Name: building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang ve Molly Allen'a, geliştirilmekte olan LED sisteminin farklı versiyonlarını test ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, UC San Diego'daki Kavli Beyin ve Zihin Enstitüsü ve Salk Enstitüsü, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 ve NIH Grant R21DC018237 altındaki NSF Bilgi Bilimi Merkezi aracılığıyla desteklenmiştir.

1. Elektrik devresini kurun
NOT: Kullanılabilir bir LED için tek bir devre oluşturma protokolü burada açıklanmıştır. Bunu dört LED'e kadar genişletme talimatları ek bilgilere dahil edilmiştir.
<ol><li>Duman emiciyi ve havyayı açın. Silme süngerine su ekleyin, lehimi elinizin altında bulundurun. DİKKAT: Dumanı gidermek ve yanıkları önlemek için güvenlik önlemleri aldığınızdan emin olun.</li>
	<li>Devre bileşenlerini, ek panellerde gösterilen sırayla baskılı devre kartına (PCB kartı) lehimlemeye başlayın. NOT: Önce bileşenin metalini ve PCB kartını ısıtmak için havya ucunda az miktarda lehim kullanın ve ek lehimi doğrudan bileşenlerin üzerine eritin; akı çok yardımcı olabilir.</li>
	<li>Lehim atlama teli telleri ve bileşenleri (Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3).<ol><li>Jumper telleri için (devre kartındaki iki noktayı birbirine bağlayan yalıtımlı kablolama), jumper kitinden iki parça turuncu [7,6 mm (0,3 inç)] ve sarı [12 mm (0,4 inç)] tel kullanın.</li>
		<li>PCB kartını "yardım ellerinine" takın ve jumper tellerini aşağıdaki iğne deliklerine yerleştirin, terminalleri 45 derece bükün ve akı ekleyin (Şekil 2, Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3): a1 ve a3 → zemin (-) (turuncu), a7 → güç kaynağı (+) #7 (sarı), d2 → d6 (sarı).</li>
		<li>Lehimleyin ve ardından tellerin arkasını kesin.</li>
		<li>LM317T voltaj regülatörünü aşağıdaki iğne deliklerine takın, pimleri bükün ve akı ekleyin (Şekil 2 ve Ek Şekil 4): Adj → e5, Vçıkış → e6, V → e7.</li>
		<li>Önce sol ve sağ terminalleri lehimleyin, kırpın, sonra lehimleyin ve orta terminali kesin.</li>
		<li>Devrenin düşük voltaj aralığını ayarlamak için, 820 Ω bir direnci iğne deliklerine, lehimlere ve c2 → c5'e kadar yerleştirin (Şekil 2 ve Ek Şekil 5).</li>
		<li>Mikrodenetleyici tarafından LED kontrolünü etkinleştirmek için, transistörü b3-b5 içine takın (Şekil 2 ve Ek Şekil 6): Toplayıcı → b3, Baz → b4, Yayıcı → b5. NOT: Doğru şekilde takmak için transistörün yönüne dikkat edin; Collector, Base ve Emitter tanımını bulmak için teknik özellikleri kontrol edin.</li>
	</ol></li>
	<li>POT, LED, mikrodenetleyici ve güç kaynağı için telden kabloya konektörleri lehimleyin. NOT: Telden kabloya konektörlerin tellerinin rengine ve dişi veya erkek telden kabloya konektör kullanıp kullanmadığına dikkat edin.<ol><li>İstenilen LED için bir "düşük voltaj" devresi mi yoksa "yüksek voltaj" devresi mi gerekli olduğunu belirleyin (Şekil 1C). NOT: LED "düşük voltaj" listesindeyse, POT'a paralel bir direnç gereklidir.</li>
		<li>"Düşük voltaj" veya "yüksek voltaj" devresi için, teli dişi bir telden kabloya konektörden a5 deliğinden yerleştirin (Ek Şekil 7). Alçak gerilim devresini yaparken henüz yerine lehimlemeyin. NOT: Küçük tel kılların pul pul dökülmemesi için çıplak tel uçlarını bükün. Tel, yıpranmadan iğne deliğinden itilemeyecek kadar kalın görünüyorsa, 2-6 ipliği kesin ve sonra bunları tekrar bir araya getirin (Ek Şekil 7B-D).</li>
		<li>"Yüksek voltaj" devresini yapıyorsanız, adım 1.4.5'e atlayın. "Düşük voltaj" devresini yapıyorsanız, 560Ω'luk bir direnci aynı delikten (a5) itin ve telden kabloya konektör kablosuyla lehimleyin.</li>
		<li>Direncin diğer ucunu toprağa bağlayın (Ek Şekil 7G).</li>
		<li>Lehimlenmiş dişi telden kabloya konektörün diğer ucunu, toprağa bağlayan a5 deliğine yerleştirin ve lehimleyin (Ek Şekil 8A, B).</li>
		<li>Mikrodenetleyici bağlantısı için, bir erkek telden tel konektörün bir ucunu a4 deliğine ve diğerini toprağa bağlı bir deliğe yerleştirin (Ek Şekil 9A-C).</li>
		<li>LED bağlantısı için, dişi telden kabloya konektörün bir ucunu a2 deliğine ve diğer ucunu toprağa bağlı bir deliğe yerleştirin (Ek Şekil 9D, E).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Güç kaynağı, manuel güç anahtarı, POT'lar ve mikrodenetleyici bağlantısı oluşturun
<ol><li>Güç kaynağını oluşturun.<ol><li>Turuncu [7,6 mm (0,3 inç)] bir jumper'ı a29'dan yere lehimleyin (Ek Şekil 10).</li>
		<li>Dişi telden kabloya konektörü a30'dan güç kaynağına (+) lehimleyin (Ek Şekil 11A-C).</li>
		<li>Erkek telden kabloya konektörü c29'dan c30'a lehimleyin (Ek Şekil 11D-F).</li>
		<li>Konektörü bir güç kaynağı kablosundan kesin, kabloları açığa çıkarın ve sıyırın (Ek Şekil 12A-C).</li>
		<li>Bir akı kalemi kullanarak lehimlemeden önce tellere akı ekleyin (Ek Şekil 3G).</li>
		<li>Erkek telden kabloya konektörün etrafına 3,18 mm'lik (1/8 inç) bir büzülme tüpü ve güç kaynağı kablosunun üzerine 4,76 mm'lik (3/16 inç) daha kalın bir parça yerleştirin (Ek Şekil 12D).</li>
		<li>Güç kaynağından ve erkek telden kabloya konektörden kabloları birlikte çevirin ve lehimleyin (Ek Şekil 12E, 13A, B).</li>
		<li>Daha küçük çaplı büzülme borusunu 3,18 mm (1/8 inç) bağlantıların üzerine yerleştirin ve bir ısı tabancasıyla küçültün (Ek Şekil 13C, D).</li>
		<li>Daha küçük küçültme borusu 3,18 mm (1/8 inç) üzerine 4,76 mm (3/16 inç) daha büyük çaplı bir shrink tüp yerleştirin ve tekrar ısıtın (Ek Şekil 13E,F).</li>
	</ol></li>
	<li>Manuel güç anahtarını oluşturun.<ol><li>Büzülme tüpünü 3,18 mm (1/8 inç) anahtarın tellerinin üzerine yerleştirin (Ek Şekil 14A).</li>
		<li>Erkek telden kabloya konektörün tellerini bükün ve lehimleyin (Ek Şekil 14B, C).</li>
		<li>Büzülme borusunu lehimli bölümlerin üzerine 3,18 mm (1/8 inç) yerleştirin ve bir ısı tabancasıyla küçültün (Ek Şekil 14D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Erkek telden kabloya konektörü POT'a bağlayın.<ol><li>Telden kabloya konektörün siyah telini POT'un orta terminalinin etrafına iliştirin (Ek Şekil 15B).</li>
		<li>Terminalin etrafına sıkıca iliştirilmiş teli bükün ve lehimleyin (Ek Şekil 15C). NOT: Küçük hassas penseler sıkı bir büküm yapmanıza yardımcı olabilir.</li>
