Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

Эта работа была поддержана INSERM, Университетом Лазурного берегу и Французским национальным исследовательским агентством (ANR) в рамках программы «Инвестиции для будущей Лаборатории передового опыта» (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) и «Инициатива передового опыта» (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. поддерживается грантами От Французского сообщества диаспоры (SFD), Французской ассоциации исследований и исследований в области обезите (AFERO), Института технологий мультигезитов в санте (ITMO) и Фонда Бенджамина-Делессерта. J.G. поддерживается ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. поддерживается грантом ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 и грантом Фонда по области ремерче-едикаля (Equipe FRM, DEQ20180839587). Мы также благодарим Центр визуализации C3M, финансируемый Департаментом Приморских Альп и Région PACA, который также поддерживается платформой микроскопии и визуализации GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные методы для выполнения всех этапов протокола в ламинарной проточной культуре клеток. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех реагентах и оборудовании.
1. Дифференцировка фибробластов мысиной 3T3-...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

В данной работе представлен подробный протокол дифференцировки и трансфекции зрелых адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов, таких как, но не ограничиваясь ими, siRNAs, микро-РНК-мимика и анти-ми?...

Ожирение считается основным фактором риска для многочисленных метаболических заболеваний, включая резистентность к инсулину (IR), диабет 2 типа (T2D) и сердечно-сосудистые заболевания1. Современные методы лечения не смогли остановить постоянно растущую распространенность этих заболеваний, и управление ИК пациентов с ожирением и диабетом остается важной клинической проблемой. Жировая ткань играет важнейшую роль в контроле энергетического гомеостаза, а ее патологическое расширение при ожирении способствует развитию ИК иСД22,3. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Многие исследования изучали роль кодирующих белок РНК в физиологии адипоцитов и их связь с ожирением.
Совсем недавно открытие некодирующих РНК (ncRNAs), особенно микро-РНК (miRs), создало новые концепции, связанные с механизмом регуляции программ экспрессии генов. Исследования показали, что нРНК являются важными регуляторами функции адипоцитов, и что их дисрегуляция играет важную роль при метаболических заболеваниях4. Таким образом, манипуляции с белками и ncРНК в адипоцитах имеют решающее значение для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их влияния на такие патологии, как СД2. Тем не менее, манипулирование экспрессией белков и ncRNAs in vivo, а также в первичных адипоцитах остается очень сложным, что способствует использованию моделей адипоцитов in vitro.
Мышиные фибробласты 3T3-L1 легко дифференцируются в зрелые, функциональные и инсулин-чувствительные адипоциты, которые представляют собой хорошо охарактеризованные клеточные линии, используемые для изучения функции адипоцитов (например, передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липолиза и секреции адипокинов)5,6,7,8,9,10. Эти свойства делают адипоциты 3T3-L1 привлекательной моделью для модуляции экспрессии кодирующих белок и nc-РНК для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их потенциальной роли в заболеваниях, связанных с ожирением. К сожалению, в то время как фибробласты 3T3-L1 легко трансфектируются с использованием коммерчески доступных реагентов, дифференцированные адипоциты 3T3-L1 являются одной из самых сложных клеточных линий для трансфектации. Вот почему многочисленные исследования, манипулируя экспрессией генов в клетках 3T3-L1, были сосредоточены на дифференцировке адипоцитов, а не на функции адипоцитов.
Долгое время единственным эффективным методом трансфектации адипоцитов была электропорация5,которая утомительна, дорога и может вызвать повреждение клеток. В этой статье сообщается о методе обратной трансфекции с использованием общего трансфекционного реагента, который сокращает практическое время для трансфекции, не влияет на жизнеспособность клеток и намного дешевле, чем электропорация. Этот протокол идеально подходит для трансфекции siRNA и других олигонуклеотидов, таких как микро-РНК-мимики (miR-мимики) и антимир-мимики. Принцип протокола обратной трансфекции заключается в инкубации трансфекционного реагента и олигонуклеотидов для образования комплекса в пластине клеточной культуры, а затем посева зрелых адипоцитов в колодцы. Затем адипоциты повторно прикрепляются к поверхности адгезивной пластинки в присутствии комплекса реагентов олигонуклеотидов/трансфекции. Эта простая, эффективная и недорогая методология позволяет изучать роль кодирующих белок РНК и миР в функции адипоцитов и их потенциальную роль в заболеваниях, связанных с ожирением.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

