera LED-kontrollprogramvaran
Se de detaljerade installationsanvisningarna för programvara i den kompletterande filen på Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces
<ol><li>Ladda ner och installera programvaran för programmering av mikrokontrollern</li>
	<li>Ladda ner och installera pakethanteraren.</li>
	<li>Programmera mikrokontrollern.</li>
	<li>Ladda ned och installera runtime-motorn.</li>
	<li>Ladda ner användargränssnittet.</li>
</ol>7. Stimulera cellerna med ljus
<ol><li>Transfect HEK293 celler.<ol><li>Platta HEK293-celler vid 100k celler per brunn i en 24-brunnsplatta.</li>
		<li>Använd exempeltabellen för att beräkna serumfria medier, polyetylenimin (PEI) och DNA-volymer (kompletterande figur 39) och transfekt med tillverkarens protokoll.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimulerande celler med ljus. OBS: Cellerna måste hållas i mörker efter transfektion eller hanteras med en ljuskälla som inte exciterar det optogenetiska systemet.<ol><li>Bestäm vilken typ av stimulering som ska användas på cellerna (kontinuerligt ljus, pulserande intensitet, etc.).</li>
		<li>När POT: erna är avstängda (moturs), slå på LED-strömförsörjningen.</li>
		<li>Placera en ljusmätare inuti den svarta lådan där cellerna ska placeras och placera locket med lysdioden över mätaren. Justera ljusintensiteten efter behov.</li>
		<li>Om du använder datorn för att styra lysdioderna, öppna programvaran för användargränssnittet.</li>
		<li>Programmera användargränssnittet (bild 5A,B).<ol><li>På den övre vänstra panelen väljer du COM-porten för mikrokontrollern och klickar på Anslut.</li>
			<li>Använd panelerna till höger för att programmera varje LED. För kontinuerligt ljus, välj vilken tid som helst utom noll i "Time On" och ställ in "Time Off" till noll.</li>
			<li>Programmera huvudtidskontrollen längst ned till höger.<ol><li>Om du vill fördröja belysningen väljer du en startfördröjning (HH:MM).</li>
				<li>Om du vill stänga av alla lysdioder efter en viss tid väljer du en körtid (HH:MM).</li>
				<li>Starta belysningsprogrammet genom att klicka på knappen Kör (bild 5A).</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>8. Mät genuttryck med hjälp av en dubbel luciferasanalys
<ol><li>Bered luciferasreagens genom att blanda 10 ml luciferasbuffert med luciferasreagens och alikvot i 1 ml rör som ska förvaras vid -80 °C i upp till 1 år.</li>
	<li>Förbered lysbuffert 5x till 1x för 100 μL för N + 2 brunnar. t.ex. för 30 prover, 30 x 20 μL 5X lysbuffert och 30 x 80 μL MQH2O.</li>
	<li>Bered Renilla-substratlösning: 20 μL Renilla-substrat för 1 ml Renilla-buffert (denna mängd är lämplig för 10 analyser).</li>
	<li>Ta bort celler från inkubatorn, aspirera mediet, tillsätt 100 μL 1x lysbuffert per brunn och placera den på en shaker vid 100 rpm i 15 minuter.</li>
	<li>Placera i -20 °C i minst 1 timme.</li>
	<li>Tillsätt 100 μl luciferasreagens per prov i en brunn på en vit platta med 96 brunnar.</li>
	<li>Ställ in plattläsaren för luminiscens. Använd plattläsarens luminometermodul och ställ in integrationen på 1 s.</li>
	<li>Tillsätt tinade lysater i brunnar under luciferasreagenset. Blanda 20 μl prov i luciferasreagenset med hjälp av en flerkanalig pipett och mät luminiscensen omedelbart.</li>
	<li>Efter avläsningsplatån, tillsätt 100 μL Renilla-substratlösning och skanna igen.</li>
	<li>Dela Luciferassignalen med Renillasignalen för att ta hänsyn till transfektionseffektiviteten.</li>
	<li>Jämför luciferassignaler normaliserade för transfektionseffektivitet (jämför t.ex. signalen från rött ljus upplyst och långrött ljus belysta prover).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Klewer, L., Wu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+dimerization+approaches+to+control+cellular+processes.">Light-induced dimerization approaches to control cellular processes.</a> Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).</li><li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms.">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li><li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology.">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).</li><li>Kyriakakis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+orthogonal+molecules+using+ferredoxin+and+ferredoxin-NADP++reductase+systems+enables+genetically+encoded+PhyB+optogenetics.">Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).</li><li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics.">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li><li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptochrome,+phytochrome,+and+anthocyanin+production.">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li><li>Hern&#225;ndez-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+cryptochrome+2+(CRY2).">Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2).</a> Methods. 164-165, 81-90 (2019).