Name: xenopus laevis egg extract preparation and live imaging methods for visualizing dynamic cytoplasmic organization
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization at JoVE.com

Vi takker J. Kamenz, Y. Chen og W. Y. C. Huang for kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 og R35 GM131792) tildelt James E. Ferrell, Jr.

Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stanford University.
1. Forberedelse av lysbilder og coverslips
<ol><li>Påfør et lag fluorert etylenpropylen (FEP) tape på et glassglass med en rulleapplikator. Klipp av overdreven tape over kantene med et rent barberblad. Klargjør FEP tape-belagte coverslips på samme måte (figur 1A).</li>
	<li>Påfør et dobbeltsidig klebrig bildeavstandsstykke på FEP-tapeb...

<ol>
	<li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle.">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li><li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF,+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis.">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li><li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle.">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation.">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li><li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis.">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li><li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs.">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts.">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li><li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system.">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li><li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling.">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li><li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters.">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li><li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles.">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li><li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+polymerization+dynamics,+opposed+motors,+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles.">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li><li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly.">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li><li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro.">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li><li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system.">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts.">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts.">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).</li><li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts.">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li><li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly,+DNA+replication,+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li><li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos.">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers.">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li><li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells.">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li><li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase.">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li><li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts.">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li><li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts.">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li><li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro.">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li><li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts.">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li><li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro.">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li><li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts.">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li><li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin.">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li><li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos.">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li><li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis.">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li></ol>

Xenopus laevis eggekstrakter har dukket opp som et kraftig modellsystem for bildebaserte studier av ulike subcellulære strukturer 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 og cytoplasmatisk organisasjon på en helhet</sup...

Cytoplasma utgjør hovedvolumet til en celle og har en distinkt organisasjon. Ingrediensene i den eukaryote cytoplasma kan selvmontere seg i et bredt spekter av romlige strukturer, for eksempel mikrotubuli asters og Golgi-apparatet, som igjen er dynamisk ordnet og omgjort avhengig av cellens identitet og fysiologiske tilstand. Å forstå den romlige organiseringen av cytoplasma og dens kobling til cellulære funksjoner er derfor viktig for å forstå hvordan cellen fungerer. Xenopus laevis eggekstrakter har tradisjonelt blitt brukt til bulk biokjemiske analyser 1,2,3,4,5,6,7,8, men nyere arbeid etablerer dem som et kraftig levende bildebehandlingssystem for mekanistiske studier av cytoplasmatiske strukturer og deres cellulære funksjoner 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Disse ufortynnede ekstraktene bevarer mange strukturer og funksjoner i cytoplasma, samtidig som de tillater direkte manipulasjoner av cytoplasmatisk innhold som ikke kan oppnås i konvensjonelle cellebaserte modeller19,20. Dette gjør dem ideelle for å karakterisere cytoplasmatiske fenomener og dissekere deres mekanistiske grunnlag.
Eksisterende metoder for avbildning av ekstrakter krever kjemiske overflatemodifikasjoner, eller fabrikasjon av mikrofluidiske enheter. En coverslip-basert metode krever polyetylenglykol (PEG) passivering av glassdeksel21. En mikroemulsjonsbasert metode krever dampavsetning av triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan på glassflater22,23. Mikrofluidbaserte systemer tillater presis kontroll av volum, geometri og sammensetning av ekstraktdråper, men krever spesialiserte mikrofabrikasjonsanlegg11,12,24.
Her introduserer vi en alternativ metode for avbildning av eggekstrakter som er enkel å implementere og benytter lett tilgjengelige, rimelige materialer. Dette inkluderer fremstilling av et bildekammer med et lysbilde og et deksel belagt med fluorert etylenpropylen (FEP) tape. Kammeret kan brukes til avbildningsekstrakter med en rekke mikroskopisystemer, inkludert stereoskoper og stående og inverterte mikroskoper. Denne metoden krever ingen kjemisk behandling av overflater, samtidig som man oppnår tilsvarende optisk klarhet oppnådd med eksisterende glassbaserte metoder diskutert ovenfor. Den er designet for å avbilde et lag med ekstrakter med en jevn tykkelse over et 2D-felt, og kan enkelt utvides til å avbilde et 3D-volum av ekstrakter. Det er godt egnet for time-lapse-avbildning av kollektiv cytoplasmatisk oppførsel over et stort synsfelt.
Vi har brukt interfase-arresterte eggekstrakter for å demonstrere vår bildebehandlingsmetode. Ekstraktpreparatet følger protokollen til Deming og Kornbluth19. Kort fortalt knuses egg som naturlig arresteres i metafase av meiose II av et spinn med lav hastighet. Dette spinnet frigjør cytoplasma fra meiotisk arrest og lar ekstraktet fortsette inn i interfase. Normalt tilsettes cytokalasin B før knusespinnet for å hemme F-aktindannelsen. Det kan imidlertid utelates hvis F-aktin er ønskelig. Cykloheksimid tilsettes også før knusespinnet for å forhindre at interfaseekstraktet kommer inn i neste mitose. Ekstraktene blir deretter plassert i de nevnte avbildningskamrene og plassert på et mikroskop. Til slutt blir bilder tatt opp over tid med definerte intervaller av et kamera koblet til mikroskopet, og produserer time-lapse-bildeserier som fanger den dynamiske oppførselen til ekstraktet i et 2D-felt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>17 ml centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square #1 cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10236624001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Protein synthesis inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td>Actin polymerization inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Xenopus laevis frogs</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00535MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL488M-A</td>
			<td>For visualizing the microtubule cytoskeleton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td>For visualizing the microtubule cytoskeleton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape</td>
			<td>CS Hyde company</td>
			<td>23-FEP-2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin (hCG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging spacer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70327-8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11017101001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td>For visualizing mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>BioVendor</td>
			<td>RP1782725000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller applicator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMBJSP8</td>
			<td>For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>For removing excessive FEP tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenopus laevis egg extract preparation and live imaging methods for visualizing dynamic cytoplasmic organization

