Name: sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Författarna tackar Vanessa Meldener-Harrell för kritisk läsning av manuskriptet.

Användningen av möss som blodkälla för utfodring av sandfluga utfördes i strikt enlighet med rekommendationerna i vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health (NIH). Protokollet godkändes av Animal Care and Use Committee of the NIAID, NIH (protokollnummer LPD 68E). Ryggradslösa djur omfattas inte av NIH:s riktlinjer.
1. Nålpreparat(figur 1)
<ol><li>Dra nålar och fasa enligt beskrivningen i Meuti och Harre...

<ol>
	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi:+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major.">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li><li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection.">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).</li><li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes.">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans.">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites.">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li><li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis.">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li><li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies:+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections.">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li><li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania.">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).</li><li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality.">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering.">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li><li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR/Cas9.">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).</li><li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR/Cas9.">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651 (2020).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control.">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li></ol>

Vi presenterar här en nyligen utvecklad embryo microinjection metod för riktade mutagenesis av CRISPR/Cas9 i Phlebotomus papatasi sandflugor. Embryomikroinjektion för insektsgenetisk modifiering utvecklades i Drosophila i mitten av 1980-talet21 och används nu rutinmässigt i en mängd olika insekter. Andra metoder för leverans av genetiska modifieringsmaterial har utvecklats för användning i insekter, såsom ReMOT20,21,<...

