Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת חוף ד'אזור, וסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות התוכנית השקעות למעבדת המצוינות העתידית (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ויוזמת המצוינות (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. נתמך על ידי מענקים מן Société Francophone du Diabète (SFD), האגודה Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), המכון Thématique Multi-Organismes טכנולוגיות לשפוך לה סנטה (ITMO), ואת פונדציה בנג'מין-Delessert. J.G. נתמך על ידי ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. נתמך על ידי מענק ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ומענק מן פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M הממומן על ידי קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-ימיים ו- Région PACA, הנתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופיה והדמיה GIS IBiSA חוף ד'אזור (MICA).

הערה: השתמש בטכניקות סטריליות כדי לבצע את כל שלבי הפרוטוקול במכסה המנוע של תרבית תא זרימה למינארית. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים אודות כל הריאגנטים והציוד.
1. הבחנה של פיברובלסטים מורין 3T3-L1 לאדיפוציטים
<ol><li>לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מ"מ בתרבות בינונית DMEM ללא פ...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידול ולהדבקה של אדיפוציטים בוגרים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להדבקת אוליגונוקלאוטידים כגון, אך לא רק, siRNAs, מיקרו-RNA מחקה, ואנטי מיקרו-RNAs לתוך אדיפוציטים 3T3-L1, שהוא אחד מקווי התא הקשים ביותר לבצע תעתיק. לשיטה זו יש כמה מגבל?...

השמנת יתר נחשבת לגורם סיכון מרכזי למחלות מטבוליות רבות, כולל תנגודת לאינסולין (IR), סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות לב וכלי דם1. הטיפולים הנוכחיים לא הצליחו לעצור את השכיחות הגואה המתמדת של מחלות אלה, וניהול IR של חולי שמנים וחולי סוכרת נותר נושא קליני חשוב. רקמת השומן ממלאת תפקיד מכריע בשליטה על הומאוסטזיס אנרגיה, וההתרחבות הפתולוגית שלה במהלך השמנת יתר תורמת להתפתחות של IR ו- T2D2,3. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. מחקרים רבים חקרו את התפקיד של RNAs קידוד חלבון בפיזיולוגיה אדיפוציטים ואת הקשר שלהם עם השמנת יתר.
לאחרונה, הגילוי של RNAs שאינם קידוד (ncRNAs), במיוחד מיקרו-RNAs (miRs), זייף מושגים חדשניים הקשורים למנגנון הרגולציה של תוכניות ביטוי גנים. מחקרים הראו כי ncRNAs הם רגולטורים חשובים של תפקוד אדיפוציטים, וכי dysregulation שלהם ממלא תפקיד חשוב במחלות מטבוליות4. לכן, מניפולציה של חלבונים ו NCRNAs ב adipocytes הוא חיוני כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת השפעתם על פתולוגיות כגון T2D. עם זאת, מניפולציה של ביטוי של חלבונים ו ncRNAs ב vivo, כמו גם adipocytes ראשוני נשאר מאתגר מאוד, העדפת השימוש במודלים אדיפוציטים במבחנה.
פיברובלסטים מורין 3T3-L1 בקלות להבדיל לתוך adipocytes בוגר, פונקציונלי, תנגודת לאינסולין, שהם קו תאים מאופיין היטב המשמש לחקר תפקוד אדיפוזיט (למשל, איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipolysis והפרשת אדיפוקינים)5,6,7,8,9,10. מאפיינים אלה הופכים את 3T3-L1 לאידיפוציטים מודל אטרקטיבי כדי לווסת את הביטוי של קידוד חלבונים ו- NC-RNAs כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת תפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר. למרבה הצער, בעוד 3T3-L1 פיברובלסטים קל להעביר באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית, מודיפוציטים 3T3-L1 מובחנים הם אחד מקווי התא הקשים ביותר כדי להעביר. זו הסיבה שמחקרים רבים המתמרנים ביטוי גנים בתאי 3T3-L1 התמקדו בבידול אדיפוציטים ולא בתפקוד אדיפוציטים.
במשך זמן רב, הטכניקה היעילה היחידה כדי טרנספקט adipocytes היה electroporation5, וזה מייגע, יקר, והוא יכול לגרום נזק לתא. מאמר זה מדווח על טכניקת טרנס-טרנס-זיהום באמצעות ריאגנט תעתיק נפוץ, אשר מפחית את הזמן מעשי עבור transfection, אין השפעה על הכדאיות התא, והוא הרבה פחות יקר מאשר electroporation. פרוטוקול זה מתאים באופן מושלם לתרגום של siRNA ואוליגונוקלאוטידים אחרים כגון מיקרו-RNA מחקה (מחקה miR) ואנטי-miRs. העיקרון של פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הפוך הוא לדגור על ריאגנט הטרנס-זיהום ואת האוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בצלחת תרבית התא ואז לזרוע את אדיפוציטים בוגרים לתוך הבארות. לאחר מכן, אדיפוציטים לחבר מחדש את פני הלוח דבק בנוכחות קומפלקס ריאגנט אוליגונוקלאוטידים / transfection. מתודולוגיה פשוטה, יעילה וזולה זו מאפשרת לחקור את תפקידם של RNAs ו- miRs קידוד חלבונים בתפקוד אדיפוציטים ותפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