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics.">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).</li><li>M&#252;ller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch.">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363 (2016).</li><li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells.">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779 (2013).</li><li>Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-triggered+protein+secretion+system.">A light-triggered protein secretion system.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).</li><li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains.">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li><li>Zhou, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-chain+photoswitchable+CRISPR-Cas9+architecture+for+light-inducible+gene+editing+and+transcription.">A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).</li><li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins.">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256 (2015).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li><li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques.">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li><li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase.">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>M&#252;ller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red/far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch+to+control+gene+expression+in+mammalian+cells.">A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Levskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+engineering+Escherichia+coli+to+see+light.">Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light.</a> Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).</li><li>Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+phytochrome-based+optogenetic+system+controllable+with+near-infrared+light.">A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light.</a> Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).</li><li>Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+optogenetic+pair+for+protein+regulation+and+spectral+multiplexing.">Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing.</a> Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).</li><li>Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+E.+coli+near-infrared+light+sensor.">Engineering an E. coli near-infrared light sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+with+a+photocleavable+protein,+PhoCl.">Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl.</a> Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain.">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li><li>Kim, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-gated+detection+of+protein-protein+interactions+with+transcriptional+readout.">Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

LED-systemet som beskrivs här har använts i vårt laboratorium för att optimera, karakterisera och arbeta med flera optogenetiska verktyg. I Kyriakakis et al.4 testade vi många kombinationer av PhyB-PIF-genomkopplare parallellt. Vi använde sedan detta system för att testa ljuspulser vid olika frekvenser för att mäta genomkopplarens kinetik och effektiv ljusintensitet. Detta system användes också för att optimera och karakterisera två optogenetiska system som använder blått ljus för stimulering 5,6. Eftersom endast en lysdiod behövde vara tillräckligt ljus för att aktivera de flesta optogenetiska verktyg är det inte alltid nödvändigt att köpa ett system med ett stort antal lysdioder över varje brunn. Denna installation är billig, pålitlig, lätt att konfigurera om och kräver ingen tidigare elektrisk expertis för att följa monteringsprotokollet.
I de kompletterande kompletterande figurerna 31–38 beskriver vi hur man kan integrera upp till fyra lysdioder i systemet. Även om detta kan begränsa vissa experiment som kräver ett stort antal parallella förhållanden, kan fler lysdioder läggas till genom att ersätta 9 Volt strömförsörjning som används i detta protokoll med en högre watt. På samma sätt kan flera lysdioder med lägre effekt anslutas parallellt med varje krets. I det senare arrangemanget kommer vissa lysdioder inte att styras individuellt, men det kan vara användbart när många lysdioder krävs för att täcka ett större område. När du väl är bekant med elektroniken i detta system finns det många sätt att anpassa det. Ytterligare strategier för att anpassa systemet inkluderar att placera lysdioden längre eller närmare provet och belysa genom filter / diffusorer för homogena belysningsförhållanden eller för att förhindra uppvärmning som i (kompletterande figur 23) och Allen et al.5. En annan anmärkningsvärd egenskap hos vår LED-design är att den är inkapslad i epoxi och har ett beröringsfäste på baksidan; Detta gör att lysdioden enkelt kan placeras säkert praktiskt taget var som helst: i inkubatorer, akvarium, djurburar, väggar etc.
