Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

Detta arbete stöddes av INSERM, Université Côte d'Azur och Franska nationella forskningsbyrån (ANR) genom programmet Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) och Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. stöds av bidrag från Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) och Fondation Benjamin-Delessert. J.G. stöds av ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. stöds av ANR-bidraget ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 och ett bidrag från Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Vi tackar också Imaging Core Facility of C3M som finansieras av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes och Région PACA, som också stöds av GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).

OBS: Använd sterila tekniker för att utföra alla steg i protokollet i en laminär flödescellkulturhuv. Se Tabell över material för information om alla reagenser och utrustning.
1. Differentiering av murin 3T3-L1 fibroblaster till adipocyter
<ol><li>Odla 3T3-L1 fibroblaster i 100 mm rätter i kulturmedium-DMEM utan pyruvat, 25 mM glukos, 10% nyfött kalvserum och 1% penicillin och streptomycin (Figur 1A). Placera disken i en inkubator för ...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för differentiering och transfection av mogna adipocyter. Denna omvända transfection metod är en enkel, ekonomisk och mycket effektiv metod för att transfect oligonucleotides såsom, men inte begränsat till, siRNAs, micro-RNA härmar och anti-mikro-RNAs till 3T3-L1 adipocyter, som är en av de svåraste cellinjerna att transfekt. Den här metoden har vissa begränsningar som måste beaktas. Detta protokoll är inte effektivt för transfection med plasmid DNA, vilke...

Fetma anses vara en viktig riskfaktor för många metabola sjukdomar, inklusive insulinresistens (IR), typ 2-diabetes (T2D) och hjärt-kärlsjukdomar1. Nuvarande terapier har misslyckats med att stoppa den ständigt ökande prevalensen av dessa sjukdomar, och förvaltningen av IR av överviktiga och diabetiker patienter är fortfarande en viktig klinisk fråga. Fettvävnad spelar en avgörande roll i kontrollen av energihomeostas, och dess patologiska expansion under fetma bidrar till utvecklingen av IR och T2D2,3. Detta belyser behovet av att bättre förstå den molekylära mekanismen som är involverad i adipocyt dysfunktion för att utveckla nya terapier mot fetma-relaterade sjukdomar. Många forskningsstudier har undersökt rollen av proteinkodande RNAs i adipocyte fysiologi och deras samband med fetma.
På senare tid har upptäckten av icke-kodande RNAs (ncRNAs), särskilt mikro-RNAs (miR), förfalskat nya begrepp relaterade till mekanismen för reglering av genuttrycksprogram. Studier har visat att ncRNAs är viktiga tillsynsmyndigheter för adipocyte funktion, och att deras dysregulation spelar en viktig roll i metabola sjukdomar4. Således är manipulering av proteiner och ncRNAs i adipocyter avgörande för att dechiffrera sina roller i adipocyte funktion och deras inverkan på patologier såsom T2D. Att manipulera uttrycket av proteiner och ncRNAs in vivo såväl som i primära adipocyter är dock fortfarande mycket utmanande, vilket gynnar användningen av in vitro-adipocytmodeller.
Murin 3T3-L1 fibroblaster skiljer lätt till mogna, funktionella och insulin-lyhörda adipocyter, som är en väl karakteriserad cellinje som används för att studera adipocyt funktion (t.ex. insulin signalering, glukosupptag, lipolys och adipokines utsöndring)5,6,7,8,9,10. Dessa egenskaper gör 3T3-L1 adipocyter till en attraktiv modell för att modulera uttrycket av proteinkodning och nc-RNAs för att dechiffrera sin roll i adipocyte funktion och deras potentiella roll i fetma-relaterade sjukdomar. Tyvärr, medan 3T3-L1 fibroblaster är lätta att transfektiera med kommersiellt tillgängliga reagenser, är differentierade 3T3-L1-adipocyter en av de svåraste cellinjerna att transfektiera. Det är därför många studier manipulera gen uttryck i 3T3-L1 celler har fokuserat på adipocyte differentiering snarare än på adipocyte funktion.
Under lång tid var den enda effektiva tekniken för att transfekterade adipocyter elektroporation5, vilket är tråkigt, dyrt och kan orsaka cellskador. Detta dokument rapporterar en omvänd transfection teknik med hjälp av en gemensam transfection reagens, som minskar praktisk tid för transfection, har ingen effekt på cellens livskraft, och är mycket billigare än elektroporation. Detta protokoll är perfekt lämpat för transfection av siRNA och andra oligonucleotides såsom mikro-RNA härmar (miR härmar) och anti-miRs. Principen för omvända transfection protokollet är att inkubera transfection reagenset och oligonucleotides att bilda ett komplex i cell kultur plattan och sedan så mogna adipocyter i brunnarna. Därefter återansluter adipocyterna till den vidhäftande plåtytan i närvaro av oligonukleotider/ transfection reagenskomplex. Denna enkla, effektiva och billiga metodik möjliggör studier av rollen av proteinkodande RNAs och miRs i adipocyte funktion och deras potentiella roll i fetma-relaterade sjukdomar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

