Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل كل من معهد البحوث الدولية، وجامعة كوت دازور، والوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث من خلال برنامج الاستثمارات من أجل مختبر التميز المستقبلي (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ومبادرة التميز (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). 10- وتحظى الجمعية العامة بدعم المنح المقدمة من جمعية الفرانكوفونية للديابييه، وجمعية فرانسيز دي إيتو دي ريشرش سور لوبيستيه، ومعهد التكنولوجيات المتعددة الكائنات من أجل سانتي، ومؤسسة بنجامين - ديهرت. J.G. معتمد من قبل ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. مدعوم بمنحة ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ومنحة من مؤسسة من أجل Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). كما نشكر مرفق التصوير الأساسي C3M الممول من مجلس إدارة ألب ماريتيم وريجيون باكا، والذي يدعمه أيضا منصة التصوير المجهري والتصوير GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).

ملاحظة: استخدام تقنيات عقيمة لتنفيذ كافة الخطوات من البروتوكول في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلايا تدفق صفح. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الكواشف والمعدات.
1. التمايز من الخلايا الليفية مورين 3T3-L1 في الخلايا الدهنية
<ol><li>تنمو الخلايا الليفية 3T3-L1 في أط...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتمايز وإعادة العدوى بالخلايا الدهنية الناضجة. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لمضادات الميكروبات مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، siRNAs ، محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق ، ومضادات الحمض النووي الريبي الدقيق إلى خلايا 3T3-L1 ...

تعتبر السمنة عامل خطر رئيسي للعديد من أمراض التمثيل الغذائي، بما في ذلك مقاومة الأنسولين (IR)، داء السكري من النوع 2 (T2D)، وأمراض القلب والأوعية الدموية1. وقد فشلت العلاجات الحالية في وقف الانتشار المتزايد باستمرار لهذه الأمراض ، وإدارة الأشعة تحت الحمراء لمرضى السمنة والسكري لا تزال قضية سريرية هامة. الأنسجة الدهنية تلعب دورا حاسما في السيطرة على التوازن الطاقة، وتوسعها المرضي خلال السمنة يساهم في تطوير الأشعة تحت الحمراء و T2D2،3. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. وقد بحثت العديد من الدراسات البحثية دور الحمض النووي الريبي ترميز البروتين في فسيولوجيا الخلايا الدهنية وارتباطها مع السمنة.
وفي الآونة الأخيرة، أدى اكتشاف الرناس غير الترميزي، ولا سيما الرنانات الصغرى، إلى صياغة مفاهيم جديدة تتعلق بآلية تنظيم برامج التعبير الجيني. وقد أظهرت الدراسات أن ncRNAs هي المنظمين المهمين لوظيفة adipocyte، وأن dysregulation بهم يلعب دورا هاما في أمراض التمثيل الغذائي4. وبالتالي ، فإن التلاعب بالبروتينات وnCRAS في الخلايا الدهنية أمر بالغ الأهمية لفك أدوارها في وظيفة الخلايا الدهنية وتأثيرها على الأمراض مثل T2D. ومع ذلك ، فإن التلاعب في التعبير عن البروتينات وnCRAS في الجسم الحي وكذلك في الخلايا الدهنية الأولية لا يزال صعبا للغاية ، ويفضل استخدام نماذج الخلايا الدهنية في المختبر.
مورين 3T3-L1 الخلايا الليفية تفرق بسهولة إلى الخلايا الدهنية ناضجة، وظيفية، واستجابة للأنسولين، والتي هي خط الخلية ذات الخصائص الجيدة المستخدمة لدراسة وظيفة adipocyte (على سبيل المثال، إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، انحلال الدهون وإفراز الدهون)5،6،7،8،9،10. هذه الخصائص تجعل 3T3-L1 adipocytes نموذجا جذابا لتعديل التعبير عن البروتين الترميز وNNC-RNAs لفك دورها في وظيفة الدهون ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة. لسوء الحظ ، في حين أن الخلايا الليفية 3T3-L1 سهلة التحميب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، فإن الخلايا الدهنية 3T3-L1 المتمايزة هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا هو السبب في أن العديد من الدراسات التي تتلاعب بالتعبير الجيني في خلايا 3T3-L1 ركزت على تمايز الخلايا الدهنية بدلا من التركيز على وظيفة الخلايا الدهنية.
لفترة طويلة ، كانت التقنية الفعالة الوحيدة لخلايا الدهون المتحولة هي الكهربورات5، وهي مملة ومكلفة ويمكن أن تسبب تلفا في الخلايا. تشير هذه الورقة إلى تقنية عكس العدوى باستخدام كاشف العدوى الشائع ، مما يقلل من الوقت العملي للإصابة ، وليس له أي تأثير على صلاحية الخلية ، وهو أقل تكلفة بكثير من الإلكتربو. هذا البروتوكول مناسب تماما لإصابة سيرنا وغيرها من أوليغونوكليوتيدات مثل محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد مير) ومكافحة مير. مبدأ بروتوكول عكس العدوى هو احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مجمع في لوحة ثقافة الخلية ومن ثم زرع الخلايا الدهنية الناضجة في الآبار. ثم، إعادة ربط الخلايا الشحمية إلى سطح لوحة ملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات / العدوى. تسمح هذه المنهجية البسيطة والفعالة وغير المكلفة بدراسة دور الحمض النووي الريبي وترميز البروتين وmiRs في وظيفة الخلايا الدهنية ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

