Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door INSERM, de Université Côte d'Azur en het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via het programma Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) en Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. wordt ondersteund door subsidies van de Société Francophone du Diabète (SFD), de Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), het Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) en de Fondation Benjamin-Delessert. J.G. wordt ondersteund door ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. wordt ondersteund door ANR-subsidie ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 en een subsidie van de Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M, gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, die ook wordt ondersteund door het GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).

OPMERKING: Gebruik steriele technieken om alle stappen van het protocol uit te voeren in een laminaire flowcelkweekkap. Zie tabel met materialen voor meer informatie over alle reagentia en apparatuur.
1. Differentiatie van murine 3T3-L1 fibroblasten in adipocyten
<ol><li>Kweek de 3T3-L1 fibroblasten in 100 mm schotels in kweek medium-DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% pasgeboren kalfsserum en 1% penicilline en streptomycine(Figuur 1A). Pla...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de differentiatie en transfectie van volwassen adipocyten. Deze omgekeerde transfectiemethode is een eenvoudige, economische en zeer efficiënte methode om oligonucleotiden zoals, maar niet beperkt tot, siRNA's, micro-RNA-nabootsingen en anti-micro-RNA's te transfecteren in 3T3-L1-adipocyten, wat een van de moeilijkste cellijnen is om te transfecteren. Deze methode heeft enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Dit protocol is niet efficiënt voor t...

Obesitas wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor tal van stofwisselingsziekten, waaronder insulineresistentie (IR), diabetes type 2 (T2D) en hart- en vaatziekten1. De huidige therapieën zijn er niet in geslaagd om de voortdurend stijgende prevalentie van deze ziekten te stoppen, en het beheer van de IR van obese en diabetische patiënten blijft een belangrijk klinisch probleem. Vetweefsel speelt een cruciale rol bij de controle van energiehomeostase en de pathologische expansie tijdens obesitas draagt bij aan de ontwikkeling van IR en T2D2,3. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Veel onderzoeken hebben de rol van eiwitcoderende RNA's in de adipocytenfysiologie en hun associatie met obesitas onderzocht.
Meer recent heeft de ontdekking van niet-coderende RNA's (ncRNA's), met name micro-RNA's (miRs), nieuwe concepten gesmeed met betrekking tot het mechanisme van de regulatie van genexpressieprogramma's. Studies hebben aangetoond dat ncRNA's belangrijke regulatoren zijn van de adipocytenfunctie en dat hun ontregeling een belangrijke rol speelt bij stofwisselingsziekten4. De manipulatie van eiwitten en ncRNA's in adipocyten is dus cruciaal om hun rol in de adipocytenfunctie en hun impact op pathologieën zoals T2D te ontcijferen. Het manipuleren van de expressie van eiwitten en ncRNA's in vivo en in primaire adipocyten blijft echter zeer uitdagend, wat het gebruik van in vitro adipocytenmodellen bevordert.
Murine 3T3-L1 fibroblasten differentiëren gemakkelijk in volwassen, functionele en insuline-responsieve adipocyten, die een goed gekarakteriseerde cellijn zijn die wordt gebruikt om de adipocytenfunctie te bestuderen (bijv. Insulinesignalering, glucoseopname, lipolyse en adipokines-secretie)5,6,7,8,9,10. Deze eigenschappen maken 3T3-L1-adipocyten een aantrekkelijk model om de expressie van eiwitcoderende en nc-RNA's te moduleren om hun rol in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te ontcijferen. Helaas, terwijl 3T3-L1 fibroblasten gemakkelijk te transfecteren zijn met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia, zijn gedifferentieerde 3T3-L1-adipocyten een van de moeilijkste cellijnen om te transfecteren. Dit is de reden waarom talrijke studies die genexpressie in 3T3-L1-cellen manipuleren, zich hebben gericht op adipocytendifferentiatie in plaats van op de adipocytenfunctie.
