Name: xenopus laevis egg extract preparation and live imaging methods for visualizing dynamic cytoplasmic organization
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization at JoVE.com

نشكر ج. كامينز و Y. Chen و W. Y. C. HUANG على تعليقاتهم على المخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM110564 و P50 GM107615 و R35 GM131792) الممنوحة لجيمس إي فيريل جونيور.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة ستانفورد.
1. إعداد الشرائح وأغطية
<ol><li>ضع طبقة من الشريط اللاصق الإيثيلين بروبيلين المفلور (FEP) على شريحة زجاجية باستخدام قضيب الأسطوانة. قطع الشريط الزائد على الحواف بشفرة حل...

<ol>
	<li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle.">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li><li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF,+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis.">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li><li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle.">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation.">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li><li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis.">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li><li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs.">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts.">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li><li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system.">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li><li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling.">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li><li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters.">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li><li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles.">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li><li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+polymerization+dynamics,+opposed+motors,+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles.">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li><li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly.">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li><li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro.">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li><li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system.">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts.">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts.">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).</li><li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts.">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li><li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly,+DNA+replication,+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li><li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos.">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers.">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li><li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells.">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li><li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase.">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li><li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts.">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li><li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts.">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li><li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro.">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li><li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts.">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li><li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro.">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li><li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts.">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li><li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin.">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li><li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos.">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li><li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis.">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li></ol>

ظهرت مستخلصات البيض Xenopus laevis كنظام نموذجي قوي للدراسات القائمة على التصوير لمختلف الهياكل تحت الخلوية10،14،15،16،17،18،21،31،32،33،34،35<...

يشكل السيتوبلازم الحجم الرئيسي للخلية وله تنظيم متميز. يمكن أن تتجمع مكونات السيتوبلازم حقيقي النواة ذاتيا في مجموعة واسعة من الهياكل المكانية ، مثل زهور النجمة microtubule وجهاز Golgi ، والتي بدورها يتم ترتيبها ديناميكيا وقلبها اعتمادا على هوية الخلية وحالتها الفسيولوجية. وبالتالي فإن فهم التنظيم المكاني للسيتوبلازم وارتباطه بالوظائف الخلوية مهم لفهم كيفية عمل الخلية. تم استخدام مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا في المقايسات البيوكيميائية السائبة1،2،3،4،5،6،7،8 ، لكن العمل الأخير يؤسسها كنظام تصوير حي قوي للدراسات الميكانيكية للهياكل السيتوبلازمية ووظائفها الخلوية9،10،11 ، 12،13،14،15،16،17،18. تحافظ هذه المستخلصات غير المخففة على العديد من هياكل ووظائف السيتوبلازم ، مع السماح بالتلاعب المباشر بمحتويات السيتوبلازم التي لا يمكن تحقيقها في النماذج التقليدية القائمة على الخلايا19,20. هذا يجعلها مثالية لتوصيف الظواهر السيتوبلازمية وتشريح أسسها الميكانيكية.
تتطلب الطرق الحالية لمستخلصات التصوير تعديلات على السطح الكيميائي ، أو تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة. تتطلب إحدى الطرق القائمة على غطاء الغطاء تخميل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لأغطية الزجاج21. تتطلب الطريقة القائمة على المستحلب الدقيق ترسب بخار ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على الأسطح الزجاجية22,23. تسمح الأنظمة القائمة على الموائع الدقيقة بالتحكم الدقيق في حجم وهندسة وتكوين قطرات الاستخراج ، ولكنها تتطلب مرافق تصنيع دقيقة متخصصة11،12،24.
نقدم هنا طريقة بديلة لتصوير مستخلصات البيض سهلة التنفيذ وتستخدم مواد متاحة بسهولة ومنخفضة التكلفة. يتضمن ذلك تحضير غرفة تصوير مع شريحة وغطاء مغطى بشريط بروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP). يمكن استخدام الغرفة لتصوير المستخلصات مع مجموعة متنوعة من أنظمة الفحص المجهري ، بما في ذلك المجاهر المجسمة والمجاهر المستقيمة والمقلوبة. لا تتطلب هذه الطريقة أي معالجة كيميائية للأسطح مع تحقيق وضوح بصري مماثل تم الحصول عليه باستخدام الطرق القائمة على الزجاج التي تمت مناقشتها أعلاه. وهي مصممة لتصوير طبقة من مقتطفات بسمك موحد عبر حقل 2D ، ويمكن تمديدها بسهولة لتصوير حجم 3D من المستخلصات. إنه مناسب تماما للتصوير بفاصل زمني للسلوك السيتوبلازمي الجماعي على مجال رؤية كبير.
لقد استخدمنا مستخلصات البيض البينية المحتجزة لتوضيح طريقة التصوير لدينا. يتبع إعداد المستخلص بروتوكول Deming و Kornbluth19. باختصار ، يتم سحق البيض الذي يتم القبض عليه بشكل طبيعي في الطور الاستوائي من الانقسام الاختزالي الثاني عن طريق الدوران بسرعة منخفضة. يطلق هذا الدوران السيتوبلازم من الاعتقال الاختزالي ويسمح للمستخلص بالمضي قدما في الطور البيني. عادة ، يتم إضافة السيتوكلاسين B قبل الدوران الساحق لمنع تكوين F-actin. ومع ذلك ، يمكن حذفه إذا كان F-actin مطلوبا. يضاف Cycloheximide أيضا قبل الدوران الساحق لمنع مستخلص الطور البيني من دخول الانقسام التالي. يتم وضع المستخلصات لاحقا في غرف التصوير المذكورة أعلاه وتوضع على المجهر. أخيرا ، يتم تسجيل الصور بمرور الوقت على فترات زمنية محددة بواسطة كاميرا متصلة بالمجهر ، مما ينتج عنه سلسلة صور بفاصل زمني تلتقط السلوك الديناميكي للمستخلص في حقل 2D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>17 ml centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square #1 cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10236624001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Protein synthesis inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td>Actin polymerization inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Xenopus laevis frogs</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00535MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL488M-A</td>
			<td>For visualizing the microtubule cytoskeleton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td>For visualizing the microtubule cytoskeleton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape</td>
			<td>CS Hyde company</td>
			<td>23-FEP-2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin (hCG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging spacer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70327-8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11017101001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td>For visualizing mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>BioVendor</td>
			<td>RP1782725000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller applicator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMBJSP8</td>
			<td>For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>For removing excessive FEP tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenopus laevis egg extract preparation and live imaging methods for visualizing dynamic cytoplasmic organization