		<li>Ek Şekil 15D'de olduğu gibi terminale kırmızı tel bağlantısıyla tekrarlayın.</li>
		<li>Kırmızı okun yakınındaki metal tırnağı kırmak için pense kullanın (Ek Şekil 15E,F).</li>
	</ol></li>
	<li>Mikrodenetleyici bağlantısını kurun (yalnızca bilgisayar kontrollü LED'ler için gereklidir).<ol><li>Birden fazla LED için bir LED sürücüsü yapıyorsanız, bir dişi telden kabloya konektör dışındaki tüm siyah telleri kesin (Ek Şekil 16A).</li>
		<li>Telden kabloya konektörlerin uçlarını gösterildiği gibi sıkın (Ek Şekil 16B-D).</li>
		<li>Kıvrımlı uçları dikdörtgen konektörden itin (Ek Şekil 16E).</li>
	</ol></li>
</ol>3. LED'leri oluşturun
<ol><li>Tel uçlarını (~ 5 mm) sıyırın ve Ek Şekil 3G'de olduğu gibi bir akı kalemi kullanarak akı uygulayın. NOT: Kabloları LED tabanına verimli bir şekilde lehimlemek için, LED tabanındaki kontaklara ve tellere akı eklenmelidir.</li>
	<li>Teli aşağıdan ısıtarak ve üstten lehim ekleyerek teli kalayın (Ek Şekil 17B).</li>
	<li>LED tabanının yüzey temasına akı yerleştirmek için akı kalemini kullanın (Ek Şekil 17C).</li>
	<li>Büyük bir lehimleme ucuna (~4–5 mm) bol miktarda lehim yerleştirin (Ek Şekil 17D), temastaki LED tabanını ısıtmak için kullanın (Ek Şekil 17E). Birkaç saniye sonra, lehimi kontak boyunca sürükleyin (Ek Şekil 17F). Diğer kontakta 3.3-3.4 arasındaki adımları tekrarlayın (Ek Şekil 17G). DİKKAT: LED taban lehimleme sırasında çok ısınabilir. LED tabanını erimeyecek veya yanmayacak bir yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>Siyah teli saç tokalarını kullanarak "C+" (katot) kontağına klipsleyin (Ek Şekil 18A).</li>
	<li>Büyük lehimleme ucuna bol miktarda lehim yerleştirin (Ek Şekil 18B) ve LED tabanındaki lehim eriyene kadar telin üzerine bastırın (Ek Şekil 18C). Teli basılı tutun (Ek Şekil 18D) ve teli yerinde tutarken havyayı çıkarın (Ek Şekil 18E).</li>
	<li>LED bağlantıları için pedlerin üzerine az miktarda lehim macunu yerleştirin (Ek Şekil 19A,B) ve LED'i forseps kullanarak pedlerin üzerine yerleştirin (Ek Şekil 19C). NOT: Yerleştirme biraz kapalıysa, sorun değil; lehim macunu eridikten sonra yerine oturacaktır.</li>
	<li>Kırmızı teli "A+" (anot) üzerinde tutun ve bir saç tokası ile klipsleyin (Ek Şekil 20A-C).</li>
	<li>Büyük lehimleme ucuna bol miktarda lehim yerleştirin (Ek Şekil 20D) ve LED tabanındaki lehim ve LED'in altındaki lehim macunu eriyene kadar telin üzerine bastırın (Ek Şekil 20E). NOT: Lehim macunu eridikten sonra renk gümüş olur (Ek Şekil 20H,I).</li>
	<li>İstediğiniz kurulum için gereken telin uzunluğunu seçin. LED tellerini ve bir erkek telden tel konektörünü (Ek Şekil 21A) sıyırın ve ardından Ek Şekil 3G'de olduğu gibi akı ekleyin.</li>
	<li>Shrink tüpünü tellerin üzerine yerleştirin. Telden kabloya konektörler üzerinde 3,18 mm (1/8 inç) büzülme tüpü ve tel üzerinde 4,76 mm (3/16 inç) büzülme tüpü kullanın (Ek Şekil 21B).</li>
	<li>Telden kabloya konektörü bir "yardım elleri" ile kırpın ve konektör ucunu telle bükün (Ek Şekil 21C) ve lehimleyin. Diğer telle tekrarlayın (Ek Şekil 21D,E).</li>
	<li>3,18 mm (1/8 inç) shrink tüplerini lehim üzerine yerleştirin ve küçültün (Ek Şekil 21F-G).</li>
	<li>4,76 mm (3/16 inç) shrink tüpünü 3,18 mm (1/8 inç) shrink tüpünün üzerine yerleştirin ve küçültün (Ek Şekil 21H–I).</li>
	<li>LED'i "yardım ellerini" altındaki bantla kablolayın (Ek Şekil 22A).</li>
	<li>Epoksiyi üreticinin talimatlarına göre karıştırın ve lehimli LED'in üstüne yayın (Ek Şekil 22B). Tedavi etmek için gece boyunca bırakın.</li>
	<li>Bir dokunmatik bağlantı elemanı kullanarak monte ediyorsanız, dokunmatik bağlantı elemanının küçük bir parçasını kesin (Ek Şekil 23A) ve LED'in arkasına 30 sn boyunca bastırın.</li>
	<li>Kara kutunun kapağında bir çentik yapmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın (Ek Şekil 23C-E).</li>
	<li>Bir gizlilik filmi aracılığıyla tek bir LED için montaj oluşturun.<ol><li>Kürek matkap ucunu kullanarak, LED'in yerleştirileceği kara kutunun üstünden 1,75 cm'lik (11/16 inç) bir delik açın (Ek Şekil 24A).</li>
		<li>Yüksek hızlı bir döner alet kullanarak, Ek Şekil 24A'da gösterildiği gibi, LED teline yer açmak için deliğin bir tarafında bir çentik yapın.</li>
		<li>Bir parça gizlilik filmi (25–30 mm) kesin ve LED'in aydınlatacağı deliği kaplayan kara kutunun içine bantlayın (Ek Şekil 24A).</li>
		<li>LED'i kara kutunun dışına deliğin üstüne, gizlilik filmi ve bandı elektrik bandı ile yerine yerleştirilmiş olarak yerleştirin (Ek Şekil 24B-E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Aydınlatma sistemine uyacak şekilde bir kara kutu yerleştirin
<ol><li>Dört LED sistemi için, potansiyometrelerin takılacağı 3,81 cm (1,5 inç) aralıklı kapakta dört adet 0,83 cm (21/64 inç) delik açın (Ek Şekil 25).</li>
	<li>Yüksek hızlı bir döner alet kullanarak, sol üst köşedeki 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 inç x 0,75 inç) dikdörtgen bir delik kesin (Ek Şekil 25).</li>
	<li>Kürek matkap ucunu kullanarak, kara kutunun üzerine 1,75 cm'lik (11/16 inç) bir delik açın (Ek Şekil 26).</li>
	<li>Delikleri dosyalayın ve rommeti delinen deliğe yerleştirin (Ek Şekil 26).</li>
	<li>Bilgisayar kontrollü LED'ler için, mikrodenetleyicinin yapıştırılacağı alanı kara kutuya zımparalamanın yanı sıra mikrodenetleyici tutucusunun alt tarafını da zımparalayın.</li>
	<li>Tutucuyu kara kutuya sabitlemeden önce mikrodenetleyiciyi tutucunun üzerine takın ve ardından epoksi yerine oturtun (Ek Şekil 27A).</li>
	<li>İki klipsin tabanını ve devrenin yerleştirileceği kara kutudaki alanı zımparalamak için zımpara kağıdı kullanın ve klipsleri kara kutunun içine epoksi ile sabitleyin (Ek Şekil 27A).</li>
	<li>PCB kartını klipslere sabitleyin (Ek Şekil 27B).</li>
	<li>Güç düğmesini Ek Şekil 25'te yapılan kapaktaki kare delikten geçirin ve yerine oturtun (Ek Şekil 28A).</li>
	<li>POT'ları kapaktaki deliklerden itin, yerine vidalayın (Ek Şekil 28A) ve düğmeyi POT'un üzerine yerleştirin (Ek Şekil 28B).</li>
</ol>5. Tüm kabloları ve cihazları bağlayın
<ol><li>Telden kabloya konektörleri etiketleyin (örneğin, LED, POT, COM) (Ek Şekil 29A).</li>
