Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af INSERM, Université Côte d'Azur og det franske nationale forskningsagentur (ANR) gennem programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) og Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. støttes af tilskud fra Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) og Fondation Benjamin-Delessert. J.G. understøttes af ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. støttes af ANR-tilskud ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 og et tilskud fra Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansieret af Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, som også støttes af GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).

BEMÆRK: Brug sterile teknikker til at udføre alle protokollens trin i en laminar flowcellekulturhætte. Se Materialetabel for at få flere oplysninger om alle reagenser og udstyr.
1. Differentiering af murin 3T3-L1 fibroblaster i adipocytter
<ol><li>Dyrk 3T3-L1 fibroblaster i 100 mm retter i kulturmedium-DMEM uden pyruvat, 25 mM glukose, 10% nyfødte kalveserum og 1% penicillin og streptomycin (Figur 1A). Læg opvasken i en vævskulturinkubato...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

Dette papir præsenterer en detaljeret protokol for differentiering og transfection af modne adipocytter. Denne omvendte transfektionsmetode er en enkel, økonomisk og meget effektiv metode til at transfectoligonucleotider som, men ikke begrænset til, siRNAs, mikro-RNA efterligner og anti-mikro-RNA'er i 3T3-L1 adipocytter, som er en af de sværeste cellelinjer at transfect. Denne metode har nogle begrænsninger, der skal overvejes. Denne protokol er ikke effektiv til transfektion med plasmid DNA, hvilket begrænser nytt...

Fedme betragtes som en stor risikofaktor for mange metaboliske sygdomme, herunder insulinresistens (IR), Type 2 Diabetes (T2D) og hjerte-kar-sygdomme1. Nuværende behandlinger har undladt at stoppe den konstant stigende forekomst af disse sygdomme, og håndteringen af IR af overvægtige og diabetiske patienter er fortsat et vigtigt klinisk problem. Fedtvæv spiller en afgørende rolle i kontrollen af energi homøostase, og dens patologiske ekspansion under fedme bidrager til udviklingen af IR og T2D2,3. Dette understreger behovet for bedre at forstå den molekylære mekanisme, der er involveret i adipocyt dysfunktion til at udvikle nye behandlinger mod fedme-relaterede sygdomme. Mange forskningsundersøgelser har undersøgt den rolle, protein-kodning RNA'er i adipocyt fysiologi og deres tilknytning til fedme.
For nylig har opdagelsen af ikke-kodende RNA'er (ncRNAs), især mikro-RNA'er (miR'er), smedet nye begreber relateret til mekanismen for regulering af genekspressionsprogrammer. Undersøgelser har vist, at nc RNA'er er vigtige regulatorer af adipocyt funktion, og at deres dysregulering spiller en vigtig rolle i metaboliske sygdomme4. Således manipulation af proteiner og ncRNAs i adipocytter er afgørende for at dechifrere deres roller i adipocyt funktion og deres indvirkning på patologier såsom T2D. Men, manipulere udtrykket af proteiner og ncRNAs in vivo samt i primære adipocytter er fortsat meget udfordrende, favorisere brugen af in vitro adipocyt modeller.
Murine 3T3-L1 fibroblaster skelner let til modne, funktionelle og insulin-responsive adipocytter, som er en velkarakteriseret cellelinje, der bruges til at studere adipocytfunktion (f.eks. insulinsignalering, glukoseoptagelse, lipolyse og adipokiner sekretion)5,6,7,8,9,10. Disse egenskaber gør 3T3-L1 adipocytter til en attraktiv model til at modulere ekspressionen af proteinkodning og nc-RNA'er for at dechifrere deres rolle i adipocytfunktion og deres potentielle rolle i fedmerelaterede sygdomme. Desværre, mens 3T3-L1 fibroblaster er nemme at transfect ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser, differentierede 3T3-L1 adipocytter er en af de sværeste cellelinjer at transfekte. Dette er grunden til talrige undersøgelser manipulere genekspression i 3T3-L1 celler har fokuseret på adipocyt differentiering snarere end på adipocyt funktion.
I lang tid var den eneste effektive teknik til at transfect adipocytter elektroporation5, hvilket er kedeligt, dyrt og kan forårsage celleskader. Dette papir rapporterer en omvendt transfection teknik ved hjælp af en fælles transfection reagens, som reducerer hands-on tid til transfection, har ingen effekt på celle levedygtighed, og er langt billigere end elektroporation. Denne protokol er perfekt egnet til transfektion af siRNA og andre oligonukleotider såsom mikro-RNA efterligner (miR efterligner) og anti-miRs. Princippet i reverse-transfection protokollen er at inkubere transfection reagens og oligonuleotider til at danne et kompleks i cellen kultur plade og derefter så de modne adipocytter i brønde. Derefter fastgøres adipocytterne til den klæbende pladeoverflade i nærværelse af oligonucleotider / transfection reagenskompleks. Denne enkle, effektive og billige metode gør det muligt at studere den rolle, som proteinkodnings-RNA'er og miR'er spiller i adipocytfunktionen og deres potentielle rolle i fedmerelaterede sygdomme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

