Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Université Côte d'Azur og Det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) gjennom programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) og Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. støttes av tilskudd fra Société Francophone du Diabète (SFD), Foreningen Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) og Fondation Benjamin-Deltesert. J.G. støttes av ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. støttes av ANR grant ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 og et stipend fra Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansiert av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, som også støttes av GIS IBiSA Microscopy og Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).

MERK: Bruk sterile teknikker for å utføre alle trinnene i protokollen i en laminær strømningscellekulturhette. Se Materialliste for detaljer om alle reagenser og utstyr.
1. Differensiering av murin 3T3-L1 fibroblaster i adipocytter
<ol><li>Voks 3T3-L1 fibroblaster i 100 mm retter i kulturmedie-DMEM uten pyruvat, 25 mM glukose, 10% nyfødt kalveserum og 1% penicillin og streptomycin (Figur 1A). Plasser rettene i en vevskulturinkubator (7% CO<...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll for differensiering og transfeksjon av modne adipocytter. Denne omvendte transfeksjonsmetoden er en enkel, økonomisk og svært effektiv metode for å transfektere oligonukleotider som, men ikke begrenset til, siRNAer, mikro-RNA-etterligninger og antimikro-RNAer til 3T3-L1-adipocytter, som er en av de vanskeligste cellelinjene å transfektere. Denne metoden har noen begrensninger som må vurderes. Denne protokollen er ikke effektiv for transfeksjon med plasmid DNA, noe ...

Fedme regnes som en viktig risikofaktor for mange metabolske sykdommer, inkludert insulinresistens (IR), type 2 diabetes (T2D) og kardiovaskulære sykdommer1. Nåværende terapier har ikke klart å stoppe den stadig økende forekomsten av disse sykdommene, og håndteringen av IR av overvektige og diabetikere er fortsatt et viktig klinisk problem. Fettvev spiller en avgjørende rolle i kontrollen av energi homeostase, og den patologiske ekspansjonen under fedme bidrar til utviklingen av IR og T2D2,3. Dette understreker behovet for å bedre forstå den molekylære mekanismen som er involvert i adipocyt dysfunksjon for å utvikle nye terapier mot fedmerelaterte sykdommer. Mange forskningsstudier har undersøkt rollen som proteinkoding RNAer i adipocytt fysiologi og deres tilknytning til fedme.
Mer nylig har oppdagelsen av ikke-kodende RNAer (ncRNAer), spesielt mikro-RNAer (miRs), smidd nye konsepter knyttet til mekanismen for regulering av genuttrykksprogrammer. Studier har vist at ncRNAer er viktige regulatorer for adipocyttfunksjon, og at deres dysregulering spiller en viktig rolle i metabolske sykdommer4. Dermed er manipulering av proteiner og ncRNAer i adipocytter avgjørende for å dechiffrere sine roller i adipocyttfunksjon og deres innvirkning på patologier som T2D. Imidlertid er manipulering av uttrykket av proteiner og ncRNAer in vivo så vel som i primære adipocytter fortsatt svært utfordrende, og favoriserer bruken av in vitro-adipocyttmodeller.
Murine 3T3-L1 fibroblaster skiller seg lett ut i modne, funksjonelle og insulinresponsive adipocytter, som er en godt karakterisert cellelinje som brukes til å studere adipocyttfunksjon (f.eks. insulinsignalering, glukoseopptak, lipolyse og adipokines sekresjon)5,6,7,8,9,10. Disse egenskapene gjør 3T3-L1 adipocytter til en attraktiv modell for å modulere uttrykket av proteinkoding og nc-RNAer for å dechiffrere sin rolle i adipocyttfunksjon og deres potensielle rolle i fedmerelaterte sykdommer. Dessverre, mens 3T3-L1 fibroblaster er enkle å transfektere ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser, er differensierte 3T3-L1-adipocytter en av de vanskeligste cellelinjene å transfektere. Dette er grunnen til at mange studier som manipulerer genuttrykk i 3T3-L1 celler har fokusert på adipocyttdifferensiering i stedet for på adipocyttfunksjon.
I lang tid var den eneste effektive teknikken for å transfektere adipocytter elektroporasjon5, noe som er kjedelig, dyrt og kan forårsake celleskade. Dette papiret rapporterer en omvendt transfeksjonsteknikk ved hjelp av et vanlig transfeksjonsreagens, som reduserer praktisk tid for transfeksjon, har ingen effekt på celle levedyktighet, og er mye billigere enn elektroporasjon. Denne protokollen er perfekt egnet for transfeksjon av siRNA og andre oligonukleotider som mikro-RNA-etterligninger (miR-etterligninger) og anti-miRs. Prinsippet for omvendt transfeksjonsprotokoll er å inkubere transfeksjonsreagenset og oligonukleotidene for å danne et kompleks i cellekulturplaten og deretter frø de modne adipocyttene inn i brønnene. Deretter festes adipocyttene til den festende plateoverflaten i nærvær av oligonukleotider / transfeksjonsreagenskomplekset. Denne enkle, effektive og rimelige metodikken tillater studiet av rollen som proteinkoding RNAer og miRs i adipocyttfunksjon og deres potensielle rolle i fedmerelaterte sykdommer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