	<li>Adım 2.4'te (Ek Şekil 16) yapılan kıvrımlı konektörleri, iki dişi konektör (POT ve LED) arasındaki erkek telden kabloya konektöre takın (Ek Şekil 7A ve S37).</li>
	<li>Kıvrımlı uçları mikrodenetleyiciye bağlayın (Ek Şekil 30).</li>
	<li>USB kablosunu rommetten çekin ve mikrodenetleyiciye takın.</li>
	<li>LED'lerin tellerini rommetten çekin ve mikrodenetleyici bağlantısının solundaki dişi telden kabloya konektöre bağlayın (Ek Şekil 9D ve 38).</li>
	<li>Güç kaynağının telini rommetten çekin ve PCB kartının sağ tarafındaki erkek telden kabloya konektöre bağlayın (Ek Şekil 11D).</li>
	<li>Erkek telden kabloya konektörü güç anahtarından PCB kartının sağındaki dişi telden kabloya konektöre bağlayın (Ek Şekil 11A).</li>
	<li>Erkek telden kabloya konektörleri kapaktaki POT'lardan PCB kartındaki dişi telden kabloya konektörlere bağlayın (Ek Şekil 8 ve 36). NOT: Potansiyometreler bağlı olmadan devreyi açmayın.</li>
</ol>6. LED kontrol yazılımını yükleyin
NOT: Github'daki ek dosyadaki ayrıntılı Yazılım Yükleme Talimatları'na bakın. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces
<ol><li>Mikrodenetleyiciyi programlamak için yazılımı indirin ve yükleyin</li>
	<li>Paket yöneticisini indirin ve yükleyin.</li>
	<li>Mikrodenetleyiciyi programlayın.</li>
	<li>Çalışma zamanı altyapısını indirin ve yükleyin.</li>
	<li>Kullanıcı arabirimini indirin.</li>
</ol>7. Hücreleri ışıkla uyarın
<ol><li>Transfect HEK293 hücreleri.<ol><li>Plaka HEK293 hücreleri, 24 kuyucuklu bir plakada kuyu başına 100k hücrede.</li>
		<li>Serumsuz ortamları, Polietilenimin (PEI) ve DNA hacimlerini (Ek Şekil 39) hesaplamak ve üreticinin protokolünü kullanarak transfekt yapmak için örnek tabloyu kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Işıkla hücreleri uyarmak. NOT: Transfeksiyondan sonra hücreler karanlıkta tutulmalı veya optogenetik sistemi uyarmayan bir ışık kaynağı kullanılarak ele alınmalıdır.<ol><li>Hücrelerde ne tür bir stimülasyon kullanılacağına karar verin (sürekli ışık, darbe yoğunluğu vb.).</li>
		<li>POT'lar kapalıyken (saat yönünün tersine), LED güç kaynağını açın.</li>
		<li>Kara kutunun içine hücrelerin yerleştirileceği bir ışık ölçer yerleştirin ve kapağı LED ile sayacın üzerine yerleştirin. Işık yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın.</li>
		<li>LED'leri kontrol etmek için bilgisayarı kullanıyorsanız, kullanıcı arabirimi yazılımını açın.</li>
		<li>Kullanıcı arayüzünü programlayın (Şekil 5A,B).<ol><li>Sol üst panelde, mikrodenetleyici için COM portunu seçin ve Bağlan'a tıklayın.</li>
			<li>Her LED'i programlamak için sağdaki panelleri kullanın. Sürekli ışık için, "Açık Zaman" da sıfır dışında herhangi bir zamanı seçin ve "Zaman Kapalı" yı sıfır olarak ayarlayın.</li>
			<li>Sağ alt panelde, ana zamanlama kontrolünü programlayın.<ol><li>Aydınlatmayı geciktirmek için bir başlangıç gecikmesi (HH:MM) seçin.</li>
				<li>Belirlenen bir süreden sonra tüm LED'leri kapatmak için bir çalışma zamanı (HH:MM) seçin.</li>
				<li>Çalıştır düğmesine tıklayarak aydınlatma programını başlatın (Şekil 5A).</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>8. Çift lusiferaz testi kullanarak gen ekspresyonunu ölçün
<ol><li>1 mL lusiferaz tamponunu lusiferaz reaktifi ile karıştırarak lusiferaz reaktifini hazırlayın ve 1 mL tüplerde aliquot 1 yıla kadar -80 °C'de saklanacak.</li>
	<li>N + 2 kuyucukları için 100 μL için lizis tamponunu 5x'ten 1x'e hazırlayın. Örneğin, 30 numune için, 30 x 20 μL 5X lizis tamponu ve 30 x 80 μL MQ H2O.</li>
	<li>Renilla substrat çözeltisini hazırlayın: 1 mL Renilla tamponu için 20 μL Renilla substratı (bu miktar 10 tahlil için uygundur).</li>
	<li>Hücreleri inkübatörden çıkarın, ortamı aspire edin, kuyucuk başına 100 μL 1x lizis tamponu ekleyin ve 15 dakika boyunca 100 RPM'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.</li>
	<li>En az 1 saat boyunca -20 °C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Numune başına 100 μL lusiferaz reaktifini beyaz bir 96 delikli plakanın bir kuyucuğuna ekleyin.</li>
	<li>Plaka okuyucuyu lüminesans için ayarlayın. Plaka okuyucunun luminometre modülünü kullanarak, entegrasyonu 1 s için ayarlayın.</li>
	<li>Lusiferaz reaktifinin altındaki kuyucuklara çözülmüş lizatlar ekleyin. Çok kanallı pipet kullanarak, 20 μL numuneyi lusiferaz reaktifine karıştırın ve parlaklığı hemen ölçün.</li>
	<li>Okuma platosu sonrasında, 100 μL Renilla substrat çözeltisi ekleyin ve tekrar tarayın.</li>
	<li>Transfeksiyon verimliliğini hesaba katmak için Luciferaz sinyalini Renilla sinyaline bölün.</li>
	<li>Transfeksiyon verimliliği için normalleştirilmiş lusiferaz sinyallerini karşılaştırın (örneğin; kırmızı ışıkla aydınlatılmış ve uzak kırmızı ışıkla aydınlatılmış örneklerden gelen sinyali karşılaştırın).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Klewer, L., Wu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+dimerization+approaches+to+control+cellular+processes.">Light-induced dimerization approaches to control cellular processes.</a> Chemistry - A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).</li><li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms.">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li><li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology.">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).</li><li>Kyriakakis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+orthogonal+molecules+using+ferredoxin+and+ferredoxin-NADP++reductase+systems+enables+genetically+encoded+PhyB+optogenetics.">Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).</li><li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics.">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li><li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptochrome,+phytochrome,+and+anthocyanin+production.">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li><li>Hern&#225;ndez-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+cryptochrome+2+(CRY2).">Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2).</a> Methods. 164-165, 81-90 (2019).