Många experiment som använder optogenetik för att styra gener, signalvägar och annan cellulär aktivitet kräver ofta pulsering, spänner över stora tidsskalor eller behöver utföras i en inkubator, vilket kräver automatisering eller fjärrmanipulation utan mikroskop. Detta LED-system har testats kontinuerligt i flera månader inuti en fuktad CO2-inkubator utan problem. Dessutom, med reversibla system som PhyB-optogenetiska system, kan experimenten behöva programmera specifika pulserande belysningsscheman. I vårt tidigare arbete4 använde vi pulserande program för att testa reversibilitetsdynamiken hos en PhyB-PIF3-switch i däggdjursceller via användargränssnittet. Med hjälp av den metodik som beskrivs i detta manuskript är det enkelt att programmera ett pulserande protokoll, vilket ger den flexibilitet och autonomi som behövs för många typer av optogenetiska experiment på ett användarvänligt sätt.
De mest kritiska stegen för att bygga detta system inkluderar att sätta ihop den elektriska kretsen på kretskortet och ansluta komponenterna, som beskrivs i avsnitt 1 och avsnitt 2. Det är viktigt att noggrant följa varje steg i dessa avsnitt och dubbelkontrollera pinhole-numren rad för rad innan du lödar varje komponent. Avsnitt 2 förklarar hur man ställer in komponenterna som ska anslutas till kretsen. För att komponenterna ska anslutas i rätt riktning är det särskilt viktigt att se till att färgerna på de svarta och röda ledningarna på tråd-till-tråd-kontakterna matchar. Små förbiseenden i dessa två avsnitt kommer sannolikt att påverka systemets funktionalitet. Det första steget i felsökning av denna metod är faktiskt att kontrollera att kretsen byggdes korrekt och att alla anslutningar är på plats. För det andra är det särskilt viktigt att kontrollera lödkvaliteten för lösa anslutningar och ledningarna för blossande trådhår som kan kortsluta kretsen. Ett tredje steg skulle vara att se till att lysdioderna fungerar korrekt, vilket kan göras med hjälp av en strömförsörjning eller ett 1,5 V-batteri genom att klippa lysdiodens två terminaler med alligatorklämmor. Ett annat potentiellt kritiskt övervägande är att förhindra uppvärmning (vid användning av lysdioderna med hög effekt) eller diffusion av ljuset för bredare spridningsbelysning. För att ta itu med dessa överväganden kan lysdioderna monteras utanför en svart låda med "sekretessfilm" på insidan, som beskrivs i kompletterande figur 23 och Allen et al.5. På grund av enkelheten i detta system är det inte svårt att ta isär det för att verifiera, modifiera, uppgradera eller reparera modulära komponenter.
En annan kritisk faktor för inducerbara gensystem är att överväga hur mycket aktivering som krävs eller hur mycket läckage som är acceptabelt för det biologiska systemet som kontrolleras. Som visas i figur 6 kan dessa variera med mängden rapportör-DNA. Dessutom varierar transfektionseffektiviteten och därmed kopieringsantalet rapportörkonstruktioner i varje cell. Det kan vara fördelaktigt för vissa experiment att göra en cellinje med en fast mängd reporter- eller PhyB-genswitchkomponenter och screena för kloner med önskat intervall av inducerat uttryck, vilket vanligtvis görs med läkemedelsinducerbara system. På grund av storleken och instabiliteten hos lentiviral plasmid pPK-2304 gjorde vi också icke-lentivirala plasmidversioner av PhyB-omkopplaren i pcDNA-ryggraden pPK-351 (Addgene #157921) och pPK-352 (Addgene #157922).
