Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

इस काम को INSERM, Université कोटे डी अज़ूर, और फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) द्वारा भविष्य की प्रयोगशाला उत्कृष्टता के लिए कार्यक्रम निवेश के माध्यम से समर्थित किया गया था (लैबेक्स सिग्नलिफे-एएनआर-11-लैबएक्स-0028-01) और उत्कृष्टता की पहल (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001)। जेजे को सोसिएट फ्रैंकोफोन डु डायबेट (एसएफडी), एसोसिएशन फ्रैंकोइस डी एट्यूड एट डी रेचेचे सुर एल ओबेसिटे (एएफईआरओ), इंस्टिट्यूट थेमेटिक मल्टी-ऑर्गेन्स टेक्नोलॉजीज डालना ला सैंटे (आईटीएमओ), और प्रियतम बेंजामिन-डीलेसर्ट के अनुदानों द्वारा समर्थित है। जेजी ANR-18-CE14-0035-01 द्वारा समर्थित है । जे-एफटी को एएनआर ग्रांट ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 द्वारा समर्थित किया जाता है और प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल (इक्विप एफआरएम, DEQ20180839587) से अनुदान । हम Conseil Départemental des Alpes-Maritimes और रेगियन PACA द्वारा वित्त पोषित C3M की इमेजिंग कोर सुविधा का भी धन्यवाद करते हैं, जिसे जीआईएस आईबिसा माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्लेटफॉर्म कोटे डी अज़ूर (MICA) द्वारा भी समर्थित किया जाता है।

नोट: एक लैमिनार प्रवाह सेल संस्कृति हुड में प्रोटोकॉल के सभी चरणों को करने के लिए बाँझ तकनीकों का उपयोग करें। सभी अभिकर्दकों और उपकरणों के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें।
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<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

यह पत्र परिपक्व एडिपोसाइट्स के भेदभाव और स्थानांतरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह रिवर्स-ट्रांसफेक्शन विधि ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को स्थानांतरित करने के लिए एक सरल, किफायती और अत...