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics.">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).</li><li>M&#252;ller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch.">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363 (2016).</li><li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells.">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779 (2013).</li><li>Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-triggered+protein+secretion+system.">A light-triggered protein secretion system.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).</li><li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains.">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li><li>Zhou, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-chain+photoswitchable+CRISPR-Cas9+architecture+for+light-inducible+gene+editing+and+transcription.">A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).</li><li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins.">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256 (2015).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li><li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques.">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li><li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase.">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>M&#252;ller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red/far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch+to+control+gene+expression+in+mammalian+cells.">A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Levskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+engineering+Escherichia+coli+to+see+light.">Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light.</a> Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).</li><li>Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+phytochrome-based+optogenetic+system+controllable+with+near-infrared+light.">A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light.</a> Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).</li><li>Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+optogenetic+pair+for+protein+regulation+and+spectral+multiplexing.">Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing.</a> Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).</li><li>Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+E.+coli+near-infrared+light+sensor.">Engineering an E. coli near-infrared light sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+with+a+photocleavable+protein,+PhoCl.">Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl.</a> Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+labeling+and+control+of+neuromodulatory+circuits+in+the+mammalian+brain.">Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain.</a> Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).</li><li>Kim, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-gated+detection+of+protein-protein+interactions+with+transcriptional+readout.">Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Burada açıklanan LED sistemi, laboratuarımızda çeşitli optogenetik araçları optimize etmek, karakterize etmek ve bunlarla çalışmak için kullanılmıştır. Kyriakakis ve ark.4'te, PhyB-PIF gen anahtarlarının birçok kombinasyonunu paralel olarak test ettik. Daha sonra bu sistemi, gen anahtarı kinetiğini ve etkili ışık yoğunluğunu ölçmek için farklı frekanslarda ışık darbelerini test etmek için kullandık. Bu sistem aynı zamanda stimülasyon için mavi ışık kullanan iki optogenetik sistemi optimize etmek ve karakterize etmek için kullanıldı 5,6. Çoğu optogenetik aracı etkinleştirmek için yalnızca bir LED'in yeterince parlak olması gerektiğinden, her kuyucukta çok sayıda LED bulunan bir sistem satın almak her zaman gerekli değildir. Bu kurulum ucuzdur, güvenilirdir, yeniden yapılandırılması kolaydır ve montaj protokolünü takip etmek için önceden elektrik uzmanlığı gerektirmez.
Ek Şekil 31-38'de, sisteme dört adede kadar LED'in nasıl dahil edileceğini açıklıyoruz. Bu, çok sayıda paralel koşul gerektiren bazı deneyleri sınırlayabilirken, bu protokolde kullanılan 9 Volt güç kaynağını daha yüksek watt'lı bir kaynakla değiştirerek daha fazla LED eklenebilir. Benzer şekilde, her devreye paralel olarak birkaç düşük güçlü LED bağlanabilir. Bu ikinci düzenlemede, bazı LED'ler ayrı ayrı kontrol edilmeyecektir, ancak bu, daha geniş bir alanı kaplamak için birçok LED'in gerekli olması gerektiğinde yararlı olabilir. Bu sistemin elektroniğine aşina olduktan sonra, onu özelleştirmenin birçok yolu vardır. Sistemi özelleştirmek için ek stratejiler, LED'i numuneye daha uzağa veya daha yakın yerleştirmeyi ve homojen aydınlatma koşulları için filtreler / difüzörler aracılığıyla aydınlatmayı veya (Ek Şekil 23) ve Allen ve ark.5'te olduğu gibi ısınmayı önlemeyi içerir. LED tasarımımızın bir diğer dikkat çekici özelliği, epoksi içinde kapsüllenmiş olması ve arkasında bir dokunmatik bağlantı elemanına sahip olmasıdır; bu, LED'in hemen hemen her yere kolaylıkla güvenli bir şekilde yerleştirilmesini sağlar: inkübatörlere, balık tanklarına, hayvan kafeslerine, duvarlara vb.
Genleri, sinyal yollarını ve diğer hücresel aktiviteleri kontrol etmek için optogenetiği kullanan birçok deney genellikle nabız atışı gerektirir, büyük zaman ölçeklerine yayılır veya bir inkübatörde yapılması gerekir, bu nedenle mikroskop olmadan otomatikleştirme veya uzaktan manipülasyon gerektirir. Bu LED sistemi, nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe herhangi bir sorun olmadan birkaç ay boyunca sürekli olarak test edilmiştir. Ek olarak, PhyB optogenetik sistemler gibi geri dönüşümlü sistemlerle, deneycinin spesifik darbeli aydınlatma programlarını programlaması gerekebilir. Önceki çalışmamız4'te, memeli hücrelerindeki bir PhyB-PIF3 anahtarının geri dönüşümlü dinamiklerini kullanıcı arayüzü aracılığıyla test etmek için darbeli programlar kullandık. Bu makalede açıklanan metodolojiyi kullanarak, bir titreşim protokolünün programlanması kolaydır ve birçok optogenetik deney türü için gereken esnekliği ve özerkliği kullanıcı dostu bir şekilde sağlar.
