Name: an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

Bu çalışma INSERM, Université Côte d'Azur ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından gelecekteki Mükemmellik Laboratuvarı yatırımları (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ve Mükemmellik Girişimi (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) programı aracılığıyla desteklenmiştir. J.J., Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) ve Fondation Benjamin-Delessert'in bağışlarıyla desteklenmektedir. J.G. ANR-18-CE14-0035-01 tarafından desteklenir. J-F.T., ANR hibesi ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ve Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes tarafından finanse edilen C3M Görüntüleme Çekirdek Tesisi ve CBS IBiSA Mikroskopi ve Görüntüleme Platformu Côte d'Azur (MICA) tarafından da desteklenen Région PACA'ya teşekkür ediyoruz.

NOT: Protokolün tüm adımlarını laminer akış hücresi kültür başlığında gerçekleştirmek için steril teknikler kullanın. Tüm reaktifler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'nu görün.
1. Murine 3T3-L1 fibroblastlarının adipositlere farklılaştırılması
<ol><li>3T3-L1 fibroblastlarını kültür orta-DMEM'de 100 mm'lik yemeklerde piruvatsız, 25 mM glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve %1 penisilin ve streptomisinin yetişt...

<ol>
	<li>Kl&#246;ting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size,+but+not+obesity+itself,+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance.">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li><li>Bl&#252;her, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases.">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li><li>Lorente-Cebri&#225;n, S., Gonz&#225;lez-Muniesa, P., Milagro, F. I., Mart&#237;nez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity:+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets.">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes.">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2/prostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions.">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li><li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages.">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li><li>Jager, J., Gr&#233;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-{alpha}+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis.">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks.">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).</li><li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain.">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).</li></ol>

Bu makale olgun adipositlerin farklılaşması ve transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sunun. Bu ters transfeksiyon yöntemi, siRNA'lar, mikro RNA mimikleri ve anti-mikro-RNA'lar gibi oligonükleotidleri transfect etmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntemin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol plazmid DNA ile transfeksiyon için verimli değildir, bu da fonksiyon kazancı çalışmaları için bu tekniğin yararını sınırlar. 3T3-L1 hücre h...