Lange tijd was de enige efficiënte techniek om adipocyten te transfecteren elektroporatie5, wat vervelend en duur is en celschade kan veroorzaken. Dit artikel rapporteert een omgekeerde transfectietechniek met behulp van een gemeenschappelijk transfectiereagens, dat de hands-on tijd voor transfectie vermindert, geen effect heeft op de levensvatbaarheid van cellen en veel goedkoper is dan elektroporatie. Dit protocol is perfect geschikt voor de transfectie van siRNA en andere oligonucleotiden zoals micro-RNA-mimics (miR-mimics) en anti-miRs. Het principe van het reverse-transfectieprotocol is om het transfectiereagens en de oligonucleotiden te incuberen om een complex in de celkweekplaat te vormen en vervolgens de volwassen adipocyten in de putten te zaaien. Vervolgens hechten de adipocyten zich opnieuw aan het aanhangen van het plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden / transfectiereagenscomplex. Deze eenvoudige, efficiënte en goedkope methodologie maakt het mogelijk om de rol van eiwitcoderende RNA's en miRs in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te bestuderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

Verandering van de adipocytenfunctie draagt bij aan de pathogenese van metabole ziekten, waaronder diabetes type 2 en insulineresistentie. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Het moduleren van de expressie van eiwitten en micro-RNA's in adipocyten blijft zeer uitdagend. Dit artikel beschrijft een protocol om murine fibroblasten te differentiëren in volwassen adipocyten en om de expressie van eiwitten en micro-RNA's in volwassen adipocyten te moduleren door middel van omgekeerde transfectie met behulp van klein-interfererend RNA (siRNA) en micro-RNA nabootsen (miR mimic) oligonucleotiden. Dit omgekeerde transfectieprotocol omvat de incubatie van het transfectiereagens en de oligonucleotiden om een complex te vormen in de celkweekplaat waaraan de volwassen adipocyten worden toegevoegd. De adipocyten mogen zich vervolgens opnieuw hechten aan het aanhangen van plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden /transfectiereagenscomplex. Functionele analyses zoals de studie van insulinesignalering, glucoseopname, lipogenese en lipolyse kunnen worden uitgevoerd op de getransfecteerde 3T3-L1 volwassen adipocyten om de impact van eiwit- of micro-RNA-manipulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen.

Met behulp van de hier beschreven procedure van omgekeerde transfectie om de expressie van eiwitten of micro-RNA's in 3T3-L1-adipocyten te moduleren, is aangetoond dat de adipocyten hun morfologie behouden na de transfectie (Figuur 1B,C). Inderdaad, 2 dagen na de transfectie waren de adipocyten goed verspreid en bevestigd aan de plaat en presenteerden multiloculaire lipidedruppels die kenmerkend zijn voor volwassen 3T3-L1-adipocyten. Het lipi...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Dit protocol maakt het mogelijk om eiwitten, of microRNA-expressie, in gedifferentieerde adipocyten te manipuleren om hun rol in de adipocytenfunctie te bestuderen. Deze omgekeerde transfectiemethode is een eenvoudige, economische en zeer efficiënte methode om oligonucleotiden te transfecteren in muizen 3T3-L1-adipocyten. Deze methode kan ook worden toegepast op menselijke preadipocyten die zijn gedifferentieerd in adipocyten.Melanie Gaudfrin, een technicus van ons laboratorium, demonstreert de procedure. Kweek de 3T3-L1 fibroblasten in 100 millimeter schotels in DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% pasgeboren kalfsserum en één procent penicilline en streptomycine. Plaats de gerechten in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius en zeven procent koolstofdioxide.Verander twee dagen na de samenvloeiing het kweekmedium en vervang het door DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine aangevuld met 0,25 millimolaire IBMX, 0,25 micromolaire dexamethason, vijf microgram per milliliter insuline en 10 micromolaire rosiglitazon. Incubeer de gerechten gedurende twee dagen. Vervang twee dagen later het kweekmedium door DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolar glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine aangevuld met vijf microgram per milliliter insuline en 10 micromolaire rosiglitazon en incubateer nog twee dagen.Voed de cellen om de twee dagen met DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine en houd de cellen in de couveuse. Bereid een dag of een paar uur voor de transfectie een oplossing van collageen type I bij 