Bu sistemi kurmanın en kritik adımları, PCB kartı üzerindeki elektrik devresini bir araya getirmeyi ve bölüm 1 ve bölüm 2'de ayrıntılı olarak açıklanan bileşenleri bağlamayı içerir. Bu bölümlerdeki her adımı dikkatlice takip etmek ve her bir bileşeni lehimlemeden önce iğne deliği numaralarını satır satır iki kez kontrol etmek önemlidir. Bölüm 2, devreye bağlanacak bileşenlerin nasıl kurulacağını açıklar. Bileşenlerin doğru yönde bağlanması için, telden kabloya konektörlerdeki siyah ve kırmızı tellerin renklerinin eşleştiğinden emin olmak özellikle önemlidir. Bu iki bölümdeki küçük gözetimler büyük olasılıkla sistemin işlevselliğini etkileyecektir. Gerçekten de, bu yöntemle ilgili sorunları gidermenin ilk adımı, devrenin doğru şekilde inşa edildiğini ve tüm bağlantıların yerinde olup olmadığını kontrol etmek olacaktır. İkincisi, gevşek bağlantılar için lehimleme kalitesini ve devreyi kısaltabilecek alevli tel kılları için tellerin kontrol edilmesi özellikle önemlidir. Üçüncü bir adım, LED'lerin doğru çalıştığından emin olmaktır; bu, LED'in iki terminalini timsah klipsleriyle kırparak bir güç kaynağı veya 1,5 V pil kullanılarak yapılabilir. Potansiyel olarak kritik bir diğer husus, ısınmayı (LED'leri yüksek güçte kullanırken) veya daha geniş bir aydınlatma için ışığın yayılmasını önlemektir. Bu hususları ele almak için, LED'ler, Ek Şekil 23 ve Allen ve ark.5'te açıklandığı gibi, içinde "gizlilik filmi" bulunan bir kara kutunun dışına monte edilebilir. Bu sistemin basitliği nedeniyle, modüler bileşenleri doğrulamak, değiştirmek, yükseltmek veya onarmak için onu ayırmak zor değildir.
İndüklenebilir gen sistemleri için bir diğer kritik faktör, kontrol edilen biyolojik sistem için ne kadar aktivasyonun gerekli olduğunu veya ne kadar sızıntının kabul edilebilir olduğunu düşünmektir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, bunlar muhabir DNA'sının miktarına göre değişebilir. Ek olarak, transfeksiyon verimliliği ve dolayısıyla her hücredeki muhabir yapılarının kopya sayısı değişecektir. Bazı deneyler için, sabit miktarda muhabir veya PhyB gen anahtarı bileşeni içeren bir hücre hattı yapmak ve genellikle ilaca neden olan sistemlerde olduğu gibi, istenen indüklenmiş ekspresyon aralığına sahip klonları taramak avantajlı olabilir. Lentiviral plazmid pPK-2304'ün boyutu ve instabilitesi nedeniyle, pcDNA omurga pPK-351 (Addgene #157921) ve pPK-352'deki (Addgene #157922) PhyB anahtarının lentiviral olmayan plazmid versiyonlarını da yaptık.
Bu protokolü takip eden bu LED aydınlatma sistemini kurarak, kullanıcılar in vitro ve in vivo olarak çok çeşitli optogenetik deneyler yapmak için gerekli tüm bileşenlere sahip olurlar. Memeli hücrelerinde PhyB-PIF3 kullanma talimatlarıyla birleştirildiğinde, bu protokol mühendis olmayanların ve biyologların PhyB tabanlı optogenetiği esnek ve etkili bir şekilde çeşitli bağlamlarda kullanmalarına izin verecektir.

Optogenetik araçlar her yerde yaygınlaşıyor ve gen ekspresyonu, hücre sinyalizasyonu ve daha birçok 1,2,3 gibi biyolojik süreçleri optik olarak kontrol etmek için sürekli olarak yeni teknoloji geliştiriliyor. Hücresel süreçleri ışıkla kontrol etme yeteneği, hızlı kinetik, sıkı mekansal kontrol ve ışık yoğunluğu ve maruz kalma süresi ile kontrol edilebilen doza bağlı düzenlemeye izin verir. Bu araçları kullanmak için, bu parametreleri kontrol etmek için bir cihaz gereklidir. Son zamanlarda, sırasıyla kırmızı / uzak kırmızı ışık kullanarak genleri geri dönüşümlü olarak aktive eden ve devre dışı bırakan genetik olarak kodlanmış bir PhyB-PIF3 memeli gen anahtarı geliştirdik,4. Bu sistem birkaç memeli hücre hattında test edildi ve ışık darbeleri de dahil olmak üzere çok az miktarda ışıkla bile gen ekspresyonunun benzersiz indüksiyonunu sağladı. PhyB anahtarı ve benzeri araçları kullanmak isteyen araştırmacılar 5,6 aydınlatma yoğunluğunu ve süresini kontrol etme yöntemleri hakkında sık sık bilgi talep etmektedirler. Bu nedenle, bu protokolü optogenetik için bu araçların daha geniş çapta benimsenmesini sağlamak için adım adım talimatlarla geliştirdik.
LED'lerin yaygın kullanımından önce, fitokromlar7 gibi ışığa duyarlı proteinleri incelemek için filtreli geniş bant ışık kaynakları kullanılmıştır. Son zamanlarda, bazı LED aydınlatma sistemleri optogenetik araçlar 8,9,10,11,12 ile birlikte yayınlanmıştır, ancak bu protokoller elektronik / yazılım konusunda önemli uzmanlık gerektirebilir, özel ekipman gerektirebilir (örneğin, 3D yazıcılar, lazer kesim makineleri veya fotomaskeler) veya bazı araştırmacıların araştırma ihtiyaçları için ihtiyaç duyacakları adım adım talimatları sağlamaz. Çok kuyulu bir plakadaki bireysel kuyuların bağımsız kontrolü yararlı olsa da, araştırmacıların yalnızca açık ve koyu veya kırmızı ışıkta uzak kırmızı ışıkta birkaç farklı örneği karşılaştırmaları gerektiğinde genellikle gereksizdir. Ayrıca, mevcut birçok ticari sistem, sınırlı özelleştirme kabiliyeti ile pahalıdır. Bununla birlikte, bu protokolde açıklanan LED'ler uygun maliyetli, parlaktır ve birçok şekilde monte edilebilir; bu nedenle, birkaç farklı numune türünü aydınlatmak için kullanılabilirler. Protokol ve sağlanan yazılım ile ultraviyole (UV)'den NIR'e kadar değişen LED'ler, UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV domainleri 17,18, Step Function Opsins 19,20, CRY221,22, PhyB 4,23,24 kullanılarak optogenetik deneyler yapmak için yazılımla birlikte kullanılabilir ve kontrol edilebilir. ,25, bakteriyel fitokromlar26,27,28,29 ve diğer ışığa duyarlı sistemler 30,31,32.
