Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par l’INSERM, l’Université Côte d’Azur et l’Agence nationale de la recherche (ANR) Français à travers les programmes Investissements pour le futur Laboratoire d’Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) et Initiative d’Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. est soutenu par des subventions de la Société Francophone du Diabète (SFD), de l’Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), de l’Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) et de la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. est pris en charge par ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. est soutenu par la bourse ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 et une subvention de la Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Nous remercions également le Centre Central d’Imagerie du C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, qui est également soutenu par la Plateforme de Microscopie et d’Imagerie GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).

REMARQUE: Utilisez des techniques stériles pour effectuer toutes les étapes du protocole dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et l’équipement.
1. Différenciation des fibroblastes murins 3T3-L1 en adipocytes
<ol><li>Cultiver les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 mm en milieu de culture DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pé...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

Cet article présente un protocole détaillé pour la différenciation et la transfection des adipocytes matures. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides tels que, mais sans s’y limiter, les siRNA, les imitations de micro-ARN et les anti-micro-ARN en adipocytes 3T3-L1, qui est l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. Cette méthode présente certaines limites qui doivent être prises en compte. Ce pr...

L’obésité est considérée comme un facteur de risque majeur pour de nombreuses maladies métaboliques, y compris la résistance à l’insuline (RI), le diabète de type 2 (DT2) et les maladiescardiovasculaires 1. Les thérapies actuelles n’ont pas réussi à arrêter la prévalence sans cesse croissante de ces maladies, et la prise en charge de l’IR des patients obèses et diabétiques reste un problème clinique important. Le tissu adipeux joue un rôle crucial dans le contrôle de l’homéostasie énergétique, et son expansion pathologique pendant l’obésité contribue au développement de l’IR et du DT2D2,3. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. De nombreuses études ont étudié le rôle des ARN codant pour les protéines dans la physiologie des adipocytes et leur association avec l’obésité.
Plus récemment, la découverte d’ARN non codants (ARNnc), en particulier de micro-ARN (miR), a forgé de nouveaux concepts liés au mécanisme de régulation des programmes d’expression génique. Des études ont montré que les ARNnc sont d’importants régulateurs de la fonction adipocytaire, et que leur dérèglement joue un rôle important dans les maladies métaboliques4. Ainsi, la manipulation des protéines et des ARNnc dans les adipocytes est cruciale pour déchiffrer leurs rôles dans la fonction adipocytaire et leur impact sur des pathologies telles que le DT2. Cependant, la manipulation de l’expression des protéines et des ARNnc in vivo ainsi que dans les adipocytes primaires reste très difficile, favorisant l’utilisation de modèles adipocytaires in vitro.
Les fibroblastes murins 3T3-L1 se différencient facilement en adipocytes matures, fonctionnels et sensibles à l’insuline, qui sont une lignée cellulaire bien caractérisée utilisée pour étudier la fonction adipocytaire (par exemple, la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipolyse et la sécrétion d’adipokines)5,6,7,8,9,10. Ces propriétés font des adipocytes 3T3-L1 un modèle attrayant pour moduler l’expression des protéines codant et des ARN nc afin de déchiffrer leur rôle dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité. Malheureusement, alors que les fibroblastes 3T3-L1 sont faciles à transfecter à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce, les adipocytes 3T3-L1 différenciés sont l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. C’est pourquoi de nombreuses études manipulant l’expression des gènes dans les cellules 3T3-L1 se sont concentrées sur la différenciation des adipocytaires plutôt que sur la fonction adipocytaire.
Pendant longtemps, la seule technique efficace pour transfecter les adipocytes était l’électroporation5, qui est fastidieuse, coûteuse et peut causer des dommages cellulaires. Cet article rapporte une technique de transfection inverse utilisant un réactif de transfection commun, qui réduit le temps de transfection pratique, n’a aucun effet sur la viabilité cellulaire et est beaucoup moins coûteuse que l’électroporation. Ce protocole est parfaitement adapté à la transfection de siRNA et d’autres oligonucléotides tels que les mimiques de micro-ARN (miR mimics) et les anti-miR. Le principe du protocole de transfection inverse est d’incuber le réactif de transfection et les oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire, puis d’ensemencer les adipocytes matures dans les puits. Ensuite, les adipocytes se rattachent à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Cette méthodologie simple, efficace et peu coûteuse permet d’étudier le rôle des ARN et des miR codant pour les protéines dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

L’altération de la fonction adipocytaire contribue à la pathogenèse des maladies métaboliques, y compris le diabète de type 2 et la résistance à l’insuline. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. La modulation de l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes reste très difficile. Cet article décrit un protocole pour différencier les fibroblastes murins en adipocytes matures et pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes matures par transfection inverse en utilisant des oligonucléotides imitant l’ARN (siRNA) et le micro-ARN (miR mimic). Ce protocole de transfection inverse implique l’incubation du réactif de transfection et des oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire à laquelle les adipocytes matures sont ajoutés. Les adipocytes sont ensuite autorisés à se rattenir à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Des analyses fonctionnelles telles que l’étude de la signalisation de l’insuline, de l’absorption du glucose, de la lipogenèse et de la lipolyse peuvent être effectuées sur les adipocytes matures 3T3-L1 transfectés pour étudier l’impact de la manipulation des protéines ou des micro-ARN sur la fonction adipocytaire.