मोटापा इंसुलिन प्रतिरोध (आईआर), टाइप 2 मधुमेह (T2D), और हृदय रोगों 1 सहित कई चयापचय रोगों के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक मानाजाताहै । वर्तमान चिकित्सा इन रोगों की लगातार बढ़ती व्यापकता को रोकने में विफल रहे हैं, और मोटापे से ग्रस्त और मधुमेह रोगियों के आईआर के प्रबंधन एक महत्वपूर्ण नैदानिक मुद्दा बना हुआ है । एडिपोस ऊतक ऊर्जा होमोस्टेसिस के नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और मोटापे के दौरान इसका रोग विस्तार आईआर और टी 2डी2,3के विकास में योगदानदेताहै। यह मोटापे से संबंधित रोगों के खिलाफ नए उपचार विकसित करने के लिए adipocyte शिथिलता में शामिल आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है । कई शोध अध्ययनों में एडिपोसाइट फिजियोलॉजी में प्रोटीन-कोडिंग आरएनए की भूमिका और मोटापे के साथ उनके जुड़ाव की जांच की गई है ।
हाल ही में, गैर-कोडिंग आरएनए (एनसीआरएन), विशेष रूप से माइक्रो-आरएनए (एमआईआरएस) की खोज ने जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के नियमन के तंत्र से संबंधित उपन्यास अवधारणाओं को जाली कर दिया है। अध्ययनों से पता चला है कि एनसीआरएन एडिपोसाइट फ़ंक्शन के महत्वपूर्ण नियामक हैं, और उनका डिस्रेगुलेशन मेटाबोलिक रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है4। इस प्रकार, आदिपोसाइट्स में प्रोटीन और एनसीआरएन का हेरफेर आदिपोसाइट फ़ंक्शन में उनकी भूमिकाओं और टी2डी जैसी विकृतियों पर उनके प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, वीवो के साथ-साथ प्राथमिक एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और एनसीआरएन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करना अत्यधिक चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, जो इन विट्रो एडिपोसाइट मॉडल के उपयोग के पक्ष में है।
मुरीन 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट आसानी से परिपक्व, कार्यात्मक, और इंसुलिन-उत्तरदायी एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जो एक अच्छी तरह से विशेषता वाली सेल लाइन है जिसका उपयोग एडिपोसिट फ़ंक्शन (जैसे, इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, लिपोलिसिस और एडिपोकिन्स स्राव) का अध्ययन करने के लिए किया जाता है)5,6,7,8,9,10। ये गुण 3T3-L1 adipocytes को प्रोटीन-कोडिंग और एनसी-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाने के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाते हैं ताकि एडीपोसाइट फ़ंक्शन में उनकी भूमिका और मोटापे से संबंधित बीमारियों में उनकी संभावित भूमिका को समझा जा सके। दुर्भाग्य से, जबकि 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिएजेंट्स का उपयोग करके ट्रांसफेक्ट करना आसान है, विभेदित 3T3-L1 adipocytes ट्रांसफेक्ट करने के लिए सबसे कठिन सेल लाइनों में से एक हैं। यही कारण है कि 3T3-L1 कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने वाले कई अध्ययनों ने एडिपोसाइट फ़ंक्शन के बजाय एडीपोसाइट भेदभाव पर ध्यान केंद्रित किया है।
लंबे समय तक, एडिपोसाइट्स को स्थानांतरित करने के लिए एकमात्र कुशल तकनीक इलेक्ट्रोपॉयशन5थी, जो थकाऊ, महंगा है, और सेल क्षति का कारण बन सकती है। यह पेपर एक आम ट्रांसफैक्शन रिएजेंट का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफैक्शन तकनीक की रिपोर्ट करता है, जो ट्रांसफैक्शन के लिए हाथों को समय पर कम करता है, सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, और इलेक्ट्रोपॉनेशन की तुलना में बहुत कम महंगा है। यह प्रोटोकॉल पूरी तरह से सिरना और अन्य ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जैसे माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर नकल) और एंटी-एमआईआर के ट्रांसफेक्शन के लिए अनुकूल है। रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल का सिद्धांत कोशिका संस्कृति प्लेट में एक जटिल बनाने के लिए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को इनक्यूबेट करना और फिर परिपक्व एडीपोसाइट्स को कुओं में बीज करना है। फिर, एडिपोसाइट्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स/ट्रांसफैक्शन रीएजेंट कॉम्प्लेक्स की उपस्थिति में अनुयायी प्लेट सतह पर फिर से संलग्न होते हैं। यह सरल, कुशल और सस्ती पद्धति एडिपोसाइट फ़ंक्शन में प्रोटीन-कोडिंग आरएनए और एमआईआर की भूमिका और मोटापे से संबंधित बीमारियों में उनकी संभावित भूमिका के अध्ययन की अनुमति देती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

एडिपोसाइट फ़ंक्शन का परिवर्तन टाइप 2 मधुमेह और इंसुलिन प्रतिरोध सहित मेटाबोलिक रोगों के रोगजनन में योगदान देता है। यह मोटापे से संबंधित रोगों के खिलाफ नए उपचार विकसित करने के लिए adipocyte शिथिलता में शामिल आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है । एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मॉडुलन करना बेहद चुनौतीपूर्ण रहता है। यह पत्र मुरीन फाइब्रोब्लास्ट को परिपक्व एडिपोसाइट्स में अंतर करने और छोटे हस्तक्षेप वाले आरएनए (सिरएनए) और माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर नकल) ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफेक्शन के माध्यम से परिपक्व एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल में ट्रांसफैक्शन रिएजेंट और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की इनक्यूबेशन शामिल है ताकि सेल कल्चर प्लेट में एक जटिल बनाया जा सके, जिससे परिपक्व एडिपोसाइट्स जोड़े जाते हैं। इसके बाद एडिपोसाइट्स को ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स/ट्रांसफैक्शन रिएजेंट कॉम्प्लेक्स की मौजूदगी में अनुयायी प्लेट की सतह पर फिर से संलग्न करने की अनुमति है । इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, लिपोजेनेसिस और लिपोलिसिस के अध्ययन जैसे कार्यात्मक विश्लेषण ों को संक्रमित 3T3-L1 परिपक्व एडिपोसाइट्स पर किया जा सकता है ताकि आदिपोसाइट फ़ंक्शन पर प्रोटीन या माइक्रो-आरएनए हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन किया जा सके।

3T3-L1 adipocytes में प्रोटीन या माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाना करने के लिए यहां वर्णित रिवर्स-ट्रांसफेक्शन की प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, एडिपोसाइट्स को ट्रांसफैक्शन(चित्रा 1B,स?...