Bu protokol, ışık stimülasyonu için farklı parametreleri kontrol etmek için gereken devrelerin ve diğer donanımların yanı sıra bir optogenetik deney yürütmek için moleküler / hücresel araçların montajı için bir öğretici oluşturur. Ek olarak, klonlama için daha küçük ve daha kararlı olan Kyriakakis ve ark.4'ten optimize edilmiş plazmidleri rapor ediyoruz. Bu protokol sayesinde, elektronik ve optik konusunda uzmanlığı olmayan biyologlar, esnek ve sağlam aydınlatma sistemleri kurabilirler. Adım adım bir şekilde, optogenetik araçların daha geniş çapta benimsenmesi için teknik darboğazı ortadan kaldırarak LED sistemlerinin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz. Bu sistem, çoğu hücre kültürü inkübatöründe, tel portları içermese bile kolayca kullanılabilir. Örneğin, LED sistemini nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe performansta herhangi bir düşüş olmadan 6 aydan fazla bir süre boyunca sürekli olarak tuttuk. Ayrıca, LED sisteminin bir bilgisayara nasıl bağlanacağını ve GitHub'da (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces) sağladığımız açık kaynaklı yazılımlarla nasıl arayüzleneceğini de açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak bir sistem oluşturmak, araştırmacılara potansiyel sorunları ayıklamak, parçaları değiştirmek ve işlevleri iyileştirmek / genişletmek için temel bilgileri sağlar.
Sisteme genel bakış
Aydınlatma sisteminin kurulması (1) elektronik devreyi kurmayı, (2) çevre birimlerini (güç kaynağı kablosu, güç anahtarı, vb.) inşa etmeyi, (3) LED'leri oluşturmayı, (4) tüm bu bileşenleri birleştirmeyi ve (5) LED'leri bir kullanıcı arayüzü ile kontrol etmek için yazılımı yüklemeyi içerir (Şekil 1A). Tamamlandığında, aydınlatma sistemi bir kullanıcı arayüzü ile bağımsız olarak dört adede kadar LED'i kontrol edebilir (Şekil 1B). Kullanıcı arayüzü, her LED'in belirli zaman aralıklarında yanıp sönmesini ve belirli bir süre sonra kapanmasını sağlar. Aydınlatma programlarına belirli bir zamanda başlamak için bir başlangıç gecikmesi de vardır. Potansiyometreler (POT'lar) her LED'in yoğunluğunu bağımsız olarak düzenler veya bilgisayar olmadan manuel LED kontrolü için kullanılabilir. LED'lere giden teller, herhangi bir özel uzunlukta olabilir, bu da bir inkübatöre veya laboratuar alanına kolayca yerleştirilmelerini sağlar. Bu LED'lerin yüksek gücü nedeniyle, geniş bir alanı uzaktan tek bir LED ile aydınlatmak için kullanılabilirler.
LED sürücü açıklaması
LED'lerin yoğunluğuna güç sağlamak ve kontrol etmek için, bu protokol bir "LED sürücü" oluşturmak için adımlardan geçecektir. Her LED'in çalıştığı bir voltaj aralığı vardır (Şekil 1C). Çalışma sırasında, regülatörün ışık yoğunluğunu kontrol eden çıkış voltajı bir potansiyometre ile ayarlanabilir. POT, çıkış voltajını/parlaklığını ayarlayarak direnci değiştirir. 1kΩ (1 kilo-ohm) POT ile ayarlama, "yüksek voltaj devresi" dediğimiz şeyi verir ve 1,35 V ila 2,9 V aralığına sahiptir. 2,9 V, düşük voltajlı LED'leri çalıştırmak için çok yüksek olduğundan (Şekil 1C), aralığı düşük voltajlı LED'lerle eşleşecek şekilde sınırlayan tek bir modifikasyon (Direnç 3 veya "R3" Ek Şekil 1A) gösteririz. R3, potansiyometreye paralel olarak LED'lere uygulanan maksimum voltajı 1,85 V'a ( Ek Şekil 8'de ayrıntılı olarak açıklanan montaj) düşürmeye yarar. Akım yerine parlaklığı kontrol etmek için voltaj kullanarak, sistem farklı çalışma voltajlarına sahip LED'ler için daha esnektir. Şekil 1C, optimum devre seçimine rehberlik etmek için yüksek ve düşük voltajlı LED'lerin bir listesini içerir. Bu tasarım, minimum voltajı yeterince düşük tutar, böylece potansiyometre kapalıyken LED tamamen kapanır ve voltajın LED'in tipik çalışma voltajının üzerine çıkmasına izin vermez. PhyB optogenetics için, düşük voltaj devresini kullanan koyu kırmızı ve uzak kırmızı LED'ler kullanıyoruz.
LED bilgisayar kontrol sistemi açıklaması
LED aydınlatma sistemi, bilgisayar veya mikrodenetleyici olmadan sürekli aydınlatma için kullanılabilir. Bununla birlikte, darbeli programlar ve bireysel LED zamanlamasını kontrol etmek için bir mikrodenetleyici kurulmalıdır. LED'leri kontrol etmek için bir mikrodenetleyici kullanmak için, mikrodenetleyiciyi devreye bağlamak için bir transistör gereklidir. Bu transistör, mikrodenetleyiciden gelen voltajı algılar ve iletken veya yalıtkan olmaktan çıkar. "Açık" ve "kapalı" yı kontrol etmek için, R2 boyunca kontrol edilebilir bir şant olarak "NPN anahtarlama tipi transistör" (2N2222) olarak adlandırılan şeyi kullanıyoruz (Ek Şekil 1A). Mikrodenetleyiciden gelen voltaj transistör tabanına uygulandığında, transistör iletken hale gelir ve LED voltajını düşük yapar, LED'i kapatır. Böylece, LED ve transistör açma ve kapama durumları doğrudan PC'ye yüklenen yazılım tarafından kontrol edilen mikrodenetleyici tarafından kontrol edilir.
Aydınlatma sistemini yapmak için aşağıdaki adımlar gereklidir: Elektrik devresini oluşturun; güç kaynağını, manuel güç anahtarını, POT'ları ve mikrodenetleyici bağlantısını kurmak; LED'leri oluşturmak; aydınlatma sistemine uyacak şekilde bir kara kutu yerleştirin; tüm kabloları ve cihazları bağlayın; LED kontrol yazılımını kurun, hücreleri ışıkla uyarın; çift lusiferaz testi kullanarak gen ekspresyonunu ölçün.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18AWG 2pin RED Black wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>15M-28AWG-2468</td>
			<td>Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1K Ohm potentiometer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>52161500</td>
			<td>2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 Gauge Silicone JST Connector</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIM&#38;NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG solid jumper wires</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WJW-60B-R</td>
			<td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. 
			https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261370&#38;sr=1-5&#38;keywords=solid+wire+breadboard&#38;dpID=51UopZhPJeL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>a14051600ux0301</td>
			<td>Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. 
			https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B016ZU2DGC&#38;pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&#38;pd_rd_w=txGNx&#38;pd_rd_wg=ELyii&#38;psc=1&#38;refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>820 ohm 1/2watt 1% tolerance</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>TTL-A-8035-50Ea</td>
			<td>Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). 