En utilisant la procédure de transfection inverse décrite ici pour moduler l’expression de protéines ou de micro-ARN dans les adipocytes 3T3-L1, il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection (Figure 1B,C). En effet, 2 jours après la transfection, les adipocytes étaient bien étalés et attachés à la plaque et présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires qui sont une caracté...

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An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Présenté ici est un protocole pour délivrer des oligonucléotides tels que l’ARN interférent petit (siRNA), les imitations de micro-ARN (miRs) ou les anti-micro-ARN (anti-miR) dans les adipocytes matures pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN.

Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Ce protocole permet de manipuler des protéines, ou expression de microARN, dans des adipocytes différenciés pour étudier leur rôle dans la fonction des adipocytes. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides dans des adipocytes 3T3-L1 de souris. Cette méthode peut également être appliquée aux préadipocytes humains différenciés en adipocytes.La démonstration de la procédure sera faite par Melanie Gaudfrin, une technicienne de notre laboratoire. Cultivez les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 millimètres dans le DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et un pour cent de pénicilline et de streptomycine. Placez les plats dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et sept pour cent de dioxyde de carbone.Deux jours après la confluence, changez le milieu de culture, en le remplaçant par du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% fcS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine complétés par 0,25 millimolaire IBMX, 0,25 micromolaire dexaméthasone, cinq microgrammes par millilitre d’insuline et 10 rosiglitazone micromolaires. Incuber les plats pendant deux jours. Deux jours plus tard, remplacez le milieu de culture par du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine complétés par cinq microgrammes par millilitre d’insuline et 10 rosiglitazone micromolaires et incuber pendant deux autres jours.Nourrissez les cellules tous les deux jours avec du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine et gardez les cellules dans l’incubateur. Un jour ou quelques heures avant la transfection, préparer une solution de collagène de type I à 100 microgrammes par millilitre dans de l’éthanol à 30% à partir d’une solution type à un milligramme par millilitre. Ajouter 250 microlitres de collagène par puits d’une plaque de 12 puits ou 125 microlitres par puits d’une plaque de 24 puits et étaler la solution sur la surface du puits.Laissez la plaque sans couvercle sous la hotte de culture jusqu’à ce que le collagène sèche. Ensuite, lavez-le deux fois avec D-PBS. Pipettez le siRNA avec un milieu essentiel minimum amélioré pour mélanger et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNi et à la pipette à mélanger. Incubé pendant 20 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite le mélange de transfection à chaque puits de la plaque recouverte de collagène.Lavez les cellules dans la boîte de Petri de 100 millimètres deux fois avec D-PBS. Ajoutez 5x trypsine aux cellules, en vous assurant de couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 secondes et retirez soigneusement la trypsine.Incuber la boîte de Petri pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur. Ensuite, tapotez le plat pour détacher les cellules, en évitant les dommages cellulaires. Ajouter 10 millilitres de DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS, et un pour cent de pénicilline et de streptomycine pour neutraliser la trypsine.Pipettez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur cellulaire automatisé et ajustez la concentration des cellules à 0,625 million de cellules par millilitre de milieu. Ensemencez 800 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 12 puits ou 400 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 24 puits contenant le mélange de transfection.Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire et ne pas les déranger pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% fcS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine et retournez les cellules à l’incubateur. Les points de temps typiques pour détecter l’argnement de la cible après l’administration de siRNA ou de miR sont de 24 à 48 heures pour l’ARNm et de 48 à 96 heures pour les protéines.Des expériences fonctionnelles peuvent être effectuées sur des adipocytes transfectés, y compris la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la sécrétion d’adipokine, la lipolyse et la lipogenèse. Il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection. Deux jours après la transfection, les adipocytes présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires dont la teneur en lipides n’était pas différente entre les adipocytes transfectés et non transfectés.L’expression de l’ARNm de divers marqueurs de différenciation était inchangée dans les cellules transfectées par rapport à celle des adipocytes non transfectés. Le protocole de transfection inverse est efficace car plus de 70% des adipocytes ont été transfectés. Trois jours après la transfection avec siRNA contre La périlipine-1, le niveau d’ARNm de perilipine-1 avait diminué de 70% et le niveau de protéine de 63% L’expression de perilipine-1 a également été analysée par microscopie à fluorescence quatre jours après la transfection et s’est avérée avoir diminué de 92% par rapport à son expression dans les adipocytes témoins.La transfection inverse des adipocytes avec des microARN imitant les oligonucléotides pour réguler à la hausse l’expression de miR-34a est montrée ici. La sur-expression de miR-34a a conduit à la diminution de l’expression de la protéine VAMP2 de 50% L’élimination de la périlipine-1 dans les adipocytes 3T3-L1 a entraîné une augmentation de la lipolyse basale tandis que la sur-expression de miR-34a a conduit à l’inhibition de la phosphorylation de la protéine kinase B induite par l’insuline et de l’absorption du glucose. Il est important d’atteindre un niveau élevé de différenciation des adipocytes pour effectuer la transfection sur les adipocytes nouvellement différenciés et de surveiller attentivement le traitement des adipocytes avec de la trypsine.Après la transfection, il est possible d’effectuer des expériences fonctionnelles sur les adipocytes pour étudier l’impact des protéines ou de la manipulation des microARN sur la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipogenèse et la lipolyse.

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Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

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La détection des protéines liant l&#39;ARN par<em&gt; In vitro</em&gt; ARN Pull-down en adipocytes Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

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Un modèle In Vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique véhiculée par 5-Acide aminolévulinique sur Staphylococcus aureus Biofilm