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An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

यहां प्रस्तुत प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए अभिव्यक्ति को मिलाने के लिए परिपक्व एडिपोसाइट्स में छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिराना), माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर), या एंटी-माइक्रो-आरएनए (एंटी-एमआईआर) जैसे ओलिगोन्यूक्लियोट्स देने के लिए एक प्रोटोकॉल है।

एडिपोसाइट फंक्शन पर प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए मॉड्यूलेशन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक एडिपोसाइट सेल कल्चर मॉडल

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

यह प्रोटोकॉल आदिपोसाइट्स समारोह में अपनी भूमिका का अध्ययन करने के लिए विभेदित एडिपोसाइट्स में प्रोटीन, या माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति में हेरफेर करना संभव बनाता है। यह रिवर्स-ट्रांसफेक्शन विधि एक सरल, किफायती और अत्यधिक कुशल विधि है जो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को माउस 3T3-L1 एडिपोसाइट्स में स्थानांतरित करने के लिए है। इस विधि को मानव प्रीडिपोसाइट्स पर भी लागू किया जा सकता है जो एडिपोसाइट्स में विभेदित है।प्रक्रिया का प्रदर्शन मेलानी Gaudfrin, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा । बिना पायरुवेट, 25 मिलीमीटर ग्लूकोज, 10% नवजात बछड़ा सीरम, और एक प्रतिशत पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के बिना डीएमईएम में 100 मिलीमीटर व्यंजनों में 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट उगाएं। व्यंजनों को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस और सात प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड पर रखें ।संगम के दो दिन बाद, संस्कृति माध्यम को बदलें, इसे बिना पायरुवेट, 25 मिलीमोलर ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और एक प्रतिशत पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 0.25 मिलीमोलर आईबीएमएक्स, 0.25 माइक्रोमोलर डेक्सामेथेसोन, पांच माइक्रोमोलर डेक्सामेथेसोन, पांच माइक्रोमोलर डेक्सामेस्टासोन, पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर इंसुलिन और 10मोलर माइक्रोसिएल्टाज़ोन के साथ बदलें। दो दिनों तक पकवानों को इनक्यूबेट करें। दो दिन बाद, संस्कृति माध्यम को बिना पायरुवेट, 25 मिलीमोलर ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और एक प्रतिशत पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर इंसुलिन और 10 माइक्रोमोलर रोसिग्लिटाजोन और एक और दो दिनों के लिए इनक्यूबेट के साथ प्रतिसात करें ।कोशिकाओं को हर दो दिन में बिना पायरुवेट, 25 मिलीमोलर ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और एक प्रतिशत पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ खिलाएं और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में रखें। ट्रांसफेक्शन से एक दिन या कुछ घंटे पहले, एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर स्टॉक समाधान से 30% इथेनॉल में 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पर कोलेजन टाइप I का समाधान तैयार करें। एक 12 अच्छी तरह से थाली या एक 24 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से १२५ माइक्रोलीटर के प्रति कोलेजन के २५० माइक्रोलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से सतह पर समाधान फैल गया ।कोलेजन सूखने तक संस्कृति हुड के नीचे ढक्कन के बिना प्लेट छोड़ दें। फिर इसे डी-पीबीएस के साथ दो बार धोएं। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए मिश्रण और इनक्यूबेट करने के लिए बेहतर न्यूनतम आवश्यक माध्यम के साथ सिरना को पिपेट करें।मिश्रण करने के लिए सिरना और पिपेट में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट और बेहतर न्यूनतम आवश्यक माध्यम जोड़ें। इसे कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर कोलेजन-लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में ट्रांसफैक्शन मिश्रण जोड़ें।