			https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&#38;ie=UTF8&#38;qid=1518045187&#38;sr=1-14&#38;keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A Male to B Male Cable (10 Feet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Part# 30-001-10B</td>
			<td>The cable that comes with the Arduino doesn&#39;t fit well in the box. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ardiuino UNO equivilent</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Elegoo EL-CB-001</td>
			<td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino holder</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>X000018</td>
			<td>Fits very snug. 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black boxes for circuits and light chambers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1591ESBK</td>
			<td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PB01-0040</td>
			<td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>sd027</td>
			<td>Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). 
			https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261882&#38;sr=1-7&#38;keywords=Cable+ties&#38;dpID=51zUNmuUjyL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Command Fridge Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>17210CLR</td>
			<td>Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXML-PE01-0070</td>
			<td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape - 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>03429NA</td>
			<td>Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. 
			https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 720nm</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXML-PF01</td>
			<td>Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 740nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC740D-1100-S5</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 780nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC780D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 810nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC810D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farred LED 850nm</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>EDC850D-1100</td>
			<td>Uses &#34;STAR XP 3535&#34; base 
			http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grommets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Pico 6120D</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair/Alligator Clips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED base</td>
			<td>Luxeon Star LEDs</td>
			<td>LXB-RS20A</td>
			<td>Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs 
			https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED PCB fopr Ushio LEDs</td>
			<td>Adura LED solutions</td>
			<td>STAR XP 3535 Package LED</td>
			<td>Fits many other LEDs by Ushio 
			http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>1943587</td>
			<td>Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. 
			https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000FIDTYG</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519261282&#38;sr=1-1&#38;keywords=nte+shrink&#38;dpID=41L5l7LCfiL&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picture Hanging Velcro Strips</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>PH204-16NA</td>
			<td>With these you can hang the LEDs in many places. 
			https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&#38;pd_rd_i=B073XS3CHV&#38;pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&#38;pd_rd_w=3n34Q&#38;pd_rd_wg=sRvec&#38;psc=1&#38;refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>tb013</td>
			<td>Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power switch Rocker Switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SIXQJZML</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&#38;c=ts&#38;dchild=1&#38;keywords=Boat+Rocker+Switches&#38;qid=1594434474&#38;s=sports&#38;sr=1-31&#38;ts_id=2438617011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Connectors - for crimped wires</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>2183-1905-ND</td>
			<td>6 Rectangular Connectors - Housings Black 0.100&#34; (2.54mm) 
			https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;utm_source=google&#38;utm_medium=cpc&#38;utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&#38;utm_term=&#38;utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&#38;gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>LXM3-PD01</td>
			<td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses &#34;Saber 20 mm Star base&#34; 
			https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B002NEV6GS</td>
			<td>3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. 
			https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&#38;qid=1594435012&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder for soldering wires and circuit components</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder-able Breadboard for building the circuit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>GK1007</td>
			<td>Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spade drill bit</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Irwin 88811</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&#38;qid=1519516560&#38;sr=8-10&#38;keywords=11%2F16+spade+bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transistor</td>
			<td>Newark</td>
			<td>2N2222A</td>
			<td>Can buy from many places. 
			http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage regulator</td>
			<td>Newark</td>
			<td>LM317T</td>
			<td>Equivilent to NTE956. 
			https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&#38;mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&#38;s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&#38;CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 tablet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08BYTT79Y</td>
			<td>Any Windows 10 PC will do. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1573</td>
			<td>Common Cell line. 
			https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965&#8722;092</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td>White plates are preferred. Do not use clear plates. 
			https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)</td>
			<td>PolySciences</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Can be replaced with another transfection reagent. 
			https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagonal Cutting Plier (110mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Proskit 1PK-037S</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&#38;keywords=diagonal+cutting+pliers&#38;qid=1594436230&#38;sr=8-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil 3000 with cutting tool and grinder</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 3000</td>
			<td>Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments &#38; 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. 
			https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&#38;keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&#38;qid=1594436404&#38;s=hi&#38;sr=1-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil cutting and grinding tool</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 200-1/15</td>
			<td>Any similar Dremil will work. 
			https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268058&#38;sr=1-1&#38;keywords=dremel+200&#38;dpID=41h9ZucnTYL&#38;preST=_SY300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremil grinding tip</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Dremel 84922</td>
			<td>Silicon Carbide Grinding Stone. 
			https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268585&#38;sr=1-1-fkmr0&#38;keywords=dremel+tip+84922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DS017</td>
			<td>For removing solder/mistakes. 
			https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hand with Magnifying Glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>SE MZ101B</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268108&#38;sr=1-4&#38;keywords=Helping+hands&#38;dpID=31GEhMw7WvL&#38;preST=_SX300_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed Nose Micro Pliers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Hakko CHP PN-20-M</td>
			<td>Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. 
			https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268153&#38;sr=1-1&#38;keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&#38;dpID=3109XRgwn3L&#38;preST=_SX342_QL70_&#38;dpSrc=srch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small screw drivers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Wiha 26197</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&#38;ie=UTF8&#38;qid=1519268018&#38;sr=1-1&#38;keywords=Wiha+precision+set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Yihua 939D+ Digital Soldering Station</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TraceTech No-Clean Flux Pen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>2507-N</td>
			<td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. 
			https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&#38;keywords=2507-N&#38;qid=1595469618&#38;sr=8-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>WSA350</td>
			<td>For soldering safety. 
			https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire strippers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CSP-30-7</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&#178; 32-20AWG</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>IWS-3220M</td>
			<td>These are very common and there are many equivalents. 
			https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&#38;psc=1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building a simple and versatile illumination system for optogenetic experiments

Işık kullanarak biyolojik süreçleri kontrol etmek, araştırmacıların birçok biyolojik süreci manipüle edebilecekleri doğruluğu ve hızı artırmıştır. Optik kontrol, fonksiyonu diseke etmek için benzeri görülmemiş bir yeteneğe izin verir ve yeni genetik tedavileri etkinleştirme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, optogenetik deneyler, araştırmacılar için genellikle bir darboğaz olan mekansal, zamansal veya yoğunluk kontrolüne sahip yeterli ışık kaynakları gerektirir. Burada, mevcut farklı optogenetik araçlar için kolayca özelleştirilebilen düşük maliyetli ve çok yönlü bir LED aydınlatma sisteminin nasıl oluşturulacağını detaylandırıyoruz. Bu sistem, ayarlanabilir LED yoğunluğu ile manuel veya bilgisayar kontrolü için yapılandırılabilir. Devreyi oluşturmak, bilgisayar kontrollü hale getirmek ve LED'leri oluşturmak için resimli bir adım adım kılavuz sunuyoruz. Bu cihazın montajını kolaylaştırmak için, bazı temel lehimleme tekniklerini de tartışıyoruz ve LED'leri kontrol etmek için kullanılan devreyi açıklıyoruz. Açık kaynaklı kullanıcı arayüzümüzü kullanarak, kullanıcılar kişisel bir bilgisayarda (PC) veya ucuz bir tablette hassas zamanlamayı ve ışığın yanıp sönmesini otomatikleştirebilirler. Bu otomasyon, sistemi, genleri, sinyal yollarını ve büyük zaman ölçeklerine yayılan diğer hücresel aktiviteleri kontrol etmek için LED'leri kullanan deneyler için kullanışlı hale getirir. Bu protokol için, ihtiyaç duyulan tüm parçaları inşa etmek veya optogenetik deneyler yapmak için aydınlatma sistemini kullanmak için elektronikte önceden uzmanlık gerekmez.