Förändring av adipocyte funktion bidrar till patogenesen vid metabola sjukdomar inklusive typ 2 diabetes och insulinresistens. Detta belyser behovet av att bättre förstå den molekylära mekanismen som är involverad i adipocyt dysfunktion för att utveckla nya terapier mot fetma-relaterade sjukdomar. Att modulera uttrycket av proteiner och mikro-RNAs i adipocyter är fortfarande mycket utmanande. Detta dokument beskriver ett protokoll för att skilja murin fibroblaster till mogna adipocyter och att modulera uttrycket av proteiner och mikro-RNAs i mogna adipocytes genom omvända transfection med hjälp av små-störande RNA (siRNA) och micro-RNA härma (miR härma) oligonucleotides. Detta omvända transfection protokoll innebär inkubation av transfection reagens och oligonucleotides att bilda ett komplex i cell kultur plattan till vilken mogna adipocytes läggs till. Adipocyterna får sedan sättas tillbaka till den vidhäftande plåtytan i närvaro av oligonukleotider/transfection reagenskomplex. Funktionella analyser såsom studie av insulinsignalering, glukosupptag, lipogenes och lipolys kan utföras på de transfekterade 3T3-L1 mogna adipocyterna för att studera effekten av protein- eller mikro-RNA-manipocytmanipulation på adipocytfunktionen.

Med hjälp av förfarandet för omvänd transfektion som beskrivs här för att modulera uttrycket av proteiner eller mikro-RNAs i 3T3-L1 adipocyter, har adipocyterna visat sig bevara sin morfologi efter transfekten (Figur 1B, C). 2 dagar efter transfection, adipocytes var väl spridd och fäst vid plattan och presenteras multilocular lipid droppar som är ett kännetecken för mogna 3T3-L1 adipocyter. Lipidhalten var inte annorlunda mellan d...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Presenteras här är ett protokoll för att leverera oligonukleotider såsom små-störande RNA (siRNA), mikro-RNA härmar (miRs) eller anti-mikro-RNA (anti-miR) i mogna adipocyter att modulera protein och mikro-RNA uttryck.

En adipocytcellkulturmodell för att studera effekten av protein- och mikro-RNA-modulering på adipocytfunktionen