Endring av adipocyttfunksjon bidrar til patogenese av metabolske sykdommer, inkludert type 2 diabetes og insulinresistens. Dette understreker behovet for å bedre forstå den molekylære mekanismen som er involvert i adipocyt dysfunksjon for å utvikle nye terapier mot fedmerelaterte sykdommer. Modulering av uttrykket av proteiner og mikro-RNAer i adipocytter er fortsatt svært utfordrende. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å differensiere murinfibroblaster i modne adipocytter og for å modulere uttrykket av proteiner og mikro-RNAer i modne adipocytter gjennom omvendt transfeksjon ved hjelp av små forstyrrende RNA (siRNA) og mikro-RNA-etterligning (miR-etterligning) oligonukleotider. Denne omvendte transfeksjonsprotokollen innebærer inkubasjon av transfeksjonsreagenset og oligonukleotidene for å danne et kompleks i cellekulturplaten som de modne adipocyttene legges til. Adipocyttene får da lov til å feste seg til den festende plateoverflaten i nærvær av oligonukleotider / transfeksjonsreagenskomplekset. Funksjonelle analyser som studiet av insulinsignalering, glukoseopptak, lipogenese og lipolyse kan utføres på de transfiserte 3T3-L1 modne adipocyttene for å studere virkningen av protein- eller mikro-RNA-manipulasjon på adipocyttfunksjon.

Ved hjelp av prosedyren for omvendt transfeksjon beskrevet her for å modulere uttrykket av proteiner eller mikro-RNAer i 3T3-L1-adipocytter, har adipocyttene vist seg å bevare sin morfologi etter transfeksjonen (Figur 1B,C). Faktisk, 2 dager etter transfeksjonen, var adipocyttene godt spredt og festet til platen og presenterte flerlokære lipiddråper som er karakteristiske for modne 3T3-L1 adipocytter. Lipidinnholdet var ikke forskjellig m...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Presentert her er en protokoll for å levere oligonukleotider som små forstyrrende RNA (siRNA), mikro-RNA-etterligninger (miRs) eller antimikro-RNA (anti-miR) i modne adipocytter for å modulere protein og mikro-RNA-uttrykk.

En Adipocyte-cellekulturmodell for å studere virkningen av protein- og mikro-RNA-modulering på adipocyttfunksjon