שינוי בתפקוד אדיפוזיטים תורם לפתוגנזה של מחלות מטבוליות כולל סוכרת מסוג 2 ועמידות לאינסולין. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. אפנון הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים נותר מאתגר מאוד. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי להבדיל בין פיברובלסטים מורין לאדיפוציטים בוגרים ולווסת את הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים בוגרים באמצעות תעתיק הפוך באמצעות RNA מפריע קטן (siRNA) ומיקרו-RNA מחקה (מחקה חיקוי) אוליגונוקלאוטידים. פרוטוקול תעתיק הפוך זה כרוך בדגורה של ריאגנט טרנס-זיהום והאוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בלוח תרביות התא שאליו מתווספים האדיפוציטים הבוגרים. לאחר מכן, אדיפוציטים מורשים לחבר מחדש למשטח הלוח החסידי בנוכחות קומפלקס הריאגנט אוליגונוקלאוטידים/טרנספקטריון. ניתוחים פונקציונליים כגון המחקר של איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה, ליפוליזה יכול להתבצע על אדיפוזיטים בוגרים 3T3-L1 כדי לחקור את ההשפעה של חלבון או מניפולציה מיקרו-RNA על תפקוד אדיפוזיט.

באמצעות ההליך של טרנס-טרנס-זיהום הפוך המתואר כאן כדי לווסת את הביטוי של חלבונים או מיקרו-RNAs ב 3T3-L1 adipocytes, adipocytes הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection (איור 1B,C). ואכן, 2 ימים לאחר transfection, adipocytes היו מפוזרים היטב מחוברים לצלחת והציג טיפות שומני...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.

מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

פרוטוקול זה מאפשר לתפעל חלבונים, או ביטוי מיקרו-רנ"א, באדיפוציטים מובחנים כדי לחקור את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להעביר אוליגונוקלאוטידים לאדיפוציטים של עכבר 3T3-L1. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על preadipocytes אנושיים מובחנים אדיפוציטים.מי שתדגים את ההליך תהיה מלאני גודפרין, טכנאית מהמעבדה שלנו. לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מילימטר ב- DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, סרום עגל שזה עתה נולד, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין. מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס ושבעה אחוז פחמן דו חמצני.יומיים לאחר המפגש, לשנות את המדיום התרבותי, להחליף אותו עם DMEM ללא pyruvate, גלוקוז 25 מילימולר, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 0.25 מילימטר IBMX, 0.25 מיקרומולר דקסמתזון, חמישה מיקרוגרם לאינסולין מיליליטר, ו 10 מיקרומולר רוזיגליטזון. לדגור על הכלים במשך יומיים. יומיים לאחר מכן, להחליף את המדיום התרבותי עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת חמישה מיקרוגרם לאינסולין מיליליטר ו 10 מיקרומולר רוזיגליצון ודגרה במשך יומיים נוספים.להאכיל את התאים כל יומיים עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין ולשמור על התאים באינקובטור. יום אחד או כמה שעות לפני ההדבקה, להכין פתרון של סוג קולגן אני ב 100 מיקרוגרם למיליליטר ב 30% אתנול מפתרון מלאי במיליגרם אחד למיליליטר. הוסיפו 250 מיקרוליטרים של קולגן לבאר של צלחת של 12 בארות או 125 מיקרוליטרים לבאר של צלחת של 24 בארות ומפזרים את הפתרון על פני השטח של הבאר.השאירו את הצלחת ללא המכסה מתחת למכסה המנוע התרבותי עד שהקולגן יתייבש. ואז לשטוף אותו פעמיים עם D-PBS. מזלפים את siRNA עם בינוני חיוני מינימלי משופר לערבב ודגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.מוסיפים את ריאגנט הטרנס-זיהום ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר לסירנ"א ופיפטה לערבב. לדגור אותו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מוסיפים את תערובת הטרנספקטיון לכל באר של הצלחת מצופה הקולגן.לשטוף את התאים בצלחת פטרי 100 מ"מ פעמיים עם D-PBS. הוסף טריפסין 5x לתאים, הקפד לכסות את כל פני השטח עם טריפסין. המתן 30 שניות והסיר בזהירות את טריפסין.לדגור את צלחת פטרי במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור. לאחר מכן הקש על המנה כדי לנתק את התאים, תוך הימנעות מנזק לתא. הוסף 10 מיליליטר של DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולר, 10% FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין כדי לנטרל את טריפסין.בזהירות pipette המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים הומוגניזציה ההשעיה של התא. לספור את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי ולהתאים את הריכוז של התאים ל 0.625 מיליון תאים למיליליטר של בינוני. זרע 800 מיקרוליטרים של השעיית התא לבאר של צלחת 12-well או 400 microliters של השעיית התא לכל באר של צלחת 24-באר המכילה את תערובת transfection.לדגור על הלוחות באינקובטור תרבית תאים ולא להפריע להם במשך 24 שעות. למחרת, בזהירות להחליף את supernatant עם DMEM טרי ללא pyruvate, גלוקוז 25 מילימולר, 10% FCS, ו אחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין ולהחזיר את התאים לאינקובטור. נקודות זמן אופייניות לזיהוי נוקאאוט יעד לאחר מסירת siRNA או miR הן 24 עד 48 שעות עבור mRNA ו 48 עד 96 שעות לחלבון.ניסויים פונקציונליים יכולים להתבצע על אדיפוזיטים transfected כולל איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, הפרשת אדיפוקין, lipolysis, ליפוגנזה. אדיפוציטים הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection. יומיים לאחר transfection, adipocytes הציג טיפות שומנים רב לשוניות עם תוכן שומנים לא שונה בין אדיפוזיטים transfected ולא transfected.ביטוי ה- mRNA של סמני בידול שונים לא השתנה בתאים שהודבקו בהשוואה לזה של אדיפוציטים שאינם מושפעים. פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הוא יעיל כמו יותר מ -70% של adipocytes הועברו. שלושה ימים לאחר הטרנספקט עם siRNA נגד Perilipin-1, רמת ה- mRNA של Perilipin-1 ירדה ב -70%ורמת החלבון ב -63%ביטוי Perilipin-1 נותחה גם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ארבעה ימים לאחר ההדבקה ונמצא כי ירדה ב -92% בהשוואה לביטוי שלה באדיפוציטים שליטה.טרנס-טרנספקט של אדיפוציטים עם מיקרו-רנ"א המחקה אוליגונוקלאוטידים כדי לווסת את הביטוי של miR-34a מוצג כאן. ביטוי יתר של miR-34a הוביל לירידה בביטוי חלבון VAMP2 על ידי 50%ההשבתה של Perilipin-1 ב 3T3-L1 אדיפוזיטים הוביל לעלייה ליפוליזה בזאלית בעוד ביטוי יתר של miR-34a הוביל לעיכוב של חלבון המושרה באינסולין קינאז B זרחן וספיגת גלוקוז. חשוב להגיע לרמה גבוהה של הבחנה אדיפוציטים כדי לבצע את transfection על אדיפוציטים מובחנים חדשים כדי לפקח בזהירות על הטיפול של אדיפוציטים עם טריפסין.לאחר ההדבקה, ניתן לבצע ניסויים פונקציונליים על אדיפוזיטים כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים או מניפולציה microRNA על איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipogenesis, ליפוליזה.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...