Watch this Scientific Journal Video about Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments at JoVE.com

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Bu protokol, PhyB ve PIF3 kullanarak kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunu kontrol etmek için optogenetik deneylerin nasıl yapılacağını açıklar. Gen ekspresyonunun veya diğer optogenetiğin bir bilgisayarla kontrol edilmesini sağlayan basit ve esnek bir aydınlatma sistemi oluşturmak için adım adım talimatlar dahildir.

Optogenetik Deneyler için Basit ve Çok Yönlü Bir Aydınlatma Sistemi Oluşturma

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Sistem, araştırmacıların optogenetik deneyler için ucuz ve çok yönlü bir aydınlatma sistemini kolayca inşa etmelerini sağlar. Bu tekniğin avantajları, LED aydınlatma zamanlamasını, görünür yakın IR spektrumunu kapsayan mevcut dalga boylarıyla programlama yeteneğini ve LED'lerin çeşitli bağlamlarda kullanılabileceğini içerir Bir elektrik devresi oluşturmak için, baskılı devre kartını yardım ellerine klipsleyin ve jumper tellerini yerleştirin, bunları A1 ve A3 iğne deliklerini oluşturacak şekilde birbirine bağlayın. D2 jumper teli D6 iğne deliğine ve güç kaynağı artı yedi numaralı jumper kablosu A7 iğne deliğine girer. Terminalleri 45 derece bükün ve akı ekleyin.Lehimlemeden sonra, tellerin arkalarını kesin. Lehimli dişi telin bir ucunu konektörü A5 deliğine bağlayın. Ardından direncin bir ucunu A5 deliğine bağlayın.Konektörün diğer ucunu toprağa bağlayın. Ardından direncin diğer ucunu toprağa bağlayın ve bağlantıyı lehimleyin. Arduino konektörü için, telin uçlarını kablo konektörlerine sıkın ve kıvrımlı uçları dikdörtgen konektörden geçirin.LED'leri ayarlamak için, üstten lehim eklerken aşağıdan ısıtarak bir tel teneke kutulayın. Büyük lehimleme ucunun üzerine bol miktarda lehim yerleştirin ve LED tabanı akı içeren temasta ısıtmak için ucu kullanın. Birkaç saniye sonra, lehimi her temas boyunca ayrı ayrı sürükleyin ve siyah teli bir saç tokası kullanarak katoda sabitleyin.Büyük lehimleme ucuna bol miktarda lehim yerleştirin ve LED tabanındaki lehim eriyene kadar ucu telin üzerine bastırın. Teli basılı tutun ve teli yerinde tutarken havyayı çıkarın. LED bağlantıları için pedlerin üzerine az miktarda lehim macunu yerleştirin ve LED'i pedlerin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın.Önceden konserve edilmiş kırmızı teli anot üzerinde tutun ve teli kesmek için bir saç tokası kullanın. Gösterildiği gibi büyük uca lehim ekleyin ve LED tabanındaki lehim eriyene ve lehim macunu eriyip gümüş olana kadar ucu bağlantıya bastırın. LED telleri yapmak için, uzunluğa kadar kesilmiş telin üzerine 4,76 milimetrelik bir büzülme tüpü ve tel konektörü için tel üzerine 3,18 milimetrelik bir büzülme tüpü yerleştirin.Şeritleyin ve tel uçlarına akı ekleyin. Teli kabloya bağlamak için yardım ellerini kullanın ve konektör ucunu bir tel ucuyla döndürün. Malzemeleri birlikte lehimleyin ve diğer teli kuruluma aynı şekilde takın ve lehimleyin.Ardından LED kablolarını, LED tabanının altındaki bantla yardım ellerine klipsleyin. Daha sonra, epoksiyi üreticinin talimatlarına göre karıştırın ve epoksiyi lehimli LED'in üstüne yayın. Kürek matkap ucunu kullanarak, LED'in yerleştirileceği kutunun üstünden 1,5 santimetrelik bir delik açın ve LED teline yer açmak için deliğin bir tarafında bir çentik yapmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın.LED'in aydınlatacağı deliği kaplayan kara kutuya 25 ila 30 milimetrelik bir gizlilik filmi parçası bantlayın ve LED'i deliğin üstündeki kara kutunun dışına bantlayın. Dört LED kontrol sistemi için, kutunun kapağına 3,81 santimetre arayla dört adet 0,83 santimetre delik açın ve sol üst köşeye 1,19 x 1,90 santimetrelik dikdörtgen bir delik açmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın. Bir kürek matkap ucu kullanarak, kutunun arkasına 1,5 santimetrelik bir delik açın ve deliğe bir rommet yerleştirin.Bilgisayar kontrollü LED'ler için, mikrodenetleyicinin yapıştırılacağı alanı zımpara kağıdı kutuya ve mikrodenetleyici tutucusunun alt tarafına yerleştirin. Mikrodenetleyiciyi tutucunun üzerine oturtun, ardından tutucuyu kara kutuya sabitlemeden önce tutucuyu ve kutuyu epoksi yapın. Ardından klipsin üzerine çift taraflı bant yerleştirin ve klibi kutunun içine sabitleyin.Fitokrom B'yi eksprese etmek için transfekte edilen ancak fikosiyanin bilin olmayan örneklerde, muhabir DNA miktarı arttıkça sızıntı artar. Ek olarak, fikosiyanin iki krom üreten plazmid de dahil olmak üzere tüm fitokrom B gen anahtarı uzak kırmızı ışıkla aydınlatıldığında, lusiferaz ekspresyonu da transfeksiyon karışımı içindeki muhabir yapısının artan miktarları ile artar. Benzer şekilde, ışığa duyarlı hücreler kırmızı ışıkla aydınlatıldığında, lusiferaz ekspresyonu da artan muhabir miktarı ile artar.Kırmızı ışıkla tedavi edilen hücrelerin indüksiyon seviyelerini uzak kırmızı ışıkla tedavi edilen hücrelerle karşılaştırırken, artan miktarda muhabirle birlikte kıvrım aktivasyonunda küçük bir azalma bulunur. Elektrik devresini oluştururken her adımı dikkatlice takip etmek ve her bir bileşeni lehimlemeden önce iğne deliği numaralarını satır satır iki kez kontrol etmek önemlidir. Bu protokol, çeşitli dalga boyları kullanarak birçok numune türünün veya optogenetik araçların optik stimülasyonu için kullanılabilir ve aydınlatma programlarının programlanmasına izin verir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Tekstil Organik Elektronik Cihazlar Basit ve Ölçeklenebilir Fabrikasyon Yöntemi

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome düzenleme Saccharomyces cerevisiae ve Maya Pixel Art oluşturulması

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Açık Kaynak Mikroplaka Uyumlu Aydınlatma Panelleri Uygulamaları

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

DNA Kullanarak Hücrelerin Basit, Uygun Fiyatlı ve Modüler Deseni

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...