Name: xenopus laevis egg extract preparation and live imaging methods for visualizing dynamic cytoplasmic organization
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization at JoVE.com

Мы благодарим J. Kamenz, Y. Chen и W. Y. C. Huang за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R01 GM110564, P50 GM107615 и R35 GM131792), присужденными Джеймсу Э. Ферреллу-младшему.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Стэнфордского университета.
1. Подготовка слайдов и обложек
<ol><li>Нанесите слой фторированной этиленпропиленовой (FEP) клейкой ленты на стеклянную горку с ?...

<ol>
	<li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle.">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li><li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF,+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis.">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li><li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle.">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation.">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li><li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis.">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li><li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs.">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts.">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li><li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system.">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li><li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling.">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li><li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters.">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li><li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles.">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li><li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+polymerization+dynamics,+opposed+motors,+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles.">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li><li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly.">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li><li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro.">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li><li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system.">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts.">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts.">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).</li><li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts.">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li><li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly,+DNA+replication,+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li><li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos.">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers.">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li><li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells.">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li><li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase.">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li><li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts.">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li><li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts.">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li><li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro.">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li><li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts.">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li><li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro.">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li><li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts.">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li><li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin.">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li><li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos.">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li><li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis.">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li></ol>

Экстракты яиц Xenopus laevis стали мощной модельной системой для визуализационных исследований различных субклеточных структур 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 и цитоплазматической организации в целом </sup...

Цитоплазма составляет основной объем клетки и имеет четкую организацию. Ингредиенты эукариотической цитоплазмы могут самособираться в широкий спектр пространственных структур, таких как микротрубочки и аппарат Гольджи, которые, в свою очередь, динамически располагаются и переворачиваются в зависимости от идентичности клетки и физиологического состояния. Таким образом, понимание пространственной организации цитоплазмы и ее связи с клеточными функциями важно для понимания того, как работает клетка. Экстракты яиц Xenopus laevis традиционно использовались для объемных биохимических анализов 1,2,3,4,5,6,7,8, но недавняя работа устанавливает их как мощную живую систему визуализации для механистических исследований цитоплазматических структур и их клеточных функций 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Эти неразбавленные экстракты сохраняют многие структуры и функции цитоплазмы, позволяя при этом прямые манипуляции с цитоплазматическим содержимым, недостижимые в обычных клеточных моделях19,20. Это делает их идеальными для характеристики цитоплазматических явлений и препарирования их механистических основ.
Существующие методы визуализации экстрактов требуют химической модификации поверхности или изготовления микрофлюидных устройств. Один метод на основе чехла требует пассивации полиэтиленгликолем (ПЭГ) стеклянных покровных пластин21. Метод, основанный на микроэмульсии, требует осаждения из пара трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силана на стеклянных поверхностях22,23. Системы на основе микрофлюидов позволяют точно контролировать объем, геометрию и состав капель экстракта, но требуют специализированных средств микропроизводства 11,12,24.
Здесь мы представляем альтернативный метод визуализации экстрактов яиц, который прост в реализации и использует легкодоступные, недорогие материалы. Это включает в себя подготовку камеры визуализации с затвором и крышкой, покрытой фторированной этиленпропиленовой лентой (FEP). Камера может быть использована для визуализации экстрактов с различными системами микроскопии, включая стереоскопы и вертикальные и инвертированные микроскопы. Этот метод не требует химической обработки поверхностей при достижении аналогичной оптической чистоты, полученной с помощью существующих методов на основе стекла, рассмотренных выше. Он предназначен для изображения слоя экстрактов с равномерной толщиной в 2D-поле и может быть легко расширен для изображения 3D-объема экстрактов. Он хорошо подходит для покадровой визуализации коллективного цитоплазматического поведения в большом поле зрения.
Мы использовали экстракты яиц с межфазным арестом, чтобы продемонстрировать наш метод визуализации. Подготовка экстракта осуществляется в соответствии с протоколом Деминга и Корнблута19. Короче говоря, яйца, естественно остановленные в метафазе мейоза II, измельчаются низкоскоростным вращением. Этот спин освобождает цитоплазму от мейотического ареста и позволяет экстракту переходить в интерфазу. Обычно цитохалазин B добавляют перед дробильным спином для ингибирования образования F-актина. Тем не менее, он может быть опущен, если требуется F-актин. Циклогексимид также добавляют перед дробильным спином, чтобы предотвратить попадание межфазного экстракта в следующий митоз. Экстракты впоследствии помещают в вышеупомянутые камеры визуализации и помещают на микроскоп. Наконец, изображения записываются с течением времени через определенные промежутки времени камерой, подключенной к микроскопу, создавая покадровые серии изображений, которые фиксируют динамическое поведение экстракта в 2D-поле.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>17 ml centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x22 mm square #1 cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10236624001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Protein synthesis inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td>Actin polymerization inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Xenopus laevis frogs</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00535MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL488M-A</td>
			<td>For visualizing the microtubule cytoskeleton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td>For visualizing the microtubule cytoskeleton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape</td>
			<td>CS Hyde company</td>
			<td>23-FEP-2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin (hCG)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging spacer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70327-8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11017101001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td>For visualizing mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>BioVendor</td>
			<td>RP1782725000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller applicator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07HMBJSP8</td>
			<td>For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>For removing excessive FEP tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenopus laevis egg extract preparation and live imaging methods for visualizing dynamic cytoplasmic organization