Изменение функции адипоцитов способствует патогенезу метаболических заболеваний, включая диабет 2 типа и резистентность к инсулину. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Модуляция экспрессии белков и микро-РНК в адипоцитах остается очень сложной задачей. В данной работе описан протокол дифференцировки мышиных фибробластов в зрелые адипоциты и модуляции экспрессии белков и микро-РНК в зрелых адипоцитах посредством обратной трансфекции с использованием малоинтерферирующих РНК (siRNA) и микро-РНК, имитирующих (miR-mimic) олигонуклеотидов. Этот протокол обратной трансфекции включает инкубацию трансфекционного реагента и олигонуклеотидов с образованием комплекса в пластине клеточной культуры, к которой добавляются зрелые адипоциты. Затем адипоцитам дают повторно прикрепиться к поверхности адгезивной пластины в присутствии комплекса олигонуклеотидов/трансфекционных реагентов. Функциональные анализы, такие как изучение передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липогенеза и липолиза, могут быть выполнены на трансфектированных зрелых адипоцитах 3T3-L1 для изучения влияния манипуляций с белком или микро-РНК на функцию адипоцитов.

Используя описанную здесь процедуру обратной трансфекции для модуляции экспрессии белков или микро-РНК в адипоцитах 3T3-L1, было показано, что адипоциты сохраняют свою морфологию после трансфекции(рисунок 1B,C). Действительно, через 2 дня после тр...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Здесь представлен протокол для доставки олигонуклеотидов, таких как малоинтерферная РНК (siRNA), микро-РНК-мимики (miRs) или анти-микро-РНК (anti-miR) в зрелые адипоциты для модуляции экспрессии белка и микро-РНК.

Модель культуры клеток адипоцитов для изучения влияния модуляции белка и микро-РНК на функцию адипоцитов

