Name: sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Forfatterne takker Vanessa Meldener-Harrell for kritisk lesning av manuskriptet.

Bruk av mus som kilde til blod til sandfluefôring ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health (NIH). Protokollen ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen i NIAID, NIH (protokollnummer LPD 68E). Hvirvelløse dyr dekkes ikke av NIH-retningslinjer.
1. Nålpreparat (Figur 1)
<ol><li>Trekk nåler og skråkant som beskrevet i Meuti og Harrell19. Trekk kort nål...

<ol>
	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi:+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major.">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li><li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection.">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).</li><li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes.">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans.">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites.">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li><li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis.">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li><li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies:+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections.">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li><li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania.">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).</li><li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality.">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering.">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li><li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR/Cas9.">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).</li><li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR/Cas9.">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651 (2020).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control.">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li></ol>

Vi presenterer her en nylig utviklet embryomikroinjeksjonsmetode for målrettet mutagenese av CRISPR / Cas9 i Phlebotomus papatasi sandfluer. Embryomikroinjeksjon for insektgenetiske modifikasjoner ble utviklet i Drosophila på midten av 1980-tallet21 og brukes nå rutinemessig i et bredt spekter av insekter. Andre metoder for levering av genetiske modifikasjonsmaterialer er utviklet for bruk i insekter, for eksempel ReMOT20,21...

