Name: sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Los autores agradecen a Vanessa Meldener-Harrell por la lectura crítica del manuscrito.

El uso de ratones como fuente de sangre para la alimentación de moscas de arena se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Los invertebrados no están cubiertos por las directrices de los NIH.
1. Preparación de la aguja (Figura 1)
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	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi:+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major.">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li><li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection.">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).</li><li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes.">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans.">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites.">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li><li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis.">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li><li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies:+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections.">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li><li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania.">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).</li><li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality.">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering.">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li><li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR/Cas9.">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).</li><li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR/Cas9.">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651 (2020).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control.">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li></ol>

Presentamos aquí un método de microinjección embrionaria recientemente desarrollado para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 en moscas de arena Phlebotomus papatasi. La microinyección embrionaria para la modificación genética de insectos se desarrolló en Drosophila a mediados de la década de 198021 y ahora se utiliza rutinariamente en una amplia variedad de insectos. Se han desarrollado otros métodos para la entrega de materiales de modificación genética para su u...

Las enfermedades transmitidas por vectores son una de las principales amenazas para la salud pública en la evolución constante. Cientos de especies vectoriales repartidas entre familias filogengénicas muy distintas (por ejemplo, mosquitos, garrapatas, pulgas) son responsables de la transmisión de un gran número de patógenos microbianos, lo que resulta en más de 700.000 muertes humanas al año, según la Organización Mundial de la Salud. Entre los insectos vectoriales, las moscas de arena de fenbotomina (Diptera, Psicodidae) constituyen un vasto grupo, con 80 especies vectoriales probadas que exhiben rasgos fenotípicos distintos y capacidades vectoriales que se encuentran en diferentes regiones geográficas. Son vectores para los parásitos protozoicos del género Leishmania,causando alrededor de 1,3 millones de nuevos casos de Leishmaniases y entre 20.000 y 30.000 muertes al año. Los resultados clínicos de leishmaniases son diversos, con síntomas que van desde lesiones cutáneas autolimitantes hasta difusión visceral que es fatal en ausencia de tratamiento.
Las moscas de arena son insectos estrictamente terrestres. Su ciclo de vida, relativamente largo en comparación con otros Diptera, dura hasta tres meses, dependiendo de diferentes parámetros como la temperatura, la humedad y la nutrición. Consta de una etapa embrionaria (6 a 11 días), cuatro etapas larvarias (con una duración total de 23 a 25 días) y una etapa pupal (9 a 10 días) seguida de metamorfosis y luego la edad adulta. Las moscas de la arena requieren un ambiente húmedo y cálido para la cría. Tanto los machos como las hembras se alimentan de azúcares, obtenidos en la naturaleza a partir de néctares de flores. Sólo las hembras son alimentadoras de sangre, ya que requieren proteínas obtenidas de la harina de sangre para la producción de huevos1.
Un enfoque importante de la investigación es identificar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos que conducen al desarrollo de infecciones transmisibles. Al igual que con otros insectos vectoriales, se ha demostrado que los parámetros intrínsecos a las moscas de arena afectan su competencia vectorial, que se define como su capacidad para transportar y transmitir patógenos a sus huéspedes. Por ejemplo, la expresión de galectinas por el Phlebotomus papatasi sand fly midgut cells, actuando como receptores que reconocen componentes de la superficie del parásito, puede influir directamente en su competencia vectorial para Leishmania major2,3. La vía de respuesta inmune de insectos, Inmunodeficiencia (IMD), también es crucial para la competencia vectorial de mosca de arena Phlebotomus papatasi para Leishmania major4. Un papel crítico para las vías de respuesta inmune de insectos vectoriales en el control de su transmisión de patógenos infecciosos se ha notificado de manera similar en los mosquitos Aedes aegypti 5,6,7, en la mosca de la tsetse Glossina morsitans8,y en Anopheles gambiae mosquitos9,10.
