Name: electric-field-induced neural precursor cell differentiation in microfluidic devices
Uploaded: 2021-04-14T14:00:00
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Die Autoren danken Professor Tang K. Tang, Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Academia Sinica, für seine Unterstützung bei der Bereitstellung von mausneuralen Stamm- und Vorläuferzellen (mNPCs). Die Autoren danken auch Professor Tang K. Tang und Frau Ying-Shan Lee für ihre wertvolle Diskussion über die Differenzierung von mNPCs.

1. Design und Herstellung des MOE-Chips
<ol><li>Zeichnen Sie Muster für einzelne Polymethylmethacrylatschichten (PMMA) und das doppelseitige Band mit entsprechender Software (Abbildung 1A, Materialtabelle). Schneiden Sie sowohl die PMMA-Platten als auch das doppelseitige Band mit einem CO 2-Lasermaschinenschreiber (Abbildung 1B).<ol>
<li>Schalten Sie den CO 2-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an. Öff...

<ol>
	<li>Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+DC+electric+field-induced+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).</li><li>Li, S., Li, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+spiral+ganglion+neurite+extension+in+electrical+fields+of+charge-balanced+biphasic+pulses+and+direct+current+in+vitro.">Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro.</a> Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).</li><li>Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+neurite+growth+in+a+weak+DC+electric+field+depends+on+the+substratum:+contributions+of+adhesivity+and+net+surface+charge.">The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge.</a> Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+proliferation+and+differentiation+in+neural+precursor+cells+by+the+Jak+pathway.">Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway.</a> Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).</li><li>Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+directs+migration,+enhances+and+orients+cell+division+and+upregulates+the+chemokine+receptors+CXCR4+and+CXCR2+in+endothelial+cells.">Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).</li><li>Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibits+electric+field-induced+migration+of+non-small+cell+lung+cancer+(NSCLC)+cells.">Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).</li><li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field.">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).</li><li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip.">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).</li><li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells.">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).</li><li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-powered+electrical+stimulation+for+enhancing+neural+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+on+graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene)+hybrid+microfibers.">Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers.</a> American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).</li><li>Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+electrical+stimulation+and+cisplatin+in+HeLa+cell+death.">Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+moderate+exogenous+electric+field+stimulation+on+activating+netrin-1/DCC+expression+against+mechanical+stretch-induced+injury+in+spinal+cord+neurons.">Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons.</a> Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).</li><li>Haan, N., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+application+of+electric+fields+in+the+injured+nervous+system.">Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system.</a> Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).</li><li>Ariza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+electric+fields+on+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).</li><li>Huang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+human+lung+cancer+cell+line+CL1-5+in+response+to+a+direct+current+electric+field.">Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field.</a> PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).</li><li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds.">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).</li><li>Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+studies+of+lung+cancer+cells+using+a+multichannel+dual-electric-field+microfluidic+chip.">Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip.</a> Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).</li><li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITO+patterning+by+a+low+power+Q-switched+green+laser+and+its+use+in+the+fabrication+of+a+transparent+flow+meter.">ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).</li><li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier.">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).</li><li>Fuhr, G., Shirley, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+handling+and+characterization+using+micron+and+submicron+electrode+arrays:+state+of+the+art+and+perspectives+of+semiconductor+microtools.">Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).</li><li>AChang, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+electrical+currents+stimulation+promotes+both+proliferation+and+differentiation+of+fetal+neural+stem+cells.">Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells.</a> PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).</li><li>Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+current+electric+fields+of+varying+frequencies:+effects+on+proliferation+and+differentiation+of+porcine+neural+progenitor+cells.">Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells.</a> Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).</li></ol>

Bei der Herstellung des MOE-Chips werden die Adapter mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber am Layer 1 des MOE-Chips befestigt. Der Kleber wird auf 4 Ecken der Adapter aufgetragen, und dann wird der Druck gleichmäßig über die Adapter aufgebracht. Überschüssige Klebstoffmenge muss vermieden werden, um eine vollständige Polymerisation des Klebers zu gewährleisten. Darüber hinaus wird die fertige MOE-Chip-Montage in einer Vakuumkammer inkubiert. Dieser Schritt hilft, die Blasen zwischen der PMMA-Schicht, dem doppe...