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Detta protokoll gör det möjligt att manipulera proteiner, eller mikroRNA uttryck, i differentierade adipocyter att studera sin roll i adipocytes funktion. Denna omvända transfection metod är en enkel, ekonomisk och mycket effektiv metod för att transfect oligonucleotides till mus 3T3-L1 adipocyter. Denna metod kan också tillämpas på mänskliga preadipocyter differentierade i adipocyter.Melanie Gaudfrin, tekniker från vårt laboratorium, demonstrerar proceduren. Odla 3T3-L1 fibroblaster i 100 millimeters rätter i DMEM utan pyruvat, 25 millimolär glukos, 10% nyfött kalvserum och en procent penicillin och streptomycin. Placera disken i en vävnadskulturinkubator på 37 grader Celsius och sju procent koldioxid.Två dagar efter sammanflöde, ändra kulturmediet, ersätta det med DMEM utan pyruvat, 25 millimeters glukos, 10%FCS, och en procent penicillin och streptomycin kompletteras med 0,25 millimeter IBMX, 0,25 mikromolar dexametason, fem mikrogram per millimeter insulin och 10 micromolar rosiglitenon. Inkubera disken i två dagar. Två dagar senare, ersätt odlingsmediet med DMEM utan pyruvat, 25 millimolär glukos, 10%FCS, och en procent penicillin och streptomycin kompletteras med fem mikrogram per milliliter insulin och 10 mikromolar rosiglitazon och inkuberar i ytterligare två dagar.Mata cellerna varannan dag med DMEM utan pyruvat, 25 millimolär glukos, 10%FCS och en procent penicillin och streptomycin och håll cellerna i inkubatorn. En dag eller några timmar före transfekten, förbered en lösning av kollagen typ I vid 100 mikrogram per milliliter i 30% etanol från en stamlösning vid ett milligram per milliliter. Tillsätt 250 mikroliter kollagen per brunn på en 12-brunnsplatta eller 125 mikroliter per brunn på en 24-brunnsplatta och sprid lösningen över brunnens yta.Lämna plattan utan lock under kulspluvan tills kollagenet torkar. Tvätta den sedan två gånger med D-PBS. Pipett siRNA med förbättrat minsta väsentliga medium för att blanda och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur.Tillsätt transfection reagenset och det förbättrade minimala väsentliga mediet till siRNA och pipetten att blanda. Inkubera den i 20 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt sedan transfectionblandningen till varje brunn på den kollagenbelagda plattan.Tvätta cellerna i den 100 millimeters Petriskålen två gånger med D-PBS. Tillsätt 5x trypsin till cellerna, se till att täcka hela ytan med trypsin. Vänta i 30 sekunder och ta försiktigt bort trypsin.Inkubera Petri-skålen i fem till tio minuter vid 37 grader Celsius i inkubatorn. Tryck sedan på skålen för att lossa cellerna och undvik cellskador. Tillsätt 10 milliliter DMEM utan pyruvat, 25 millimolär glukos, 10%FCS och en procent penicillin och streptomycin för att neutralisera trypsin.Pipettera försiktigt mediet upp och ner för att lossa cellerna och homogenisera cellupphängningen. Räkna cellerna med hjälp av en Malassez-räknekammare eller en automatiserad cellräknare och justera cellernas koncentration till 0,625 miljoner celler per milliliter medium. Frö 800 mikroliter av cellupphängningen per brunn av en 12-brunnsplatta eller 400 mikroliter av cellfjädringen per brunn på en 24-brunnsplatta som innehåller transfectionblandningen.Inkubera plattorna i en cellkulturinkubator och stör dem inte i 24 timmar. Nästa dag, byt försiktigt ut supernatanten mot färsk DMEM utan pyruvat, 25 millimolär glukos, 10% FCS och en procent penicillin och streptomycin och returnera cellerna till inkubatorn. Typiska tidpunkter för att upptäcka mål knockdown efter siRNA eller miR leverans är 24 till 48 timmar för mRNA och 48 till 96 timmar för protein.Funktionella experiment kan utföras på transfekterade adipocyter inklusive insulinsignalering, glukosupptag, adipokinutsöndring, lipolys och lipogenes. Adipocytes har visat sig bevara sin morfologi efter transfection. Två dagar efter transfection presenterade adipocytes multilocular lipid droppar med lipid innehåll inte skiljer sig mellan transfected och icke-transfected adipocytes.MRNA uttryck för olika differentiering markörer var oförändrad i transfected celler jämfört med det i icke-transfected adipocytes. Protokollet för omvänd transfection är effektivt eftersom mer än 70% av adipocyterna transfecterades. Tre dagar efter transfection med siRNA mot Perilipin-1, mRNA nivån av Perilipin-1 hade minskat med 70%och proteinnivån med 63%Perilipin-1 uttryck analyserades också av fluorescens mikroskopi fyra dagar efter transfection och konstaterades ha minskat med 92%jämfört med dess uttryck i kontroll adipocytes.Omvänd-transfection av adipocytes med microRNA härma oligonucleotides att upp-reglera uttrycket av miR-34a visas här. Överuttryck av miR-34a ledde till minskningen av VAMP2 protein uttryck med 50%Knockdown av Perilipin-1 i 3T3-L1 adipocyter ledde till en ökning av basal lipolys medan överuttryck av miR-34a ledde till hämning av insulin-inducerad proteinkinas B fosforylering och glukos upptag. Det är viktigt att nå en hög nivå av adipocyter differentiering för att utföra transfection på nyligen differentierade adipocyter och noggrant övervaka behandlingen av adipocyter med trypsin.Efter transfektionen är det möjligt att utföra funktionella experiment på adipocyterna för att studera effekten av proteiner eller mikroRNA-manipulering på insulinsignalering, glukosupptag, lipogenes och lipolys.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Använda optokinetic svar att studera visuell funktion zebrafisk

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Analysera funktion Små GTPases genom mikroinjektion av plasmider till Polarized epitelceller

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Ett protokoll för identifiering av protein-proteininteraktioner Baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk märkning, immunoutfällning, kvantitativa masspektrometri och Affinity modulering

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirande jästprotein extraktion och rening för studien av funktion, interaktioner, och post-translationella modifieringar

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Ett<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur systemet studerar Thyroid Utveckling

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detektering av RNA-bindande proteiner genom<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA List i fettceller kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...