Los estudios de las interacciones entre mosca de la arena/Leishmania se han visto limitados por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos insectos. Sólo se había realizado la regulación de la bajada genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA)11,12,13,14 hasta hace poco. La técnica, limitada por la mortalidad asociada con la microinyección de las hembras adultas, conduce sólo a una pérdida parcial de la función, que no puede transmitirse de generación en generación.
La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la investigación genómica funcional en organismos no modelo como las moscas de arena. Modificado desde el sistema inmune adaptativo en prokaryotes para la defensa contra bacteriófagos15,16, el sistema CRISPR Cas9 se ha adaptado rápidamente como una herramienta de edición del genoma para organismos eucariotas superiores, incluyendo insectos. El principio de la edición del genoma objetivo CRISPR/Cas9 se basa en la complementariedad de un ARN guía único (sgRNA) a un locus genómico específico. La nucleasa Cas9 se une al sgRNA y crea una rotura de ADN de doble hebra (dsDNA) en el ADN genómico donde el esgRNA se asocia con su secuencia complementaria. El complejo Cas9-sgRNA se guía a la secuencia de destino por 17 a 20 bases complementarias en el sgRNA al locus elegido, la rotura dsDNA puede ser reparada por dos vías independientes: unión final nohomóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR)17. La reparación de NHEJ implica un cierre simple de la rotura, pero con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción/eliminación. La reparación del ADN a través de HDR utiliza una molécula de ADN de donante que comparte la homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Los insectos poseen ambas máquinas.
La tecnología CRISPR/Cas9 puede generar mutaciones en un locus elegido, a través de la vía de reparación del NHEJ; o para estrategias de edición del genoma más complejas, como knock-ins o reporteros de expresión, a través de la vía HDR con una plantilla de donante adecuada. En moscas de arena, se generaron alelos mutantes nulos del factor de respuesta inmune Sabor a través de CRISPR mediado por NHEJ en Phlebotomus papatasi4. También se inyectaron embriones de mosca de arena en otro estudio con una mezcla CRISPR/Cas9 dirigida al gen que codifica el amarillo. Aún así, no se produjeron adultos portadores de la mutación18. Aquí describimos un método detallado de mosca de arena dirigida mutagénesis por CRISPR/Cas9 mediada por NHEJ, con un enfoque particular en la microinyección embrionaria, un paso crítico del protocolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Las moscas de la arena son los vectores naturales de las especies de Leishmania, parásitos protozoos que producen un amplio espectro de síntomas que van desde lesiones cutáneas hasta patología visceral. Descifrar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos es de importancia primordial para una mejor comprensión de la transmisión de Leishmania a sus huéspedes. Entre los parámetros que controlan la competencia de vectores de mosca de arena (es decir, su capacidad para transportar y transmitir patógenos), se demostró que los parámetros intrínsecos a estos insectos desempeñaban un papel clave. La respuesta inmune de los insectos, por ejemplo, afecta la competencia de vectores de mosca de arena a Leishmania. El estudio de estos parámetros se ha visto limitado por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos organismos no modelo. La regulación genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA) es posible, pero además de ser técnicamente desafiante, el silenciamiento conduce a sólo una pérdida parcial de la función, que no se puede transmitir de generación en generación. La mutagénesis dirigida por la tecnología CRISPR/Cas9 fue recientemente adaptada a la mosca de arena Phlebotomus papatasi. Esta técnica conduce a la generación de mutaciones transmisibles en un locus elegido específicamente, lo que permite estudiar los genes de interés. El sistema CRISPR/Cas9 se basa en la inducción de roturas de ADN de doble hebra dirigidas, posteriormente reparadas por la Unión Final No Homologosa (NHEJ) o por la Reparación Impulsada por Homología (HDR). NHEJ consiste en un cierre simple de la rotura y con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción / eliminación. Por el contrario, HDR utiliza la presencia de una molécula de ADN donante que comparte homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Aquí, presentamos un método de microinyección de embriones de mosca de arena para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 utilizando NHEJ, que es la única técnica de modificación del genoma adaptada a los vectores de mosca de arena hasta la fecha.

El protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 descrito aquí para generar mutantes de mosca de arena se estableció en una publicación anterior4. Este enfoque produjo mutagénesis altamente eficiente, ya que 11 de cada 540 individuos sobrevivieron al procedimiento, de los cuales 9 fueron mutantes. Al diseñar guías para la mutación CRISPR/Cas9, un primer paso crítico es secuenciar la región alrededor del área a la que se va a dirigir. La plantilla para la secuenciación debe ser de la cepa que...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Investigación

Genética

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...