تستخدم مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا للمقايسات البيوكيميائية السائبة ، وقد ظهرت كأداة قوية قائمة على التصوير لدراسة الظواهر السيتوبلازمية ، مثل التحريك الخلوي وتشكيل المغزل الانقسامي وتجميع النواة. بناء على الطرق المبكرة التي صورت المستخلصات الثابتة التي تم أخذ عينات منها في نقاط زمنية متفرقة ، تقوم الأساليب الحديثة بتصوير المقتطفات الحية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني ، مما يكشف عن ميزات أكثر ديناميكية مع دقة زمنية محسنة. تتطلب هذه الطرق عادة معالجات سطحية متطورة لوعاء التصوير. نقدم هنا طريقة بديلة للتصوير الحي لمستخلصات البيض التي لا تتطلب معالجة سطحية كيميائية. من السهل تنفيذ واستخدام المواد الاستهلاكية المختبرية ذات الإنتاج الضخم للتصوير. وصفنا نظاما يمكن استخدامه لكل من الفحص المجهري واسع المجال والبؤر. وهي مصممة لمقتطفات التصوير في مجال ثنائي الأبعاد (2D) ، ولكن يمكن تمديدها بسهولة إلى التصوير في 3D. إنه مناسب تماما لدراسة تكوين النمط المكاني داخل السيتوبلازم. من خلال البيانات التمثيلية ، نوضح التنظيم الديناميكي النموذجي للأنابيب الدقيقة والنوى والميتوكوندريا في مستخلصات الطور البيني المحضرة باستخدام هذه الطريقة. يمكن أن توفر بيانات الصور هذه معلومات كمية عن ديناميكيات السيتوبلازم والتنظيم المكاني.

يمكن استخدام مستخلصات بيض Xenopus laevis لدراسة التنظيم الذاتي للسيتوبلازم أثناء الطور البيني. يوضح الشكل 2 أ نتائج تجربة ناجحة. قمنا باستكمال المستخلصات البينية المقبوضة بنوى الحيوانات المنوية Xenopus laevis 19 بتركيز 27 نواة / ميكرولتر و 0.38 ميك?...

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization at JoVE.com

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

وصفنا طريقة لإعداد والتصوير الحي للمقتطفات السيتوبلازمية غير المخففة من بيض Xenopus laevis .