Neurale Vorläuferzellen (NPCs, auch bekannt als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen) können ein vielversprechender Kandidat für neurodegenerative therapeutische Strategiesein 1. Die undifferenzierten NPCs haben Selbsterneuerungskapazität, Multipotenz und proliferative Fähigkeit2,3. Eine frühere Studie hat berichtet, dass die extrazelluläre Matrix und molekulare Mediatoren die Differenzierung von NPC regulieren. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der grundlegende Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) fördern die NPC-Proliferation und behalten so den undifferenzierten Zustandbei 4.
Frühere Studien haben berichtet, dass elektrische Stimulation zellphysiologische Aktivitäten wie Abteilung5,Migration6,7,8, Differenzierung1,9,10und Zelltod11regulieren kann. Elektrische Felder (EFs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Regeneration der Entwicklung des zentralen Nervensystems12,13,14. Von 2009 bis 2019 hat dieses Labor zelluläre Reaktionen auf die Anwendung von EF im mikrofluidischen System1,6,7,8,15,16,17untersucht. Ein mehrkanalig, optisch transparenter, elektrotaktischer (MOE) Chip wurde entwickelt, um für die Immunfluoreszenzfärbung für die konfokale Mikroskopie geeignet zu sein. Der Chip hatte eine hohe optische Transparenz und eine gute Haltbarkeit und ermöglichte die gleichzeitige Durchführung von drei unabhängigen Stimulationsexperimenten und mehreren immunbefleckten Bedingungen in einer einzigen Studie. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Dieser Beitrag beschreibt die Entwicklung eines mikrofluidischen Zellkultursystems, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie verwendet wurde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)</td>
			<td>BHT</td>
			<td>K2R20</td>
			<td>Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tube</td>
			<td>Protech Technology Enterprise Co., Ltd</td>
			<td>CT-15-PL-TW</td>
			<td>Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>DVR-3413</td>
			<td>3 mL oral syringes, without needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm optical grade PMMA (Layer 5)</td>
			<td>CHI MEI Corporation</td>
			<td>ACRYPOLY PMMA Sheet</td>
			<td>Optical grade PMMA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td>NCN-3L</td>
			<td>Sterile disposable 3-way stopcock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>DVR-3410</td>
			<td>5 mL oral syringes, without needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor</td>
			<td>Dong Zhong Co., Ltd.</td>
			<td>Customized</td>
			<td>PMMA adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Agarose, low gelling temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>A.A. Lab Systems Ltd</td>
			<td>A-304</td>
			<td>High voltage amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>Educational Version</td>
			<td>Drafting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td>Also called recombinant human FGF-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black rubber bung</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>DVR-3413</td>
			<td>From 3 mL oral syringes, without needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4287</td>
			<td>Blocking reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HSIANGTAI</td>
			<td>CV2060</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 laser scriber</td>
			<td>Laser Tools and Technics Corp.&#160;</td>
			<td>ILS-II</td>
			<td>Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cone connector</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>F-120X</td>
			<td>One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16&#34; OD natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cone-Luer adaptor</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>E-330</td>
			<td>Automatic time-lapse image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2024</td>
			<td>Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>PET 8018</td>
			<td>Purchased from http://en.thd.com.tw/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium/Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12400024</td>
			<td>DMEM/F-12, powder, HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600010</td>
			<td>DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF multiplexer</td>
			<td>Asiatic Sky Co., Ltd.</td>
			<td>Customized</td>
			<td>Monitor and control the electric current in individual channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Also called recombinant human EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-acting cyanoacrylate glue</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>7004T</td>
			<td>Strength instant adhesive (liquid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom connector</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-206</td>
			<td>Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16&#34; OD blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>33120A</td>
			<td>High-performance 15 MHz synthesized&#160;function generator&#160;with built-in arbitrary waveform capability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150117</td>
			<td>Goat anti-mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488) preadsorbed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150086</td>
			<td>Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&#38;L (Alexa Fluor 555), preadsorbed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.48v</td>
			<td>Analyze the fluorescent images&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium&#8211;tin&#8211;oxide (ITO) glass</td>
			<td>Merck</td>
			<td>300739</td>
			<td>For ITO heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>CKX41</td>
			<td>For cell morphology observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-type thermocouple</td>
			<td>Tecpel</td>
			<td>TPK-02A</td>
			<td>Temperature&#160;thermocouples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer adapter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P618-01</td>
			<td>Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>DVR-3413</td>
			<td>For agar salt bridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFAP</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-9892</td>
			<td>Astrocytes marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodendrocyte &#160;marker&#160; O4&#160; antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1326</td>
			<td>Oligodendrocytes marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Fixing&#160;agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Basic Life</td>
			<td>BL2651</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine (PLL)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision cover glasses thickness No. 1.5H</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>107242</td>
			<td>https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable X-Y-Z motorised stage</td>
			<td>Tanlian Inc</td>
			<td>Customized</td>
			<td>Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proportional&#8211;integral&#8211;derivative (PID) controller</td>
			<td>Toho Electronics</td>
			<td>TTM-J4-R-AB</td>
			<td>Temperature controller&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>Professional Plastics Inc. Taiwan Branch</td>
			<td>Outer diameter 1/16 Inches</td>
			<td>White translucent PTFE tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Tuj1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18207</td>
			<td>Neuron marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Systems Inc</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td>NE-1000 programmable single syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFD4 detergent</td>
			<td>FRANKLAB</td>
			<td>TFD4</td>
			<td>Cover glass cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal bonder</td>
			<td>Kuan-MIN Tech Co.</td>
			<td>Customized</td>
			<td>Purchased from http://kmtco.com.tw/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Permeabilized solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>LEO</td>
			<td>LEO-300S</td>
			<td>Ultrasonic steri-cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.</td>
			<td>DOV-30</td>
			<td>Vacuum drying oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fingertight plug</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-316</td>
			<td>1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electric-field-induced neural precursor cell differentiation in microfluidic devices