100 microgram per milliliter in 30% ethanol uit een voorraadoplossing van één milligram per milliliter. Voeg 250 microliter collageen toe per put van een 12-well plaat of 125 microliter per put van een 24-well plaat en verdeel de oplossing over het oppervlak van de put.Laat de plaat zonder deksel onder de kweekkap totdat het collageen droogt. Was het vervolgens twee keer met D-PBS. Pipetteer het siRNA met een verbeterd minimaal essentieel medium om te mengen en incubateer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg het transfectiereagens en het verbeterde minimale essentiële medium toe aan het siRNA en pipet om te mengen. Incubeer het gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens het transfectiemengsel toe aan elke put van de met collageen bedekte plaat.Was de cellen in de 100 millimeter petrischaal twee keer met D-PBS. Voeg 5x trypsine toe aan de cellen en zorg ervoor dat je het hele oppervlak bedekt met de trypsine. Wacht 30 seconden en verwijder voorzichtig de trypsine.Incubeer de petrischaal vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius in de couveuse. Tik vervolgens op de schaal om de cellen los te maken, waardoor celbeschadiging wordt voorkomen. Voeg 10 milliliter DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolaire glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine toe om de trypsine te neutraliseren.Pipetteer het medium voorzichtig op en neer om de cellen los te maken en de celsuspensie te homogeniseren. Tel de cellen met behulp van een Malassez-telkamer of een geautomatiseerde celteller en pas de concentratie van de cellen aan tot 0,625 miljoen cellen per milliliter medium. Zaad 800 microliter van de celsuspensie per put van een 12-well plaat of 400 microliter van de celsuspensie per put van een 24-well plaat met het transfectiemengsel.Incubeer de platen in een celkweekincubator en verstoor ze gedurende 24 uur niet. Vervang de volgende dag voorzichtig het supernatant door verse DMEM zonder pyruvaat, 25 millimolar glucose, 10% FCS en één procent penicilline en streptomycine en breng de cellen terug naar de incubator. Typische tijdstippen voor het detecteren van doel knockdown na siRNA- of miR-afgifte zijn 24 tot 48 uur voor mRNA en 48 tot 96 uur voor eiwit.Functionele experimenten kunnen worden uitgevoerd op getransfecteerde adipocyten, waaronder insulinesignalering, glucoseopname, adipokine-secretie, lipolyse en lipogenese. Van de adipocyten is aangetoond dat ze hun morfologie behouden na de transfectie. Twee dagen na transfectie presenteerden de adipocyten multiloculaire lipidedruppeltjes met een lipidengehalte dat niet verschilde tussen de getransfecteerde en niet-getransfecteerde adipocyten.De mRNA-expressie van verschillende differentiatiemarkers was onveranderd in getransfecteerde cellen in vergelijking met die in niet-getransfecteerde adipocyten. Het omgekeerde transfectieprotocol is efficiënt omdat meer dan 70% van de adipocyten getransfecteerd was. Drie dagen na de transfectie met siRNA tegen Perilipin-1 was het mRNA-niveau van Perilipin-1 met 70% afgenomen en het eiwitniveau met 63% Perilipin-1-expressie werd vier dagen na de transfectie ook geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie en bleek met 92% te zijn afgenomen in vergelijking met de expressie in controleadipocyten.De omgekeerde transfectie van adipocyten met microRNA dat oligonucleotiden nabootst om de expressie van miR-34a te upreguleren, wordt hier getoond. De overexpressie van miR-34a leidde tot de afname van VAMP2-eiwitexpressie met 50%De knockdown van Perilipin-1 in 3T3-L1-adipocyten leidde tot een toename van basale lipolyse, terwijl de overexpressie van miR-34a leidde tot de remming van insuline-geïnduceerde eiwitkinase B-fosforylering en glucoseopname. Het is belangrijk om een hoog niveau van adipocytendifferentiatie te bereiken om de transfectie op nieuw gedifferentieerde adipocyten uit te voeren en om de behandeling van adipocyten met trypsine zorgvuldig te controleren.Na de transfectie is het mogelijk om functionele experimenten uit te voeren op de adipocyten om de impact van eiwitten of microRNA-manipulatie op insulinesignalering, glucoseopname, lipogenese en lipolyse te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Met behulp van de optokinetische reactie op de visuele functie van de zebravis studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Een In Vitro Model voor het bestuderen van het Effect van Fotodynamische therapie 5-Aminolevulinic Zuur-gemedieerde op Staphylococcus aureus Biofilm