زينوبوس لايفيس تحضير مستخلص البيض وطرق التصوير الحية لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

هذه الطريقة مناسبة للتصوير الحي لديناميات السيتوبلازم باستخدام مستخلصات بيض الضفدع ، مما يتيح دراسة معلومات النمط المكاني في السيتوبلازم. يمكن تشكيل العينات في طبقة بسمك موحد وقابل للتعديل وتصويرها عبر حقل 2D أو حجم 3D. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ.ابدأ بوضع طبقة من الشريط اللاصق FEP على شريحة زجاجية باستخدام قضيب الأسطوانة. قطع الشريط الزائد على الحواف بشفرة حلاقة نظيفة. بعد ذلك ، قم بإعداد زلات الغطاء المطلي بشريط FEP بنفس الطريقة.ثم ضع فاصل تصوير لاصق على الوجهين على الجانب المطلي بشريط FEP من الشريحة مع ترك البطانة الواقية غير مقشرة. انقل البيض إلى دورق زجاجي سعة 400 مل وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت لوضع البيض عن طريق الصب. ثم احتضان البيض في 100 ملليلتر من محلول إزالة الشوائب الطازج وقم بتحريكه برفق.بعد حوالي ثلاث دقائق ، اسكب المحلول وأضف 100 مل من محلول إزالة الشوائب الطازج. استمر في الحضانة حتى يتم تعبئة البيض بإحكام ، ولكن تجنب ترك البيض في محلول إزالة الشوائب لأكثر من خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول إزالة الشوائب قدر الإمكان واغسل البيض في محلول 0.25x MMR.حرك البيض ، ثم اسكب العازلة. كرر عدة مرات حتى يتم استخدام ما مجموعه لتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل. بعد ذلك ، اغسل البيض عدة مرات بإجمالي 400 مل من محلول تحلل البيض ، وإزالة البيض غير الطبيعي بين الغسيل.ثم استخدم ماصة نقل ذات طرف عريض لنقل البيض إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 17 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من محلول تحلل البيض. قم بتدوير الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري بمعدل 400 جم لمدة 15 ثانية لتعبئة البيض. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول تحلل البيض باستخدام ماصة باستور.تحديد الحجم التقريبي للبيض المعبأ. ثم أضف خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من كل من أبروتينين وليببتين وسيتوكلاسين ب و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من سيكلوهيكساميد مباشرة فوق البيض المعبأ. سحق البيض عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 دقيقة عند 12،000 جم وأربع درجات مئوية في دوار دلو متأرجح.بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة قياس 18 بحقنة. مع توجيه طرف الإبرة المائل لأعلى ، قم بثقب الأنبوب من الجانب الموجود أسفل الطبقة السيتوبلازمية واستعد المستخلص عن طريق الرسم ببطء. انقل مستخلص السيتوبلازم المستعاد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واحتفظ به على الجليد.عندما تكون جاهزا للتصوير ، استكمل المستخلص بالكواشف المطلوبة ومجسات التصوير الفلوري. قم بإزالة البطانة الواقية العلوية من فاصل التصوير على الشريحة المعدة وقم بإيداع ما يقرب من سبعة ميكرولترات من المستخلص في وسط البئر. قم على الفور بتطبيق زلة الغطاء المطلي بشريط FEP بحيث يكون جانب FEP مواجها للمستخلص لإغلاق البئر والمضي قدما بسرعة في التصوير.اضبط الشريحة على مجهر مقلوب أو مستقيم باستخدام منصة آلية وكاميرا رقمية. قم بتصوير المقتطفات في المواضع المكانية المطلوبة في فترات زمنية في كل من قنوات المجال الساطع والتألق. توضح هنا تجربة الفاصل الزمني باستخدام مستخلصات بيض xenopus laevis لدراسة التنظيم الذاتي للسيتوبلازم أثناء الطور البيني.بعد حوالي 20 دقيقة من الحضانة في مناطق درجة حرارة الغرفة المستنفدة من مكونات السيتوبلازم المبعثرة للضوء كانت مرئية في كل من قنوات المجال الساطع والميتوكوندريا. بحلول حوالي 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، يجب أن يكون النمط المكاني الذي يتكون من مقصورات تشبه الخلية راسخا بشكل جيد مع الأنابيب الدقيقة التي تشكل بنية مجوفة تشبه إكليل الزهور والميتوكوندريا مقسمة بوضوح إلى كل حجرة. يتم هنا عرض مقارنة لأداء الاستخراج في غرف التصوير مع وبدون أشرطة FEP على الزجاج.في الغرفة المصنوعة من الزجاج المسجل FEP ، يتم تنظيم المستخلص ذاتيا في أنماط طبيعية تشبه الخلايا. في الغرفة حيث لم تكن الأسطح الزجاجية مغطاة بشريط FEP ، أظهر المستخلص أنماطا غير طبيعية للمجال الساطع والأنابيب الدقيقة التي تعطلت بشكل متزايد بمرور الوقت. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في الاستيراد النووي لبروتين GST-mCherry-NLS.الأشياء المهمة التي يجب تذكرها هي تخميل الأسطح الزجاجية بشريط FEP وإزالة جميع البيض الفاسد أثناء تحضير المستخلص. مع هذا النظام ، يمكننا بسهولة التحكم في سمك عينة المستخلص ، مما يمهد الطريق لتصوير الأنماط السيتوبلازمية في 3D ، باستخدام المجهر ورقة الضوء.

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...