Vektorbårne sykdommer er en stor folkehelsetrussel i konstant evolusjon. Hundrevis av vektorarter spredt over svært distinkte fylogene familier (f.eks. mygg, flått, lopper) er ansvarlige for overføringen av et stort antall mikrobielle patogener, noe som resulterer i mer enn 700.000 menneskelige dødsfall i året, ifølge Verdens helseorganisasjon. Blant vektorinsekter utgjør phlebotomine sandfluer (Diptera, Psychodidae) en stor gruppe, med 80 påviste vektorarter som viser distinkte fenotypiske egenskaper og vektorkapasiteter som finnes i forskjellige geografiske regioner. De er vektorer for protozoanske parasitter av slekten Leishmania, forårsaker rundt 1,3 millioner nye tilfeller av Leishmaniases og mellom 20.000 og 30.000 dødsfall i året. Leishmaniases kliniske utfall er varierte, med symptomer som spenner fra selvbegrensende kutane lesjoner til visceral formidling som er dødelig i fravær av behandling.
Sandfluer er strengt jordbaserte insekter. Deres livssyklus, relativt lang sammenlignet med andre Diptera, varer opptil tre måneder, avhengig av forskjellige parametere som temperatur, fuktighet og ernæring. Den består av ett embryonalt stadium (6 til 11 dager), fire larvestadier (som varer totalt 23 til 25 dager) og en puppetrinn (9 til 10 dager) etterfulgt av metamorfose og deretter voksen alder. Sandfluer krever et fuktig og varmt miljø for oppdrett. Både menn og kvinner spiser på sukker, oppnådd i naturen fra blomsternektarer. Bare kvinner er blodmatere, da de krever proteiner hentet fra blodmelet for eggproduksjon1.
Et viktig forskningsfokus er å identifisere arten av vektor/parasitt interaksjoner som fører til utvikling av overførbare infeksjoner. Som med andre vektorinsekter har parametere iboende til sandfluer vist seg å påvirke deres vektorkompetanse, som er definert som deres evne til å bære og overføre patogener til vertene. For eksempel kan uttrykket av galectins av Phlebotomus papatasi sand fly midgut celler, som fungerer som reseptorer som gjenkjenner parasittoverflatekomponenter, direkte påvirke deres vektorkompetanse for Leishmania major2,3. Insekt immunresponsveien, Immunmangel (IMD), er også avgjørende for Phlebotomus papatasi sandflue vektor kompetanse for Leishmania major4. En kritisk rolle for vektor insekt immunrespons veier i å kontrollere overføringen av smittsomme patogener har blitt rapportert på samme måte i Aedes aegypti mygg5,6,7, i tsetse fly Glossina morsitans8, og i Anopheles gambiae mygg9,10.
Studier avsandflue/ Leishmania interaksjoner har vært begrenset av mangel på genuttrykk modifikasjonsmetoder tilpasset for bruk i disse insektene. Bare genderegulering ved liten forstyrrende RNA (siRNA) hadde blitt utført11,12,13,14 inntil nylig. Teknikken, begrenset av dødeligheten forbundet med mikroinjeksjon av voksne kvinner, fører bare til et delvis funksjonstap, som ikke kan overføres fra generasjon til generasjon.
CRISPR/Cas9-teknologi har revolusjonert funksjonell genomisk forskning i ikke-modellorganismer som sandfluer. Modifisert fra det adaptive immunforsvaret i prokaryoter for forsvar mot bakteriofager15,16, crispr cas9-systemet har blitt raskt tilpasset som et genomredigeringsverktøy for overlegne eukaryote organismer, inkludert insekter. Prinsippet om CRISPR/Cas9 målrettet genomredigering er basert på komplementariteten til en enkelt guide RNA (sgRNA) til et spesifikt genomisk locus. Cas9-kjernen binder seg til sgRNA og skaper et dobbeltstrenget DNA (dsDNA) brudd i det genomiske DNA-et der sgRNA forbinder med sin komplementære sekvens. Cas9-sgRNA-komplekset styres til målsekvensen med 17 til 20 komplementære baser i sgRNA til det valgte locus, dsDNA-pausen kan deretter repareres av to uavhengige veier: nonhomologous end joining (NHEJ) eller homology-rettet reparasjon (HDR)17. NHEJ reparasjon innebærer en enkel lukking av pausen, men fører ofte til små innsetting / sletting hendelser. DNA-reparasjon gjennom HDR bruker en donor DNA-molekyl som deler homologi med målet DNA som mal for reparasjon. Insekter har begge maskinsaker.
CRISPR/Cas9-teknologi kan generere mutasjoner i et valgt locus, gjennom NHEJ-reparasjonsveien; eller for mer komplekse genomredigeringsstrategier, for eksempel knock-ins eller expression-reportere, gjennom HDR-banen med en passende donormal. I sandfluer ble null mutante alleler av immunresponsfaktoren Relish generert gjennom NHEJ-mediert CRISPR i Phlebotomus papatasi4. Sandflueembryoer ble også injisert i en annen studie med en CRISPR/Cas9-blanding rettet mot genkodingen Yellow. Likevel ble ingen voksne som bærer mutasjonen produsert18. Vi beskriver her en detaljert metode for sandflue målrettet mutagenese av NHEJ-mediert CRISPR / Cas9, med et spesielt fokus på embryomikroinjeksjonen, et kritisk trinn i protokollen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Sandfluer er de naturlige vektorene for Leishmania-arter, protozoanske parasitter som produserer et bredt spekter av symptomer som spenner fra kutane lesjoner til visceral patologi. Dechiffrering av arten av vektor / parasitt interaksjoner er av største betydning for bedre forståelse av Leishmania overføring til sine verter. Blant parametrene som kontrollerer sandfluevektorkompetansen (dvs. deres evne til å bære og overføre patogener), ble parametere iboende for disse insektene vist seg å spille en nøkkelrolle. Insekt immunrespons, for eksempel, påvirker sandfluevektorkompetanse til Leishmania. Studien av slike parametere har vært begrenset av mangelen på metoder for genuttrykksmodifisering tilpasset bruk i disse ikke-modellorganismer. Genderegulering ved liten forstyrrende RNA (siRNA) er mulig, men i tillegg til å være teknisk utfordrende, fører silencingen til bare et delvis tap av funksjon, som ikke kan overføres fra generasjon til generasjon. Målrettet mutagenese av CRISPR/Cas9-teknologi ble nylig tilpasset Phlebotomus papatasi sandflue. Denne teknikken fører til generering av overførbare mutasjoner i et spesielt valgt locus, slik at man kan studere gener av interesse. CRISPR/Cas9-systemet er avhengig av induksjon av målrettede DNA-pauser med dobbel tråd, senere reparert av enten Non-Homologous End Joining (NHEJ) eller av Homology Driven Repair (HDR). NHEJ består av en enkel lukking av pausen og fører ofte til små innsettings-/slettingshendelser. I motsetning bruker HDR tilstedeværelsen av et donor DNA-molekyl som deler homologi med målet DNA som en mal for reparasjon. Her presenterer vi en mikroinjeksjonsmetode for sandflue embryo for målrettet mutagenese av CRISPR/Cas9 ved hjelp av NHEJ, som er den eneste genommodifikasjonsteknikken tilpasset sandfluevektorer til dags dato.

CRISPR/Cas9 mikroinjeksjonsprotokollen som er beskrevet her for å generere sandfluemutanter, ble etablert i en tidligere publikasjon4. Denne tilnærmingen produserte svært effektiv mutagenese, da 11 av 540 individer overlevde prosedyren, hvorav 9 var mutante. Når du designer guider for CRISPR/Cas9-mutasjon, er et kritisk første skritt å sekvensere regionen rundt området som skal målrettes. Malen for sekvensering bør være fra stammen som skal brukes som en kilde til embryoer til injeksjon....

Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Denne protokollen beskriver trinnene i CRISPR/Cas9 målrettet mutagenese i sandfluer: embryosamling, injeksjon, insektoppdrett og identifisering samt utvalg av mutasjoner av interesse.

Sandfly (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjeksjon for CRISPR/Cas9 Mutagenese

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Opprinnelige celletransplantasjon for CRISPR/Cas9-baserte sprang framover i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Fosteret Microinjection og transplantasjon teknikk for Nasonia vitripennis genomet manipulasjon

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generering av definerte genomisk modifikasjoner bruke CRISPR-CAS9 i Human Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Cell Surface Reseptor identifikasjon ved hjelp av genom-skala CRISPR / Cas9 genetiske skjermer

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...