تغيير وظيفة adipocyte يساهم في الإمراض من أمراض التمثيل الغذائي بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 ومقاومة الأنسولين. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. تعديل التعبير عن البروتينات والرنانات الدقيقة في الخلايا الدهنية لا يزال تحديا كبيرا. تصف هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الليفية المورينية إلى خلايا شحمية ناضجة وتعديل التعبير عن البروتينات والحمى الريبية الدقيقة في الخلايا الدهنية الناضجة من خلال العدوى العكسية باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير التدخل (siRNA) وتقليد الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد miR) أوليغونوكليوتيدات. يتضمن بروتوكول العدوى العكسي هذا احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مركب في لوحة زراعة الخلية التي تضاف إليها الخلايا الدهنية الناضجة. ثم يسمح للخلايا الشحمية بإعادة ربطها بسطح اللوحة الملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات /ترانسفيكتيون. يمكن إجراء التحليلات الوظيفية مثل دراسة إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، تكوين الدهون ، وانحلال الدهون على الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1 المتحولة لدراسة تأثير التلاعب بالبروتين أو الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة الخلايا الدهنية.

باستخدام إجراء عكس transfection وصفها هنا لتعديل التعبير عن البروتينات أو الحمض النووي الريبي الدقيق في 3T3-L1 adipocytes، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية للحفاظ على مورفولوجيا بهم بعد العدوى(الشكل 1B،C). في الواقع ، بعد يومين من العدوى ، كانت الخلايا الدهنية منتشر?...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

يقدم هنا بروتوكول لتسليم أوليغونوكليوتيدات مثل الحمض النووي الريبي (siRNA) صغير التدخل ، أو محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (miRs) ، أو الحمض النووي الريبي المضاد للميكروبات (anti-miR) في الخلايا الدهنية الناضجة لتعديل البروتين والتعبير عن الحمض النووي الريبي الدقيق.

نموذج ثقافة الخلية Adipocyte لدراسة تأثير البروتين وتعديل الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة Adipocyte