Genom att bygga detta LED-belysningssystem enligt detta protokoll, användare har alla komponenter som behövs för att utföra ett brett spektrum av optogenetiska experiment in vitro och in vivo. I kombination med instruktionerna för användning av PhyB-PIF3 i däggdjursceller kommer detta protokoll att göra det möjligt för icke-ingenjörer och biologer att, flexibelt och effektivt, använda PhyB-baserad optogenetik i olika sammanhang.

Optogenetiska verktyg blir allestädes närvarande och ny teknik utvecklas ständigt för att optiskt styra biologiska processer som genuttryck, cellsignalering och många fler 1,2,3. Förmågan att styra cellulära processer med ljus möjliggör snabb kinetik, tät rumslig kontroll och dosberoende reglering som kan styras av ljusintensitet och exponeringstid. För att använda dessa verktyg krävs en enhet för att styra dessa parametrar. Vi har nyligen utvecklat en genetiskt kodad PhyB-PIF3 genomkopplare för däggdjur som reversibelt aktiverar och inaktiverar gener med rött/långrött ljus respektive4. Detta system testades i flera däggdjurscellinjer och möjliggjorde oöverträffad induktion av genuttryck även med mycket små mängder ljus, inklusive ljuspulser. Forskare som vill använda PhyB-omkopplaren och liknande verktyg 5,6 begär ofta information om metoder för att kontrollera belysningsintensitet och varaktighet. Därför utvecklade vi detta protokoll med steg-för-steg-instruktioner för att möjliggöra bredare antagande av dessa verktyg för optogenetik.
Innan den utbredda användningen av lysdioder användes bredbandsljuskällor med filter för att studera ljuskänsliga proteiner som fytokromer7. Nyligen har vissa LED-belysningssystem publicerats tillsammans med optogenetiska verktyg 8,9,10,11,12, men dessa protokoll kan kräva betydande expertis inom elektronik / programvara, kräva specialutrustning (t.ex. 3D-skrivare, laserskärmaskiner, eller fotomasker), eller ger inte de steg-för-steg-instruktioner som vissa forskare skulle behöva distribuera för sina forskningsbehov. Medan oberoende kontroll av enskilda brunnar i en multiwellplatta kan vara användbar, är det ofta onödigt när forskare bara behöver jämföra flera olika prover i ljus och mörkt eller rött ljus kontra långt rött ljus. Dessutom är många befintliga kommersiella system dyra, med begränsad anpassningskapacitet. Lysdioderna som beskrivs i detta protokoll är dock kostnadseffektiva, ljusa, och kan monteras på många sätt; Därför kan de användas för att belysa flera olika typer av prover. Med protokollet och den medföljande programvaran kan lysdioder som sträcker sig från ultraviolett (UV) till NIR användas och styras med programvara för att utföra optogenetiska experiment med UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV-domäner 17,18, stegfunktion opsiner 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, bakteriella fytokromer26,27,28,29 och andra ljuskänsliga system 30,31,32.
Detta protokoll utgör en handledning för montering av kretsar och annan hårdvara som behövs för att styra olika parametrar för ljusstimulering samt molekylära / cellulära verktyg för att köra ett optogenetiskt experiment. Dessutom rapporterar vi plasmider optimerade från Kyriakakis et al.4 som är mindre och stabilare för kloning. Genom detta protokoll kan biologer utan expertis inom elektronik och optik bygga belysningssystem som är flexibla och robusta. På ett steg-för-steg-sätt visar vi hur man bygger LED-system, vilket tar bort den tekniska flaskhalsen för ett bredare antagande av optogenetiska verktyg. Detta system kan enkelt användas i de flesta cellodlingsinkubatorer, även om de inte innehåller trådportar. Till exempel har vi hållit LED-systemet i en fuktad CO2-inkubator kontinuerligt i mer än 6 månader utan att minska prestandan. Vi förklarar också hur man ansluter LED-systemet till en dator och gränssnitt det med öppen källkodsprogramvara som vi tillhandahåller på GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Att bygga ett system med detta protokoll ger forskare grundläggande kunskaper för att felsöka potentiella problem, byta ut delar och förbättra / utöka funktioner.