100 मिलीमीटर पेट्री डिश में कोशिकाओं को डी-पीबीएस के साथ दो बार धोएं। कोशिकाओं में 5x ट्राइपसिन जोड़ें, जिससे ट्राइप्सिन के साथ पूरी सतह को कवर करना सुनिश्चित करें। 30 सेकंड तक रुकें और ट्राइप्सिन को ध्यान से हटा दें।पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच से 10 मिनट तक इनक्यूबेट करें। फिर कोशिकाओं को अलग करने के लिए पकवान टैप करें, सेल क्षति से बचें। ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए बिना पायरुवेट, 25 मिलीमोलर ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और एक प्रतिशत पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 मिलीलीटर जोड़ें।कोशिकाओं को अलग करने और कोशिका निलंबन को समरूप बनाने के लिए माध्यम को ध्यान से ऊपर और नीचे पिपेट करें। मैलासेज़ गिनती कक्ष या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और कोशिकाओं की एकाग्रता को माध्यम के मिलीलीटर प्रति 0.625 मिलियन कोशिकाओं में समायोजित करें। बीज 800 सेल निलंबन के प्रति अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली या एक 24 अच्छी तरह से ट्रांसफेक्शन मिश्रण युक्त थाली के प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के ४०० माइक्रोलीटर ।प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें और उन्हें 24 घंटे तक परेशान न करें। अगले दिन, ध्यान से बिना पाइरुवेट, 25 मिलीमोलर ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और एक प्रतिशत पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के ताजा डीएमईएम के साथ सुपरनेटेंट को बदलें और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें। सिरना या एमआईआर डिलीवरी के बाद लक्ष्य नॉकडाउन का पता लगाने के लिए विशिष्ट समय अंक एमआरएनए के लिए 24 से 48 घंटे और प्रोटीन के लिए 48 से 96 घंटे हैं।कार्यात्मक प्रयोग इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, आदिपोकिन स्राव, लिपोलिसिस और लिपोजेनेसिस सहित संक्रमित एडिपोसाइट्स पर किए जा सकते हैं। एडिपोसाइट्स को ट्रांसफैक्शन के बाद अपनी आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए दिखाया गया है। ट्रांसफैक्शन के दो दिन बाद, एडिपोसाइट्स ने बहुभाषी लिपिड बूंदों को लिपिड सामग्री के साथ पेश किया जो संक्रमित और गैर-संक्रमित एडिपोसाइट्स के बीच अलग नहीं थे।गैर-संक्रमित एडिपोसाइट्स की तुलना में विभिन्न विभेदन मार्कर की एमआरएनए अभिव्यक्ति संक्रमित कोशिकाओं में अपरिवर्तित थी। रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल कुशल है क्योंकि 70% से अधिक एडिपोसाइट्स संक्रमित थे। पेरिलिपिन-1 के खिलाफ सिरना के साथ ट्रांस्फेक्शन के तीन दिन बाद पेरिलिपिन-1 के एमआरएनए स्तर में ७०% की कमी आई थी और प्रोटीन स्तर में ६३% पेरिलिपिन-1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण भी ट्रांसफेक्शन के चार दिन बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था और पाया गया था कि नियंत्रण आदिपोसाइट्स में इसकी अभिव्यक्ति की तुलना में ९२% की कमी आई है ।एमआईआर-34ए की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए माइक्रोआरएनए नकल करने वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ एडिपोसाइट्स का रिवर्स-ट्रांसफेक्शन यहां दिखाया गया है । एमआईआर-34ए की अधिक अभिव्यक्ति के कारण 50% तक VAMP2 प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी आई 3T3-L1 एडिपोसाइट्स में पेरिलिपिन-1 के नॉकआउट ने बेसल लिपोलिसिस में वृद्धि की जबकि एमआईआर-34ए की अधिक अभिव्यक्ति के कारण इंसुलिन-प्रेरित प्रोटीन किनेस बी फोस्फोरिलेशन और ग्लूकोज अपटेक का अवरोध हुआ। नए विभेदित एडिपोसाइट्स पर ट्रांसफैक्शन करने और ट्राइपसिन के साथ एडिपोसाइट्स के उपचार की सावधानीपूर्वक निगरानी करने के लिए एडीपोसाइट्स भेदभाव के उच्च स्तर तक पहुंचना महत्वपूर्ण है।ट्रांसफैक्शन के बाद, इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, लिपोजेनेसिस और लिपोलिसिस पर प्रोटीन या माइक्रोआरएनए हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एडिपोसाइट्स पर कार्यात्मक प्रयोग करना संभव है।

Research

JoVE Journal

Biology

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