Physiologische elektrische Felder (EF) spielen eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, Differenzierung, Teilung und tod. Dieses Papier beschreibt ein mikrofluidisches Zellkultursystem, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie mittels Mikroskopie verwendet wurde. Das mikrofluidische System besteht aus folgenden Hauptkomponenten: einem optisch transparenten elektrotaktischen Chip, einer transparenten Indium-Zinnoxid-Heizung (ITO), einer Kulturmedienfüllpumpe, einer elektrischen Stromversorgung, einem Hochfrequenz-Leistungsverstärker, einem EF-Multiplexer, einer programmierbaren X-Y-Z-Motorbühne und einem invertierten Phasenkontrastmikroskop mit Digitalkamera. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Diese Arbeit beinhaltet die Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs), die durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) induziert werden. Im Stammzellerhaltungsmedium unterschieden sich die Maus-NPCs (mNPCs) nach der DC-Pulsstimulation in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine einfache DC-Pulsbehandlung das Schicksal von mNPCs steuern und zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden könnte. Das System kann für die Zellkultur in mehreren Kanälen, für die langfristige EF-Stimulation, für die zellmorphologische Beobachtung und für die automatische Zeitrafferbildaufnahme verwendet werden. Dieses mikrofluidische System verkürzt nicht nur die benötigte Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Kontrolle auf der Mikroumgebung.

Die detaillierte Konfiguration des MOE-Chips ist in Abbildung 1dargestellt. Der mikrofluidische Chip bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbaugröße, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Der MOE-Chip wurde entwickelt, um drei unabhängige EF-Stimulationsexperimente und mehrere Immunflecken gleichzeitig in einer einzigen Studie durchzuführen (Abbildung 3). Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chi...

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Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) vor, das ausschließlich durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) in einem mikrofluidischen System induziert wird.

Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Diese Studie stellt ein Protokoll zur Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen vor, das ausschließlich durch Gleichstrompulsstimulation in einem mikrofluidischen System induziert wird. Diese Technik bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbauzeit, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chip für konfokale Mikroskopiebeobachtungen.Die einfache Gleichstrompulsbehandlung kann das Schicksal der neuronalen Vorläuferzellen der Maus steuern und könnte zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden. Zeichnen Sie zunächst Muster für einzelne PMMA-Schichten und das doppelseitige Band mit entsprechender Software. Schalten Sie den Kohlendioxid-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an.Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software. Legen Sie die PMMA-Blätter oder das doppelseitige Band auf die Plattform des Laserschreibers und fokussieren Sie den Laser dann mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder das doppelseitige Band. Wählen Sie den Laserschreiber als Drucker aus, und starten Sie dann den Laserschreiber, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Band zu starten.Entfernen Sie die Schutzfolie von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas. Zum Verkleben mehrerer Schichten von PMMA-Platten drei Stücke von einem Millimeter PMMA-Platten stapeln und unter einem Druck von fünf Kilogramm pro Quadratzentimeter in einem thermischen Bonder für 30 Minuten bei 110 Grad Celsius verkleben, um die Strömungs- oder elektrische Stimulationskanal-Baugruppe zu bilden. 12 Stück Adapter in Schicht eins der MOE-Chip-Baugruppe mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber an den einzelnen Öffnungen kleben.Desinfizieren Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate, das doppelseitige Band und das drei Millimeter optische PMMA mit ultravioletter Bestrahlung 30 Minuten lang, bevor Sie den Chip montieren. Verkleben Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate auf dem drei Millimeter optischen PMMA mit dem doppelseitigen Klebeband, um die PMMA-Baugruppe zu vervollständigen. Das gereinigte Deckglas mit dem beidseitigen Klebeband an der PMMA-Baugruppe kleben.Versiegeln Sie die Öffnungen der Agar-Brückenadapter mit weißen fingerdichten Steckern. Schließen Sie den flachen Bodenstecker über die mittleren Einlass- und Auslassadapter an die MOE-Chip-Baugruppe an, und schließen Sie dann den Kegel-Luer-Adapter an die Drei-Wege-Stoppcocks an. Fügen Sie zwei Milliliter 0,01%PLL-Lösung mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit dem Drei-Wege-Stopcock des Mediums Einlass verbunden ist, und schließen Sie eine leere Drei-Milliliter-Spritze an den Drei-Wege-Hahn des Medium-Auslasses.Füllen Sie die Zellkulturbereiche mit der PLL-Lösung, und pumpen Sie die Beschichtungslösung langsam hin und her. Schließen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks, um die Lösung innerhalb der Kulturregionen zu versiegeln. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, der mit 5% Kohlendioxid-Atmosphäre gefüllt ist.Öffnen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks und spülen Sie Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell hin und her in den Kanal pumpen. Zeichnen Sie drei Milliliter komplettes Medium in eine Drei-Milliliter-Spritze, die sich mit dem Drei-Wege-Stopphahn des Mediumeinlasses verbindet, und fügen Sie ihn hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Ersetzen Sie den weißen Finger-tight-Stecker durch den Luer-Adapter und injizieren Sie 3%heiße Agarose, um den Adapter zu füllen.Schließen Sie die Luer-Sperrspritze an den Luer-Adapter an und injizieren Sie 3%heiße Agarose durch die schwarze Gummi-Bong, um die Luer-Sperrspritze zu füllen. 10 bis 20 Minuten für die Agarose abkühlen und erstarren lassen. Installieren Sie den zellsäenden MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einer programmierbaren XYZ-Motorbühne bei 37 Grad Celsius befestigt ist.Infundieren Sie die mNPCs, indem Sie den MOE-Chip manuell über den mittleren Auslass in den MOE-Chip pumpen, und dann den zellgesäten MOE-Chip auf der ITO-Heizung vier Stunden lang inkubieren. Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um quadratische Wellen-DC-Impulse auszugeben.Entfernen Sie alle flachen Bodenstecker und Adapter auf dem MOE-Chip und füllen Sie die Adapter mit PBS, und versiegeln Sie dann die Adapteröffnungen mit Parafilm. Beobachten Sie die Zellen nach der Immunfärbung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Die DC-Pulsstimulation führte zu einer gleichzeitigen Unterscheidung von mNPCs in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten im Stammzellerhaltungsmedium.Die Prozentsätze von Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in der Kontrollgruppe und in der Stimulationsgruppe werden hier gezeigt. Nach der DC-Pulsbehandlung drückten die mNPCs signifikant hohe Anzahl von Neuronen bei DIV 7, Astrozyten an DIV 3 und Oligodendrozyten bei DIV 7 und DIV 14 waren in den Stimulationsgruppen relativ höher als in der Kontrollgruppe. Neurosphären, die durch 30 bis 40 Zellen gebildet werden, werden bevorzugt für die Initiierung der mNPC-Differenzierung.Ein Überwuchern von mNPCs beeinträchtigt das Zellüberleben während des Differenzierungsprozesses.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Forschung

Biotechnik

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

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We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

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Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

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