Традиционно используемые для объемных биохимических анализов, экстракты яиц Xenopus laevis стали мощным инструментом на основе визуализации для изучения цитоплазматических явлений, таких как цитокинез, формирование митотического веретена и сборка ядра. Основываясь на ранних методах, которые изображали фиксированные экстракты, отобранные в редкие временные точки, последние подходы изображают живые экстракты с использованием покадровой микроскопии, выявляя более динамические особенности с улучшенным временным разрешением. Эти методы обычно требуют сложной обработки поверхности сосуда визуализации. Здесь мы представляем альтернативный метод живой визуализации экстрактов яиц, которые не требуют химической обработки поверхности. Он прост в реализации и использует серийные лабораторные расходные материалы для визуализации. Описана система, которая может быть использована как для широкоугольной, так и для конфокальной микроскопии. Он предназначен для визуализации экстрактов в 2-мерном (2D) поле, но может быть легко расширен до визуализации в 3D. Он хорошо подходит для изучения формирования пространственного рисунка в цитоплазме. С репрезентативными данными мы демонстрируем типичную динамическую организацию микротрубочек, ядер и митохондрий в интерфазных экстрактах, приготовленных с использованием этого метода. Эти данные изображения могут предоставить количественную информацию о цитоплазматической динамике и пространственной организации.

Экстракты яиц Xenopus laevis можно использовать для изучения самоорганизации цитоплазмы во время интерфазы. На рисунке 2А показаны результаты успешного эксперимента. Мы дополнили интерфазно-арестованные экстракты демембранированными ядрами спермато?...

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization at JoVE.com

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Описан способ получения и живой визуализации неразбавленных цитоплазматических экстрактов из яиц Xenopus laevis .

Xenopus laevis Подготовка экстракта яйцеклеток и методы визуализации в реальном времени для визуализации динамической цитоплазматической организации