Systemöversikt
Att bygga belysningssystemet innebär (1) att bygga den elektroniska kretsen, (2) att bygga kringutrustning (nätsladd, strömbrytare etc.), (3) att bygga lysdioderna, (4) montera alla dessa komponenter och (5) installera programvaran för att styra lysdioderna med ett användargränssnitt (figur 1A). När det är klart kan belysningssystemet styra upp till fyra lysdioder oberoende av varandra med ett användargränssnitt (figur 1B). Användargränssnittet gör det möjligt för varje lysdiod att pulsera vid angivna tidsintervall och stänga av efter en viss tid. Det finns också en startfördröjning för att starta belysningsprogram vid en viss tidpunkt. Potentiometrar (POTTs) reglerar varje LED-intensitet oberoende eller kan användas för manuell LED-styrning utan dator. Ledningarna till lysdioderna kan vara vilken anpassad längd som helst, så att de enkelt kan placeras i en inkubator eller labbutrymme. På grund av dessa lysdioders höga effekt, de kan användas för att belysa ett stort område med en enda LED på avstånd.
Beskrivning av LED-drivrutin
För att driva och kontrollera lysdiodernas intensitet kommer detta protokoll att gå igenom steg för att bygga en "LED-drivrutin". Varje lysdiod har ett spänningsområde där den arbetar (figur 1C). Under drift kan regulatorns utspänning, som styr ljusintensiteten, ställas in med en potentiometer. POT varierar motståndet och justerar utspänningen/ljusstyrkan. Tuning med en 1kΩ (1 kilo-ohm) POT ger det vi kallar "högspänningskretsen" och har en räckvidd på 1,35 V till 2,9 V. Eftersom 2,9 V är för högt för att driva lågspänningslamporna (figur 1C) visar vi en enda modifiering (motstånd 3 eller "R3" kompletterande figur 1A) som begränsar intervallet för att matcha lågspänningslamporna. R3 tjänar till att minska den maximala spänningen som appliceras på lysdioderna till 1,85 V (montering som beskrivs i kompletterande figur 8) när den är parallell med potentiometern. Genom att använda spänning för att styra ljusstyrka istället för ström är systemet mer flexibelt för lysdioder med olika driftspänningar. Figur 1C innehåller en lista över hög- och lågspänningslysdioder för att styra det optimala kretsvalet. Denna design håller minimispänningen tillräckligt låg så att lysdioden är helt avstängd när potentiometern är avstängd och tillåter inte spänningen att gå över lysdiodens typiska driftspänning. För PhyB-optogenetik använder vi djupröda och långröda lysdioder, som använder lågspänningskretsen.
Beskrivning av LED-datorstyrsystem
LED-belysningssystemet kan användas för konstant belysning utan dator eller mikrokontroller. i alla fall, för pulserande program och för att styra individuell LED-timing, en mikrokontroller måste installeras. För att använda en mikrokontroller för att styra lysdioderna krävs en transistor för att ansluta mikrokontrollern till kretsen. Denna transistor känner av spänning från mikrokontrollern och växlar från att vara ledande eller isolerande. För att styra "på" och "av" använder vi vad som kallas en "NPN-switchande transistor" (2N2222) som en kontrollerbar shunt över R2 (kompletterande figur 1A). När spänningen från mikrokontrollern appliceras på transistorbasen blir transistorn ledande och gör LED-spänningen låg och stänger av lysdioden. Således styrs LED och transistorn på och av tillstånd direkt av mikrokontrollern, som styrs av programvaran installerad på datorn.