Vektorburna sjukdomar är ett stort folkhälsohot i ständig utveckling. Hundratals vektorarter spridda över mycket distinkta fylogena familjer (t.ex. myggor, fästingar, loppor) är ansvariga för överföringen av ett stort antal mikrobiella patogener, vilket resulterar i mer än 700 000 mänskliga dödsfall per år, enligt Världshälsoorganisationen. Bland vektorinsekter utgör phlebotomine sandflugor (Diptera, Psychodidae) en stor grupp, med 80 beprövade vektorarter som uppvisar distinkta fenotypiska egenskaper och vektorkapacitet som finns i olika geografiska regioner. De är vektorer för protozoiska parasiter av släktet Leishmania, vilket orsakar cirka 1,3 miljoner nya fall av Leishmaniases och mellan 20 000 och 30 000 dödsfall per år. Leishmaniases kliniska resultat är olika, med symtom som sträcker sig från självbegränsande testning skador till visceral spridning som är dödlig i avsaknad av behandling.
Sandflugor är strikt jordiska insekter. Deras livscykel, relativt lång jämfört med andra Diptera, varar upp till tre månader, beroende på olika parametrar som temperatur, fuktighet och näring. Den består av ett embryonalt stadium (6 till 11 dagar), fyra larvsteg (som varar totalt 23 till 25 dagar) och ett pupalstadium (9 till 10 dagar) följt av metamorfos och sedan vuxen ålder. Sandflugor kräver en fuktig och varm miljö för uppfödning. Både män och kvinnor matar på sockerarter, som erhålls i naturen från blomnektar. Endast kvinnor är blodmatare, eftersom de kräver proteiner som erhållits från blodmjölet för äggproduktion1.
Ett viktigt fokus för forskningen är att identifiera arten av vektor/ parasitinteraktioner som leder till utveckling av överförbara infektioner. Liksom med andra vektorinsekter har parametrar som är inneboende i sandflugor visat sig påverka deras vektorkompetens, vilket definieras som deras förmåga att bära och överföra patogener till sina värdar. Till exempel kan uttrycket av galectiner av Phlebotomus papatasi sand flyga midgutceller, som fungerar som receptorer som känner igen parasitytans komponenter, direkt påverka deras vektorkompetens för Leishmania major2,3. Insekt immunsvarsvägen, Immunbrist (IMD), är också avgörande för Phlebotomus papatasi sandfluga vektor kompetens för Leishmania major4. En kritisk roll för vektor insekt immunsvar vägar för att kontrollera deras överföring av infektiös patogener har rapporterats på samma sätt i Aedes aegypti myggor5,6,7, i tsetse flyga Glossina morsitans8, och i Anopheles gambiae myggor9,10.
Studier av sandfluga /Leishmania interaktioner har begränsats av bristen på genuttryck modifieringsmetoder anpassade för användning i dessa insekter. Endast gen downregulation av små störande RNA (siRNA) hade utförts11,12,13,14 tills nyligen. Tekniken, begränsad av dödligheten i samband med mikroinjektion av vuxna kvinnor, leder endast till en partiell funktionsförlust, som inte kan överföras från generation till generation.
CRISPR/Cas9-tekniken har revolutionerat funktionell genomisk forskning i icke-modellorganismer som sandflugor. Modifierad från det adaptiva immunsystemet i prokaryoter för försvar mot bakteriofag15,16, har CRISPR Cas9-systemet snabbt anpassats som ett genomredigeringsverktyg för överlägsna eukaryota organismer, inklusive insekter. Principen om CRISPR/Cas9 riktad genomredigering bygger på komplementariteten hos en enda guide RNA (sgRNA) till en specifik genomisk locus. Cas9-kärnan binder till sgRNA och skapar en dubbelsträngad DNA -brytning (dsDNA) i det genomiska DNA där sgRNA associerar med sin kompletterande sekvens. Cas9-sgRNA-komplexet styrs till målsekvensen med 17 till 20 kompletterande baser i sgRNA till den valda locus, dsDNA-pausen kan sedan repareras av två oberoende vägar: nonhomologous end joining (NHEJ) eller homology-regisserad reparation (HDR)17. NHEJ-reparation innebär en enkel stängning av pausen men leder ofta till små insättnings-/raderingshändelser. DNA-reparation genom HDR använder en donator-DNA-molekyl som delar homologi med mål-DNA som en mall för reparation. Insekter har båda maskinerierna.
CRISPR/Cas9-tekniken kan generera mutationer i en vald locus, genom NHEJ-reparationsvägen; eller för mer komplexa genomredigeringsstrategier, till exempel knock-ins eller expression reportrar, genom HDR-vägen med en lämplig donatormall. I sandflugor genererades null mutant alleler av immunsvarsfaktorn Relish genom NHEJ-medierad CRISPR i Phlebotomus papatasi4. Sandflugaembryon injicerades också i en annan studie med en CRISPR/Cas9-blandning riktad mot genkodningen Gul. Fortfarande producerades inga vuxna som bär mutationen18. Vi beskriver här en detaljerad metod för sandfluga riktad mutagenes av NHEJ-medierad CRISPR/Cas9, med särskilt fokus på embryomikroinjektion, ett kritiskt steg i protokollet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Sandflugor är de naturliga vektorerna för Leishmania-arter, protozoiska parasiter som producerar ett brett spektrum av symtom som sträcker sig från testning skador till visceral patologi. Dechiffrering av vektor/ parasitinteraktioner är av primär betydelse för bättre förståelse av Leishmania-överföring till sina värdar. Bland de parametrar som styr sandflugans vektorkompetens (dvs. deras förmåga att bära och överföra patogener) visades parametrar som är inneboende i dessa insekter spela en nyckelroll. Insekt immunsvar, till exempel, påverkar sandfluga vektor kompetens till Leishmania. Studien av sådana parametrar har begränsats av bristen på metoder för genuttrycksmodifiering anpassad för användning i dessa icke-modellorganismer. Gen downregulation av små störande RNA (siRNA) är möjligt, men förutom att vara tekniskt utmanande, leder tystningen till endast en partiell förlust av funktion, som inte kan överföras från generation till generation. Riktad mutagenes av CRISPR/Cas9-tekniken anpassades nyligen till Phlebotomus papatasi sandfluga. Denna teknik leder till generering av överförbara mutationer i en specifikt vald locus, vilket gör det möjligt att studera de gener av intresse. CRISPR/Cas9-systemet förlitar sig på induktion av riktade DNA-pauser med dubbla strängar, som senare repareras av antingen icke-homolog end joining (NHEJ) eller av Homology Driven Repair (HDR). NHEJ består av en enkel stängning av pausen och leder ofta till små insättnings-/raderingshändelser. Hdr använder däremot närvaron av en donator-DNA-molekyl som delar homologi med mål-DNA som en mall för reparation. Här presenterar vi en mikroinjektionsmetod för sandflugaembryon för riktad mutagenes av CRISPR/Cas9 med NHEJ, som är den enda genommodifieringstekniken som hittills anpassats för sandflygvektorer.

CRISPR/Cas9 mikroinjektion protokoll beskrivs här för att generera sandfluga mutanter fastställdes i en tidigare publikation4. Detta tillvägagångssätt producerade mycket effektiv mutagenes, eftersom 11 av 540 individer överlevde förfarandet, varav 9 var mutanta. När du utformar guider för CRISPR/Cas9-mutation är ett viktigt första steg att sekvensera regionen runt det område som ska riktas. Mallen för sekvensering bör vara från den stam som kommer att användas som en källa till e...

Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Detta protokoll beskriver stegen i CRISPR/Cas9 riktad mutagenes i sandflugor: embryosamling, injektion, insektsuppfödning och identifiering samt urval av mutationer av intresse.

Sandfluga (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection för CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiala könsceller Transplantation för CRISPR/Cas9-baserade bli ledande i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, Ictalurus punctatus, embryon för Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroskop och Transplantation teknik för Nasonia vitripennis genomet Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-medierad exakt gen redigering av Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generering av definierade genomiska modifikationer med CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Cell Surface Receptor Identification Med hjälp av genomskala CRISPR/Cas9 Genetiska skärmar

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...