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Этот метод подходит для живой визуализации цитоплазматической динамики с использованием экстрактов яиц лягушки, что позволяет изучать пространственную информацию о паттерне в цитоплазме. Образцы могут быть сформированы в слой с равномерной и регулируемой толщиной и визуализированы в 2D-поле или 3D-объеме. Этот метод экономически эффективен и прост в реализации.Начните с нанесения слоя клейкой ленты FEP на стеклянный слайд с помощью роликового аппликатора. Отрежьте лишнюю ленту по краям чистым лезвием бритвы. Далее таким же образом подготовьте ленту FEP с покрытием крышки.Затем нанесите двустороннюю липкую прокладку для визуализации на сторону слайда, покрытую лентой FEP, оставив защитный вкладыш неочищенным. Переложите яйца в стеклянный стакан объемом 400 миллилитров и удалите как можно больше буфера для яйцекладки путем декантирования. Затем высиживают яйца в 100 миллилитрах свежеприготовленного раствора для дежелирования и аккуратно закручивают их.Примерно через три минуты вылейте раствор и добавьте 100 миллилитров свежего раствора для обезжелезивания. Продолжайте инкубацию до тех пор, пока яйца не будут плотно упакованы, но не оставляйте яйца в растворе для обезжелезивания более пяти минут. После инкубации удалите раствор для обезжелезивания как можно больше и вымойте яйца в буфере 0,25x MMR.Закрутите яйца, затем вылейте буфер. Повторите несколько раз, пока для стирки не будет использован в общей сложности один литр буфера. Затем вымойте яйца несколько раз с помощью в общей сложности 400 миллилитров буфера лизиса яиц, удаляя аномальные яйца между промывками.Затем используйте передаточную пипетку с широким нарезанным наконечником, чтобы перенести яйца в 17-миллилитровую центрифужную трубку с круглым дном, содержащую один миллилитр буфера лизиса яиц. Раскрутите трубку в клинической центрифуге по 400 г в течение 15 секунд, чтобы упаковать яйца. Затем удалите как можно больше буфера лизиса яиц с помощью пипетки Пастера.Определите примерный объем упакованных яиц. затем добавляют по пять микрограммов на миллилитр каждого апротинина, лейпептина и цитохалазина В и 50 мкг на миллилитр циклогексамида непосредственно поверх упакованных яиц. Раздавите яйца центрифуя трубку в течение 15 минут при 12 000 г и четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ведра.Затем прикрепите иглу 18 калибра к шприцу. Кончиком иглы, обращенным вверх, проколоть трубку со стороны на дне цитоплазматического слоя и восстановить экстракт, медленно рисуя. Перенесите восстановленный цитоплазматический экстракт в новую микроцентрифужную трубку и держите его на льду.Когда вы будете готовы к изображению, дополните экстракт желаемыми реагентами и флуоресцентными зондами. Снимите верхний защитный вкладыш с распорки на подготовленном слайде и нанесите примерно семь микролитров экстракта в центр колодца. Немедленно нанесите покрытие с покрытием ленты FEP стороной FEP лицом к экстракту, чтобы загерметизировать скважину и быстро приступить к визуализации.Установите затвор на перевернутый или вертикальный микроскоп с моторизованной сценой и цифровой камерой. Изображайте экстракты в нужных пространственных положениях во временных интервалах как в ярком поле, так и в флуоресцентных каналах. Здесь показан покадровый эксперимент с использованием экстрактов яиц xenopus laevis для изучения самоорганизации цитоплазмы во время интерфазы.Примерно через 20 минут инкубации при комнатной температуре области, истощенные светорассеивающими цитоплазматическими компонентами, были видны как в ярком поле, так и в каналах митохондрий. Примерно к 60 минутам при комнатной температуре должна быть хорошо установлена пространственная картина, состоящая из клеточных отсеков с микротрубочками, образующими полую венокообразную структуру, и митохондриями, четко разделенными на каждый отсек. Здесь показано сравнение производительности экстракта в камерах визуализации с лентами FEP на стекле и без них.В камере, изготовленной из заклеенного стекла FEP, экстракт самоорганизуется в нормальные клеточные узоры. В камере, где стеклянные поверхности не были покрыты лентой FEP, экстракт показывал аномальное яркое поле и микротрубочки, которые со временем становились все более нарушенными. Существенных различий в ядерном импорте белка GST-mCherry-NLS не наблюдалось.Важно помнить, что стеклянные поверхности пассивируются лентой FEP и удаляют все плохие яйца во время приготовления экстракта. С помощью этой системы мы можем легко контролировать толщину образца экстракта, прокладывая путь для визуализации цитоплазматических узоров в 3D, используя микроскопию светового листа.

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Пластиковые вложения и секционирования Xenopus laevis Эмбрионы

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Получение Яйца Xenopus laevis Женщины

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Подготовка и Фракционирование Xenopus laevis Яйцо Экстракты

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Подготовка индивидуальных Drosophila Яйцо палат для работы с изображениями Онлайн

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Восстановление β-катенина ухудшение<em&gt; Xenopus</em&gt; Яйцо Экстракт

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...