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Этот протокол позволяет манипулировать белками или экспрессией микроРНК в дифференцированных адипоцитах для изучения их роли в функции адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов в адипоциты мыши 3T3-L1. Этот метод также может быть применен к преадипоцитам человека, дифференцированным в адипоциты.Продемонстрировать процедуру будет Мелани Гаудфрин, техник из нашей лаборатории. Выращивайте фибробласты 3T3-L1 в 100-миллиметровых блюдах в DMEM без пирувата, 25 миллимолярной глюкозы, 10% сыворотки новорожденных телят и одного процента пенициллина и стрептомицина. Поместите посуду в инкубатор культуры тканей при 37 градусах Цельсия и семи процентах углекислого газа.Через два дня после слияния измените культуральный среду, заменив ее ДМЭМ без пирувата, 25 миллимоляров глюкозы, 10% FCS и один процент пенициллина и стрептомицина, дополненных 0,25 миллимоларом IBMX, 0,25 микромоляром дексаметазоном, пятью микрограммами на миллилитр инсулина и 10 микромолярами росиглитазоном. Насиживать блюда в течение двух дней. Через два дня замените культуральный среду ДМЭМ без пирувата, 25 миллимоляров глюкозы, 10% FCS и одного процента пенициллина и стрептомицина, дополненных пятью микрограммами на миллилитр инсулина и 10 микромолярной росиглитазоном и инкубировать еще два дня.Кормите клетки каждые два дня DMEM без пирувата, 25 миллимолярной глюкозой, 10% FCS и одним процентом пенициллина и стрептомицина и держите клетки в инкубаторе. За сутки или несколько часов до трансфекции готовят раствор коллагена I типа по 100 мкг на миллилитр в 30%-ном этаноле из запасного раствора по одному миллиграмму на миллилитр. Добавьте 250 микролитров коллагена на лунку 12-луночной пластины или 125 микролитров на лунку 24-луночной пластины и распределите раствор по поверхности скважины.Оставьте тарелку без крышки под культуральным капюшоном до тех пор, пока коллаген не высохнет. Затем дважды вымойте его D-PBS. Пипетку siRNA с улучшенной минимально необходимой средой для смешивания и инкубации в течение пяти минут при комнатной температуре.Добавьте трансфекционный реагент и улучшенную минимальную необходимую среду к siRNA и пипетке для смешивания. Инкубировать его в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавьте трансфекционную смесь в каждый кладезы коллагеновой пластины.Дважды вымойте ячейки в 100-миллиметровой чашке Петри с помощью D-PBS. Добавьте 5x трипсина в клетки, обязательно покрывая всю поверхность трипсином. Подождите 30 секунд и аккуратно удалите трипсин.Высиживая чашку Петри в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе. Затем постучите по чашке, чтобы отсоедать клетки, избегая повреждения клеток. Добавьте 10 миллилитров DMEM без пирувата, 25 миллимоляров глюкозы, 10% FCS и один процент пенициллина и стрептомицина для нейтрализации трипсина.Осторожно пипеткой на среду вверх и вниз, чтобы отсоедать клетки и гомогенизировать клеточную суспензию. Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Malassez или автоматизированного счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 0,625 миллиона клеток на миллилитр среды. Засеять 800 микролитров клеточной суспензии на лунку 12-луночной пластины или 400 микролитр клеточной суспензии на лунку 24-луночной пластины, содержащей трансфекционную смесь.Высиживайте пластинки в инкубаторе клеточной культуры и не тревожите их в течение 24 часов. На следующий день осторожно замените супернатант свежим DMEM без пирувата, 25 миллимолярной глюкозой, 10% FCS и одним процентом пенициллина и стрептомицина и верните клетки в инкубатор. Типичные временные точки для обнаружения нокдауна цели после доставки siRNA или miR составляют от 24 до 48 часов для мРНК и от 48 до 96 часов для белка.Функциональные эксперименты могут быть выполнены на трансфефедированных адипоцитах, включая передачу сигналов инсулина, поглощение глюкозы, секрецию адипокина, липолиз и липогенез. Было показано, что адипоциты сохраняют свою морфологию после трансфекции. Через два дня после трансфекции адипоциты представляли многолокулярные липидные капли с содержанием липидов, не отличающихся между трансфектными и неперефраженными адипоцитами.Экспрессия мРНК различных маркеров дифференцировки была неизменной в трансферазированных клетках по сравнению с экспрессией в неперепраженных адипоцитах. Протокол обратной трансфекции эффективен, так как более 70% адипоцитов были трансфектражировались. Через три дня после трансфекции siRNA против Перилипина-1 уровень мРНК Перилипина-1 снизился на 70%, а уровень белка на 63%, экспрессия Перилипина-1 также была проанализирована флуоресцентной микроскопией через четыре дня после трансфекции и было обнаружено, что она снизилась на 92% по сравнению с ее экспрессией в контрольных адипоцитах.Здесь показана обратная трансфекция адипоцитов микроРНК, имитирующих олигонуклеотиды, для повыполнения экспрессии miR-34a. Чрезмерная экспрессия miR-34a привела к снижению экспрессии белка VAMP2 на 50% Нокдаун Перилипина-1 в адипоцитах 3T3-L1 привел к увеличению базального липолиза, в то время как чрезмерная экспрессия miR-34a привела к ингибированию инсулин-индуцированного фосфорилирования протеинкиназы B и поглощения глюкозы. Важно достичь высокого уровня дифференцировки адипоцитов для выполнения трансфекции на вновь дифференцированных адипоцитах и тщательно контролировать лечение адипоцитов трипсином.После трансфекции можно проводить функциональные эксперименты на адипоцитах для изучения влияния белков или манипуляций с микроРНК на передачу сигналов инсулина, поглощение глюкозы, липогенез и липолиз.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Использование optokinetic ответ на исследование зрительной функции данио

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Анализ функций малого ГТФаз по микроинъекции Плазмиды в поляризованных эпителиальных клеток

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе<sup&gt; 15</sup&gt; N Метаболический маркировки, Иммунопреципитация, Количественный масс-спектрометрии и Affinity модуляции

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Система по изучению развития щитовидной железы

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Обнаружение РНК-связывающих белков<em&gt; In Vitro</em&gt; РНК спускающее в адипоцитов культуры

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

In Vitro модель для изучения воздействия 5-аминолевулиновой кислоты-опосредованной фотодинамической терапии на золотистый стафилококк биопленки