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

هذا البروتوكول يجعل من الممكن للتلاعب البروتينات، أو التعبير ميكرورنا، في الخلايا الدهنية المتمايزة لدراسة دورها في وظيفة الخلايا الدهنية. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لتحويل أوليغونوكليوتيدات إلى خلايا 3T3-L1 الماوس. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الخلايا قبل الديبادية البشرية المتمايزة في الخلايا الدهنية.إثبات الإجراء سيكون ميلاني غاودفرين، فني من مختبرنا. تنمو الخلايا الليفية 3T3-L1 في أطباق 100 ملليمتر في DMEM دون بيروفاتي، 25 ميليمولار الجلوكوز، 10٪ مصل العجل حديثي الولادة، وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين. ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية وسبعة في المئة من ثاني أكسيد الكربون.بعد يومين من التقاء, تغيير المتوسطة الثقافة, استبداله مع DMEM دون بيروفاتي, 25 جلوكوز ملليمولار, 10٪FCS, وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين تكملها 0.25 ملليمولار IBMX, 0.25 ميكرومولار ديكساميثازون, خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر الأنسولين, و 10 rosiglitazone ميكرومولار. احتضان الأطباق لمدة يومين. بعد يومين، استبدل الوسط الثقافي ب DMEM بدون بيروفاتي، و25 ميليمولار جلوكوز، و10٪FCS، وواحد في المئة البنسلين والستربتوميسين المكمل بخمسة ميكروجرامات لكل ملليلتر من الأنسولين و10 ميكرومولار روزيجليتازون واحتضان لمدة يومين آخرين.إطعام الخلايا كل يومين مع DMEM دون بيروفاتي، 25 جلوكوز ملليمولار، 10٪FCS، وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين والحفاظ على الخلايا في الحاضنة. قبل يوم أو بضع ساعات من عملية العدوى، قم بإعداد محلول من نوع الكولاجين الأول بمعدل 100 ميكروغرام لكل ملليلتر في 30٪ إيثانول من محلول مخزون بمعدل ملليلتر واحد لكل ملليلتر. إضافة 250 ميكرولتر من الكولاجين لكل بئر من لوحة 12 بئرا أو 125 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 24 بئرا ونشر الحل على سطح البئر.اترك الطبق بدون الغطاء تحت غطاء الثقافة حتى يجف الكولاجين. ثم غسله مرتين مع برنامج تلفزيوني مد. ماصة siRNA مع تحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية لخلط واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.إضافة كاشف transfection وتحسين الحد الأدنى من الوسط الأساسي إلى siRNA وماصة لخلط. احتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف مزيج العدوى إلى كل بئر من الطبق المغلف بالكولاجين.غسل الخلايا في طبق بيتري 100 ملليمتر مرتين مع D-PBS. إضافة 5x تريبسين إلى الخلايا، مع التأكد من تغطية السطح بأكمله مع تريبسين. انتظر لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية التريبسين.احتضان طبق بيتري لمدة خمس إلى عشر دقائق في 37 درجة مئوية في الحاضنة. ثم اضغط على الطبق لفصل الخلايا، وتجنب تلف الخلايا. إضافة 10 ملليلتر من DMEM دون بيروفاتي, 25 جلوكوز ملليمولار, 10٪FCS, وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين لتحييد تريبسين.ماصة بعناية المتوسط صعودا وهبوطا لفصل الخلايا وتجانس تعليق الخلية. عد الخلايا باستخدام غرفة عد Malassez أو عداد الخلية الآلي وضبط تركيز الخلايا إلى 0.625 مليون خلية لكل ملليلتر من المتوسط. البذور 800 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 12 جيدا أو 400 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 24 جيدا تحتوي على مزيج العدوى.احتضان لوحات في حاضنة ثقافة الخلية وعدم إزعاج لهم لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدال بعناية supernatant مع DMEM الطازجة دون بيروفاتي، 25 جلوكوز ملليمولار، 10٪FCS، وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين والعودة الخلايا إلى الحاضنة. النقاط الزمنية النموذجية للكشف عن ضربة قاضية الهدف بعد تسليم سيرنا أو مير هي 24 إلى 48 ساعة لرنا و 48 إلى 96 ساعة للبروتين.يمكن إجراء التجارب الوظيفية على الخلايا الدهنية المصابة بما في ذلك إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، إفراز أديبوكين ، انحلال الدهون ، وتولد الدهون. وقد ثبت أن الخلايا الدهنية للحفاظ على مورفولوجيا بعد العدوى. بعد يومين من العدوى ، قدمت الخلايا الدهنية قطرات الدهون متعددة الخلايا مع محتوى الدهون لا يختلف بين الخلايا الدهنية المصابة وغير المصابة.لم يتغير تعبير مرنا لعلامات التمايز المختلفة في الخلايا المتحولة مقارنة بالخلايا الدهنية غير المصابة. بروتوكول العدوى العكسية فعال حيث تم تحويل أكثر من 70٪ من الخلايا الدهنية. بعد ثلاثة أيام من العدوى مع سيرنا ضد بيريليبين-1، انخفض مستوى الحمض النووي الريبي من بيريليبين-1 بنسبة 70٪، كما تم تحليل مستوى البروتين بنسبة 63٪ Perilipin-1 التعبير عن طريق المجهر الفلوري بعد أربعة أيام من العدوى وتبين أن انخفض بنسبة 92٪ مقارنة مع تعبيره في الخلايا الدهنية السيطرة.يظهر هنا عكس العدوى من الخلايا الدهنية مع الحمض النووي الريبي الدقيق محاكاة oligonucleotides لتنظيم ما يصل التعبير عن مير-34a. أدى الإفراط في التعبير عن miR-34a إلى انخفاض في التعبير البروتيني VAMP2 بنسبة 50٪ أدت الضربة القاضية ل Perilipin-1 في 3T3-L1 adipocytes إلى زيادة في انحلال الدهون القاعدية في حين أدى الإفراط في التعبير عن miR-34a إلى تثبيط بروتين كيناز B الفوسفورية الناجم عن الأنسولين وإقبال الجلوكوز. من المهم الوصول إلى مستوى عال من التمايز adipocytes لأداء العدوى على الخلايا الدهنية المتمايزة حديثا ورصد بعناية علاج الخلايا الدهنية مع التريبسين.بعد العدوى، فمن الممكن لإجراء تجارب وظيفية على الخلايا الدهنية لدراسة تأثير البروتينات أو التلاعب ميكرورنا على إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، تكوين الدهون، وانحلال الدهون.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

و<em&gt; خارج الحي</em&gt; نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي<em&gt; في المختبر</em&gt; RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...