Ændring af adipocytfunktion bidrager til patogenesen af metaboliske sygdomme, herunder type 2-diabetes og insulinresistens. Dette understreger behovet for bedre at forstå den molekylære mekanisme, der er involveret i adipocyt dysfunktion til at udvikle nye behandlinger mod fedme-relaterede sygdomme. Det er fortsat meget udfordrende at modulere ekspressionen af proteiner og mikro-RNA'er i adipocytter. Dette papir beskriver en protokol til at differentiere murin fibroblaster i modne adipocytter og til at modulere udtrykket af proteiner og mikro-RNA efterligne (miR efterligne) oligonukleotider. Denne omvendte transfection protokol indebærer inkubation af transfection reagens og oligonukleotider til at danne et kompleks i cellen kultur plade, som de modne adipocytter tilsættes. Adipocytterne får derefter lov til at fastgøres til den klæbende pladeoverflade i nærværelse af oligonucleotider /transfection reagenskomplekset. Funktionelle analyser såsom studiet af insulinsignalering, glukoseoptagelse, lipogenese og lipolyse kan udføres på de transfected 3T3-L1 modne adipocytter for at studere virkningen af protein- eller mikro-RNA-manipulation på adipocytfunktionen.

Ved hjælp af den procedure for omvendt transfektion, der er beskrevet her for at modulere ekspressionen af proteiner eller mikro-RNA'er i 3T3-L1 adipocytter, har adipocytterne vist sig at bevare deres morfologi efter transfection (Figur 1B, C). Faktisk var adipocytterne 2 dage efter transfectionen godt spredt og fastgjort til pladen og præsenterede flerlokulære lipiddråber, der er karakteristiske for modne 3T3-L1 adipocytter. Lipidindhold...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Præsenteret her er en protokol til at levere oligonukleotider såsom små-interfererende RNA (siRNA), mikro-RNA efterligner (miRs), eller anti-mikro-RNA (anti-miR) i modne adipocytter til at modulere protein og mikro-RNA udtryk.

En adipocytcellekulturmodel til undersøgelse af protein- og mikro-RNA-gradueringens indvirkning på adipocytfunktionen