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Denne protokollen gjør det mulig å manipulere proteiner, eller microRNA-uttrykk, i differensierte adipocytter for å studere sin rolle i adipocytter funksjon. Denne omvendte transfeksjonsmetoden er en enkel, økonomisk og svært effektiv metode for å transfektere oligonukleotider til mus 3T3-L1-adipocytter. Denne metoden kan også brukes på menneskelige preadipocytter differensiert i adipocytter.Melanie Gaudfrin, en tekniker fra laboratoriet vårt, demonstrerer prosedyren. Vokse 3T3-L1 fibroblaster i 100 millimeter retter i DMEM uten pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% nyfødt kalv serum, og en prosent penicillin og streptomycin. Plasser oppvasken i en vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius og syv prosent karbondioksid.To dager etter sammenløpet, endre kulturmediet, erstatte det med DMEM uten pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS, og en prosent penicillin og streptomycin supplert med 0,25 millimolar IBMX, 0,25 mikromolar dexamethason, fem mikrogram per milliliter insulin, og 10 mikromolar rosigazon. Inkuber oppvasken i to dager. To dager senere, erstatt kulturmediet med DMEM uten pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS og en prosent penicillin og streptomycin supplert med fem mikrogram per milliliter insulin og 10 mikromolar rosiglitazon og inkubere i ytterligere to dager.Fôr cellene annenhver dag med DMEM uten pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS og en prosent penicillin og streptomycin og hold cellene i inkubatoren. En dag eller noen timer før transfeksjonen, lag en løsning av kollagen type I ved 100 mikrogram per milliliter i 30% etanol fra en lagerløsning på ett milligram per milliliter. Tilsett 250 mikroliter kollagen per brønn av en 12-brønns plate eller 125 mikroliter per brønn av en 24-brønns plate og spre løsningen over overflaten av brønnen.La platen stå uten lokket under kulturhetten til kollagenet tørker. Vask den deretter to ganger med D-PBS. Pipette siRNA med forbedret minimum viktig medium for å blande og inkubere i fem minutter ved romtemperatur.Tilsett transfeksjonsreagensen og det forbedrede minimale essensielle mediet til siRNA og pipetten som skal blandes. Inkuber det i 20 minutter ved romtemperatur. Tilsett deretter transfeksjonsblandingen til hver brønn av kollagenbelagt plate.Vask cellene i 100 millimeter Petri parabolen to ganger med D-PBS. Tilsett 5x trypsin til cellene, sørg for å dekke hele overflaten med trypsin. Vent i 30 sekunder og fjern forsiktig trypsin.Inkuber Petri-parabolen i fem til 10 minutter ved 37 grader Celsius i inkubatoren. Trykk deretter på parabolen for å løsne cellene, unngå celleskader. Tilsett 10 milliliter DMEM uten pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS og en prosent penicillin og streptomycin for å nøytralisere trypsin.Rør forsiktig mediet opp og ned for å løsne cellene og homogenisere celleopphenget. Tell cellene ved hjelp av et Malassez tellekammer eller en automatisert celleteller og juster konsentrasjonen av cellene til 0,625 millioner celler per milliliter medium. Frø 800 mikroliter av cellefjæringen per brønn av en 12-brønns plate eller 400 mikroliter av celleopphenget per brønn av en 24-brønnsplate som inneholder transfeksjonsblandingen.Inkuber platene i en cellekulturinkubator og ikke forstyrr dem i 24 timer. Neste dag erstatter du forsiktig supernatanten med fersk DMEM uten pyruvat, 25 millimolar glukose, 10% FCS og en prosent penicillin og streptomycin og returnerer cellene til inkubatoren. Typiske tidspunkter for å oppdage mål knockdown etter siRNA eller miR levering er 24 til 48 timer for mRNA og 48 til 96 timer for protein.Funksjonelle eksperimenter kan utføres på transfiserte adipocytter, inkludert insulinsignalering, glukoseopptak, adipokin sekresjon, lipolyse og lipogenese. Adipocyttene har vist seg å bevare sin morfologi etter transfeksjonen. To dager etter transfeksjon presenterte adipocyttene multilokulære lipiddråper med lipidinnhold som ikke var forskjellig mellom de transfiserte og ikke-transfiserte adipocyttene.MRNA-uttrykket for ulike differensieringsmarkører var uendret i transfiserte celler sammenlignet med det i ikke-transfiserte adipocytter. Protokollen for omvendt transfeksjon er effektiv ettersom mer enn 70 % av apokacyttene ble transfektet. Tre dager etter transfeksjonen med siRNA mot Perilipin-1, hadde mRNA-nivået av Perilipin-1 gått ned med 70%, og proteinnivået med 63% Perilipin-1-uttrykket ble også analysert av fluorescensmikroskopi fire dager etter transfeksjonen og ble funnet å ha redusert med 92%sammenlignet med uttrykket i kontrollapocytter.Omvendt transfeksjon av adipocytter med microRNA som etterligner oligonukleotider for å oppregulere uttrykket miR-34a er vist her. Overuttrykket av miR-34a førte til nedgangen i VAMP2 proteinuttrykk med 50%Nedslag av Perilipin-1 i 3T3-L1 adipocytter førte til en økning i basal lipolyse mens overuttrykket av miR-34a førte til hemming av insulinindusert protein kinase B fosforylering og glukoseopptak. Det er viktig å nå et høyt nivå av adipocytter differensiering for å utføre transfeksjonen på nylig differensierte adipocytter og å nøye overvåke behandlingen av adipocytter med trypsin.Etter transfeksjonen er det mulig å utføre funksjonelle eksperimenter på adipocyttene for å studere virkningen av proteiner eller microRNA-manipulasjon på insulinsignalering, glukoseopptak, lipogenese og lipolyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

En protokoll for identifikasjon av protein-protein interaksjoner Basert på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolsk Merking, Immunoutfellingsanalyse, Quantitative massespektrometri og Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gjær Protein Extraction og rensing for studier av funksjon, interaksjoner, og posttranslasjonelle modifikasjoner

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur system for å studere Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Påvisning av RNA-bindende proteiner etter<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down i adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...