För att göra belysningssystemet krävs följande steg: Bygg den elektriska kretsen; bygga strömförsörjningen, manuell strömbrytare, POT och mikrokontrolleranslutning; bygga lysdioderna; rymma en svart låda för att passa belysningssystemet; anslut alla ledningar och enheter; installera LED-kontrollprogramvaran, stimulera cellerna med ljus; mäta genuttryck med hjälp av en dubbel luciferasanalys.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18AWG 2pin RED Black wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>15M-28AWG-2468</td>
			<td>Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1K Ohm potentiometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>52161500</td>
			<td>2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge Silicone JST Connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIM&#38;NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG solid jumper wires</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

Att styra biologiska processer med hjälp av ljus har ökat noggrannheten och hastigheten med vilken forskare kan manipulera många biologiska processer. Optisk kontroll möjliggör en oöverträffad förmåga att dissekera funktion och har potential att möjliggöra nya genetiska terapier. Optogenetiska experiment kräver dock adekvata ljuskällor med rumslig, tidsmässig eller intensitetskontroll, ofta en flaskhals för forskare. Här beskriver vi hur man bygger ett billigt och mångsidigt LED-belysningssystem som enkelt kan anpassas för olika tillgängliga optogenetiska verktyg. Detta system kan konfigureras för manuell eller datorstyrning med justerbar LED-intensitet. Vi tillhandahåller en illustrerad steg-för-steg-guide för att bygga kretsen, göra den datorstyrd och konstruera lysdioderna. För att underlätta monteringen av denna enhet diskuterar vi också några grundläggande lödtekniker och förklarar kretsarna som används för att styra lysdioderna. Med hjälp av vårt användargränssnitt med öppen källkod kan användare automatisera exakt timing och pulsering av ljus på en persondator (PC) eller en billig surfplatta. Denna automatisering gör systemet användbart för experiment som använder lysdioder för att styra gener, signalvägar och andra cellulära aktiviteter som spänner över stora tidsskalor. För detta protokoll krävs ingen tidigare expertis inom elektronik för att bygga alla delar som behövs eller för att använda belysningssystemet för att utföra optogenetiska experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Detta protokoll beskriver hur man utför optogenetiska experiment för att kontrollera genuttryck med rött och långrött ljus med hjälp av PhyB och PIF3. Inkluderat är steg-för-steg-instruktioner för att bygga ett enkelt och flexibelt belysningssystem, vilket möjliggör kontroll av genuttryck eller annan optogenetik med en dator.

Bygga ett enkelt och mångsidigt belysningssystem för optogenetiska experiment

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Systemet gör det möjligt för forskare att enkelt konstruera ett billigt och mångsidigt belysningssystem för optogenetiska experiment. Fördelarna med denna teknik inkluderar möjligheten att programmera LED-belysningstiden med tillgängliga våglängder som spänner över det synliga nära IR-spektrumet, och att lysdioderna kan användas i en mängd olika sammanhang För att bygga en elektrisk krets, klipp kretskortet på hjälphänderna och sätt in bygelkablarna, anslut dem för att bilda A1- och A3-stifthålen till marken, D2-bygelkabeln i D6-hålet och strömförsörjningen plus nummer sju bygeltrådar i A7-hålet. Böj terminalerna 45 grader och tillsätt flöde.Efter lödning, trimma baksidan av ledningarna. Sätt i ena änden av den lödda honledningen till trådkontakten i A5-hålet. Anslut sedan ena änden av motståndet till A5-hålet.Anslut den andra änden av kontakten till marken. Anslut sedan den andra änden av motståndet till marken och löd anslutningen. För Arduino-kontakten, krympa ändarna på ledningen till trådkontakter och tryck de krympta ändarna genom den rektangulära kontakten.För att ställa in lysdioderna, tenn en tråd genom att värma underifrån medan du lägger till löd uppifrån. Placera en generös mängd löd över den stora lödspetsen och använd spetsen för att värma LED-basen vid kontakten som innehåller flussmedel. Efter några sekunder drar du lodet individuellt över varje kontakt och fixerar den svarta ledningen på katoden med ett hårklämma.Lägg en generös mängd löd på den stora lödspetsen