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Denne protokol gør det muligt at manipulere proteiner, eller microRNA udtryk, i differentierede adipocytter til at studere deres rolle i adipocytter funktion. Denne omvendte transfektionsmetode er en enkel, økonomisk og meget effektiv metode til at transfectoligonucleotider i mus 3T3-L1 adipocytter. Denne metode kan også anvendes på humane præadipocytter differentieret i adipocytter.Det vil være Melanie Gaudfrin, en tekniker fra vores laboratorium. Dyrk 3T3-L1 fibroblaster i 100 millimeter retter i DMEM uden pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% nyfødte kalveserum og en procent penicillin og streptomycin. Placer opvasken i en vævskultur inkubator på 37 grader Celsius og syv procent kuldioxid.To dage efter sammenløbet, ændre kultur medium, erstatte det med DMEM uden pyruvat, 25 millimeter glukose, 10% FCS, og en procent penicillin og streptomycin suppleret med 0,25 millimeter IBMX, 0,25 mikromolar dexamethason, fem mikrogram per millimeter insulin, og 10 mikromolar rosiglitazone. Inkuber opvasken i to dage. To dage senere erstatte kulturmediet med DMEM uden pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS, og en procent penicillin og streptomycin suppleret med fem mikrogram per milliliter insulin og 10 mikromolar rosiglitazone og inkubere i yderligere to dage.Foder cellerne hver anden dag med DMEM uden pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS, og en procent penicillin og streptomycin og holde cellerne i inkubatoren. En dag eller et par timer før transfection, forberede en opløsning af kollagen type I på 100 mikrogram per milliliter i 30% ethanol fra en bestand løsning på et milligram per milliliter. Tilsæt 250 mikroliter kollagen pr. brønd af en 12-brønds plade eller 125 mikroliter pr. brønd af en 24-brønds plade og spred opløsningen over brøndens overflade.Lad pladen stå uden låget under kulturhætten, indtil kollagen tørrer. Vask det derefter to gange med D-PBS. Pipette siRNA med forbedret minimum væsentlige medium til at blande og inkubere i fem minutter ved stuetemperatur.Tilsæt transfection reagens og den forbedrede minimal væsentlige medium til siRNA og pipette at blande. Inkuber det i 20 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilføje transfection mix til hver brønd af kollagen-belagt plade.Vask cellerne i 100 millimeter Petriskål to gange med D-PBS. Tilsæt 5x trypsin til cellerne, og sørg for at dække hele overfladen med trypsin. Vent i 30 sekunder og fjern forsigtigt trypsinen.Inkuber petriskålen i fem til 10 minutter ved 37 grader Celsius i inkubatoren. Tryk derefter på fadet for at løsne cellerne og undgå celleskader. Tilsæt 10 milliliter DMEM uden pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS, og en procent penicillin og streptomycin at neutralisere trypsin.Rør forsigtigt mediet op og ned for at løsne cellerne og homogenisere celleaffjedringen. Tæl cellerne ved hjælp af et Malassez tællekammer eller en automatiseret celletæller og juster koncentrationen af cellerne til 0,625 millioner celler pr. milliliter medium. Frø 800 mikroliter af celle suspension per brønd af en 12-brønds plade eller 400 mikroliter af celle suspension per brønd af en 24-brønd plade, der indeholder transfection mix.Inkuber pladerne i en cellekulturinkubator og forstyr dem ikke i 24 timer. På den næste dag skal supernatanten omhyggeligt udskiftes med frisk DMEM uden pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS og en procent penicillin og streptomycin og returnere cellerne til inkubatoren. Typiske tidspunkter for detektering af mål knockdown efter siRNA eller miR levering er 24 til 48 timer for mRNA og 48 til 96 timer for protein.Funktionelle eksperimenter kan udføres på transfected adipocytter, herunder insulin signalering, glukose optagelse, adipokin sekretion, lipolyse, og lipogenese. Adipocytterne har vist sig at bevare deres morfologi efter transfection. To dage efter transfection præsenterede adipocytterne multilokulære lipiddråber med lipidindhold, der ikke var forskelligt mellem de transfected og ikke-transfected adipocytter.mRNA-udtrykket for forskellige differentieringsmarkører var uændret i transfected celler sammenlignet med det i ikke-transfected adipocytter. Protokollen om omvendt transinfektion er effektiv, da mere end 70 % af adipocytterne blev overført. Tre dage efter transfektionen med siRNA mod Perilipin-1 var mRNA-niveauet af Perilipin-1 faldet med 70%, og proteinniveauet med 63% Perilipin-1-ekspressionen blev også analyseret ved fluorescensmikroskopi fire dage efter transfektionen og viste sig at være faldet med 92% sammenlignet med dets udtryk i kontrolapokacytter.Omvendt transfektion af adipocytter med microRNA efterligner oligonukleotider til up-regulere udtrykket af miR-34a er vist her. Overudtrykket af miR-34a førte til faldet i VAMP2 proteinudtryk med 50%Knockdown af Perilipin-1 i 3T3-L1 adipocytter førte til en stigning i basal lipolyse, mens overudtrykket af miR-34a førte til hæmning af insulininduceret proteinkinase B fosforylering og glukoseoptagelse. Det er vigtigt at nå et højt niveau af adipocytter differentiering til at udføre transfection på nyligt differentierede adipocytter og til nøje at overvåge behandlingen af adipocytter med trypsin.Efter transfection er det muligt at udføre funktionelle eksperimenter på adipocytterne for at studere virkningen af proteiner eller microRNA-manipulation på insulinsignalering, glukoseoptagelse, lipogenese og lipolyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

En protokol til identifikation af protein-protein interaktioner Udfra<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk mærkning Immunoprecipitation, Kvantitativ massespektrometri og Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gær Protein ekstraktion og oprensning for Studiet af Function, Interactions og post-translationelle modifikationer

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur System til Studieinformationen Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Påvisning af RNA-bindende proteiner ved<em&gt; In vitro</em&gt; RNA Pull-down i fedtcellerne Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...