Tradisjonelt brukt til bulk biokjemiske analyser, har Xenopus laevis eggekstrakter dukket opp som et kraftig bildebasert verktøy for å studere cytoplasmatiske fenomener, som cytokinese, mitotisk spindeldannelse og montering av kjernen. Ved å bygge på tidlige metoder som avbildet faste ekstrakter samplet på sparsomme tidspunkter, nærmer nyere bilder levende ekstrakter ved hjelp av time-lapse mikroskopi, og avslører mer dynamiske funksjoner med forbedret tidsmessig oppløsning. Disse metodene krever vanligvis sofistikerte overflatebehandlinger av bildekaret. Her introduserer vi en alternativ metode for levende avbildning av eggekstrakter som ikke krever kjemisk overflatebehandling. Det er enkelt å implementere og benytter masseproduserte laboratorieforbruksvarer for avbildning. Vi beskriver et system som kan brukes til både vidvinkelmikroskopi og konfokalmikroskopi. Den er designet for avbildningsekstrakter i et 2-dimensjonalt (2D) felt, men kan enkelt utvides til avbildning i 3D. Det er godt egnet for å studere romlig mønsterdannelse i cytoplasma. Med representative data demonstrerer vi den typiske dynamiske organisasjonen av mikrotubuli, kjerner og mitokondrier i interfaseekstrakter fremstilt ved hjelp av denne metoden. Disse bildedataene kan gi kvantitativ informasjon om cytoplasmatisk dynamikk og romlig organisering.

Xenopus laevis eggekstrakter kan brukes til å studere cytoplasmens selvorganisasjon under interfase. Figur 2A viser resultater fra et vellykket eksperiment. Vi supplerte interfase-arresterte ekstrakter med demembranerte Xenopus laevis sædkjerner 19 ved en konsentrasjon på 27 kjerner / μL og 0,38 μM renset GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (fusjonsprotein bestående av glutation-S-transferase</...

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization at JoVE.com

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Vi beskriver en metode for fremstilling og levende avbildning av ufortynnede cytoplasmatiske ekstrakter fra Xenopus laevis-egg .

Xenopus laevis Eggekstraktforberedelse og levende bildebehandlingsmetoder for visualisering av dynamisk cytoplasmatisk organisasjon