och tryck spetsen på tråden tills lodet på LED-basen smälter. Håll ner tråden och ta bort lödkolven medan du håller tråden på plats. Placera en liten mängd lödpasta på dynorna för LED-anslutningarna och använd pincett för att placera lysdioden över dynorna.Håll den förkonserverade röda ledningen på anoden och använd en hårklämma för att klippa tråden. Lägg till löd till den stora spetsen som visas och tryck spetsen på anslutningen tills lodet på LED-basen smälter och lödpastan smälter och blir silver. För att göra LED-ledningarna, placera ett 4,76 millimeter krymprör över tråden skuren i längd och ett 3,18 millimeter krymprör över ledningen till trådkontakten.Remsa och tillsätt flöde till trådändarna. Använd hjälphänderna för att fästa kabeln till trådkontakten och vrid kontaktänden med en trådände. Löd ihop materialen och fäst den andra ledningen på installationen på samma sätt och löd.Fäst sedan LED-kablarna på hjälphänderna med tejp under LED-basen. Blanda sedan epoxi enligt tillverkarens instruktioner och sprid epoxin över toppen av den lödda lysdioden. Använd spadeborren, borra ett 1,5 centimeter hål genom toppen av lådan på vilken lysdioden kommer att placeras och använd ett höghastighetsroterande verktyg för att göra ett hack på ena sidan av hålet för att göra plats för LED-ledningen.Tejpa en 25 till 30 millimeter bit sekretessfilm på den svarta lådan som täcker hålet som lysdioden lyser igenom och tejpa lysdioden utanför den svarta lådan ovanpå hålet. För ett fyra LED-styrsystem, borra fyra 0,83 centimeter hål 3,81 centimeter från varandra i lådans lock och använd ett höghastighetsroterande verktyg för att skära ett rektangulärt hål på 1,19 x 1,90 centimeter i det övre vänstra hörnet. Använd en spadeborr, borra ett 1,5 centimeter hål på baksidan av lådan och sätt in en genomföring i hålet.För de datorstyrda lysdioderna, sandpapper området där mikrokontrollern kommer att limmas i lådan samt undersidan av mikrokontrollerhållaren. Snäpp mikrokontrollern på hållaren och epoxiera sedan hållaren och lådan tillsammans innan du fäster hållaren i den svarta lådan. Placera sedan dubbelhäftande tejp på klämman och fäst klämman inuti lådan.I prover transfekterade för att uttrycka fytokrom B men inte fykocyaninbilin ökar läckaget när mängden rapporter-DNA ökar. Dessutom, när hela fytokrom B-genomkopplaren inklusive phycocyanin bilin-kromofour som producerar plasmid belyses med långt rött ljus, ökar luciferasuttrycket också med de ökande mängderna reporterkonstruktion inom transfektionsblandningen. På samma sätt, när de ljuskänsliga cellerna belyses med rött ljus, ökar luciferasuttrycket också med ökad reportermängd.När man jämför induktionsnivåerna för de röda ljusbehandlade cellerna med de långt röda ljusbehandlade cellerna finner man en liten minskning av vikaktiveringen med ökande mängder reporter. Det är viktigt att noggrant följa varje steg när du bygger den elektriska kretsen och att dubbelkontrollera pinhålnumren rad för rad innan du lödar varje komponent. Detta protokoll kan användas för optisk stimulering av många typer av prover eller optogenetiska verktyg med olika våglängder och möjliggör programmering av belysningsscheman.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En mångsidig automatiserad plattform för mikroskala Experiment cellstimulering

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Ett mikroflödes Chip för Mångsidig kemisk analys av enskilda celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

En guide till strukturerad belysning TIRF Mikroskopi Höghastighets med flera färger

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design och implementering av en automatisk Lysande, Odling och provtagningssystemet för Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

En enkel och skalbar tillverkningsmetod för Organic Electronic Devices på textilier

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

En mångsidig metod för mönstring proteiner och celler

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanorör som ett mångsidigt verktyg för att studera Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering av Saccharomyces cerevisiae och skapandet av jäst pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer för öppen källkod Microplate-kompatibla belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Enkel, prisvärd och modulär mönstra av celler med HJÄLP AV DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...