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Denne metoden er egnet for levende avbildning av cytoplasmatisk dynamikk ved bruk av froskeeggekstrakter, noe som gjør det mulig å studere romlig mønsterinformasjon i cytoplasma. Prøver kan formes til et lag med en jevn og justerbar tykkelse og avbildes over et 2D-felt eller 3D-volum. Denne metoden er kostnadseffektiv og enkel å implementere.Begynn med å påføre et lag med FEP-tape på et glassglass med en rulleapplikator. Klipp av overdreven tape over kantene med et rent barberblad. Deretter forbereder du FEP tape belagt deksel slips på samme måte.Påfør deretter et dobbeltsidig klebrig bildeavstandsstykke på FEP-tapebelagt side av lysbildet, slik at beskyttelsesforingen ikke er skrellet. Overfør egg til et 400 milliliter glassbeger og fjern så mye eggleggingsbuffer som mulig ved å dekantere. Deretter inkuberer eggene i 100 ml nylaget dejellying-løsning og virvler dem forsiktig.Etter omtrent tre minutter, hell av løsningen og tilsett 100 ml frisk dejellying-løsning. Fortsett inkubasjonen til eggene er tett pakket, men unngå å la egg ligge i dejellying-løsningen i mer enn totalt fem minutter. Etter inkubasjonen, fjern dejellying-løsningen så mye som mulig og vask eggene i 0,25x MMR-buffer.Virvle eggene, hell deretter av bufferen. Gjenta noen ganger til totalt en liter av bufferen brukes til vaskene. Deretter vasker du eggene et par ganger med totalt 400 milliliter egglysebuffer, og fjerner unormale egg mellom vaskene.Bruk deretter en overføringspipette med en bred kuttspiss for å overføre eggene til et 17 milliliter rundt bunnsentrifugerrør som inneholder en milliliter egglysebuffer. Spinn røret i en klinisk sentrifuge på 400 g i 15 sekunder for å pakke eggene. Fjern deretter så mye av egglysebufferen som mulig ved hjelp av en Pasteur-pipette.Bestem det omtrentlige volumet av de pakkede eggene. Deretter legger du til fem mikrogram per milliliter hver av aprotinin, leupeptin og cytochalasin B og 50 mikrogram per milliliter cykloheksamid direkte på toppen av de pakkede eggene. Knus eggene ved å sentrifusere røret i 15 minutter ved 12.000 g og fire grader Celsius i en svingende bøtterotor.Deretter festes en 18 gauge nål til en sprøyte. Med nålespissen skrå vendt opp, punkter røret fra siden i bunnen av det cytoplasmatiske laget og gjenopprett ekstraktet ved å tegne sakte. Overfør det gjenvunnede cytoplasmatiske ekstraktet til et nytt mikrosentrifugerør og hold det på is.Når du er klar til å avbilde, supplere ekstraktet med de ønskede reagensene og fluorescensavbildningsprobene. Fjern den øverste beskyttelsesforingen fra bildeavstandsstykket på det forberedte lysbildet og legg omtrent syv mikroliter ekstrakt i midten av brønnen. Påfør umiddelbart FEP-tapebelagt dekselslipp med FEP-siden vendt mot ekstraktet for å forsegle brønnen og raskt fortsette til avbildning.Sett lysbildet på et omvendt eller oppreist mikroskop med en motorisert scene og et digitalt kamera. Se for deg ekstraktene i de ønskede romlige posisjonene i tidsintervaller i både lyse felt- og fluorescenskanaler. Et time-lapse-eksperiment ved bruk av xenopus laevis eggekstrakter for å studere cytoplasmens selvorganisasjon under interfase er vist her.Etter ca. 20 minutters inkubasjon ved romtemperatur var områder utarmet av lysspredning cytoplasmatiske komponenter synlige i både lyse felt- og mitokondrierkanaler. Etter ca. 60 minutter ved romtemperatur bør et romlig mønster bestående av cellelignende rom være godt etablert med mikrotubuli som danner en hul kranslignende struktur og mitokondrier tydelig delt inn i hvert rom. En sammenligning av ekstraktytelse i avbildningskamre med og uten FEP-bånd på glass er vist her.I kammeret laget med FEP teipet glass ekstraktet selvorganisert i normale celle-lignende mønstre. I kammeret der glassflatene ikke var dekket av FEP-båndet, viste ekstraktet unormale lyse felt- og mikrotubulimønstre som ble stadig mer forstyrret over tid. Ingen signifikante forskjeller ble observert i kjernefysisk import av GST-mCherry-NLS-proteinet.De viktige tingene å huske er å passivere glassflatene med FEP-tape og å fjerne alle dårlige egg under tilberedning av ekstrakt. Med dette systemet kan vi enkelt kontrollere tykkelsen på ekstraktprøven, og bane vei for avbildning av cytoplasmatiske mønstre i 3D, ved hjelp av lysarkmikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Forbereder Individuell Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Ansikts transplantasjoner i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Rekonstituering av β-catenin degradering i<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...