Obezite, insülin direnci (IR), Tip 2 Diyabet (T2D) ve kardiyovasküler hastalıklar1dahil olmak üzere çok sayıda metabolik hastalık için önemli bir risk faktörü olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler bu hastalıkların sürekli yükselen yaygınlığını durduramadı ve obez ve diyabetik hastaların IR'lerinin yönetimi önemli bir klinik konu olmaya devam ediyor. Yağ dokusu enerji homeostazının kontrolünde çok önemli bir rol oynar ve obezite sırasında patolojik genişlemesi IR ve T2D2,3gelişimine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Birçok araştırma çalışması protein kodlayan RNA'ların adiposit fizyolojislerindeki rolünü ve obezite ile ilişkisini araştırmıştır.
Daha yakın zamanlarda, kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar), özellikle mikro RNA'ların (MIR'ler) keşfi, gen ekspresyon programlarının düzenleme mekanizmasıyla ilgili yeni kavramlar ortaya çıkarmıştır. Çalışmalar, ncRNA'ların adiposit fonksiyonunun önemli düzenleyicileri olduğunu ve düzensizliklerinin metabolik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını göstermiştir4. Bu nedenle, adipositlerdeki proteinlerin ve ncRNA'ların manipülasyonu, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve T2D gibi patolojiler üzerindeki etkilerini çözmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, in vivo proteinlerin ve ncRNA'ların yanı sıra birincil adipozitlerde ekspresyonunun manipüle edilmesi, in vitro adiposit modellerinin kullanımını destekleyen son derece zorlu olmaya devam etmektedir.
Murine 3T3-L1 fibroblastları, adiposit fonksiyonunu incelemek için kullanılan iyi karakterize edilmiş bir hücre hattı olan olgun, fonksiyonel ve insülin duyarlı adipositlere kolayca farklılaşır (örneğin, insülin sinyali, glikoz alımı, lipoliz ve adipokines salgısı)5,6,7,8,9,10. Bu özellikler, 3T3-L1 adipositlerini, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerini çözmek için protein kodlama ve nc-RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için çekici bir model haline getirir. Ne yazık ki, 3T3-L1 fibroblastların ticari olarak mevcut reaktifler kullanılarak transfect'i kolayken, farklılaştırılmış 3T3-L1 adipositler transfect için en zor hücre çizgilerinden biridir. Bu nedenle 3T3-L1 hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle eden çok sayıda çalışma, adiposit fonksiyonu yerine adiposit farklılaşmasına odaklanmıştır.
Uzun bir süre boyunca, adipositleri transfect etmek için tek etkili teknik elektroporasyon5, sıkıcı, pahalı ve hücre hasarına neden olabilir. Bu makale, transfeksiyon için uygulamalı zamanı azaltan, hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan ve elektroporasyondan çok daha ucuz olan ortak bir transfeksiyon reaktifi kullanarak ters transfeksiyon tekniğini rapor eder. Bu protokol, siRNA ve mikro-RNA mimikleri (miR mimikleri) ve anti-miR'ler gibi diğer oligonükleotidlerin transfeksiyonu için mükemmel bir şekilde uygundur. Ters transfeksiyon protokolünün prensibi, transfeksiyon reaktifini ve oligonükleotidleri kuluçkaya yatırarak hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak ve daha sonra olgun adipositleri kuyulara tohumlamaktır. Daha sonra, adipositler oligonükleotidler / transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden yapışır. Bu basit, verimli ve ucuz metodoloji, protein kodlayan RNA'ların ve MIR'lerin adiposit fonksiyonundaki rolünün ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerinin incelenmesine izin vermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>diluted to 5x with D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accell Non-targeting Pool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>D-001910-10-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s&#160; Modified Eagles&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-labeled Negative Control si-RNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free Glycerol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-131119</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Human Recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>219073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16010-159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td>
			<td>Horizon Discovery</td>
			<td>L-056623-01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin-1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3470</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9272</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKB Phospho Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td>Dilution : 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent (INTERFERin)</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>409-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Dilution : 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vamp2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5136</td>
			<td>Dilution : 0.1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-rna modulation on adipocyte function

Adiposit fonksiyonunun değiştirilmesi Tip 2 diyabet ve insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Adipositlerde proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunun modülei son derece zorlu olmaya devam etmektedir. Bu makalede, murine fibroblastları olgun adipositlere ayırt etmek ve küçük müdahaleci RNA (siRNA) ve mikro RNA taklit (miR mimik) oligonükleotidler kullanarak ters transfeksiyon yoluyla olgun adipositlerdeki proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ters transfeksiyon protokolü, olgun adipositlerin eklenme hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak için transfeksiyon reaktifinin ve oligonükleotidlerin inkübasyonunu içerir. Adipozitlerin daha sonra oligonükleotidler/ transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden dikilmesine izin verilir. Protein veya mikro-RNA manipülasyonunun adiposit fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için transfected 3T3-L1 olgun adipositler üzerinde insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz çalışması gibi fonksiyonel analizler yapılabilir.

3T3-L1 adipositlerdeki proteinlerin veya mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için burada açıklanan ters transfeksiyon prosedürünü kullanarak, adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir (Şekil 1B,C). Gerçekten de, transfeksiyondan 2 gün sonra, adipositler iyi yayılmış ve plakaya tutturulmuş ve olgun 3T3-L1 adipositlerin bir özelliği olan çok damarlı lipit damlacıkları sunulmu?...

Watch this Scientific Journal Video about An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function at JoVE.com

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.

Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Bu protokol, adipositler işlevindeki rollerini incelemek için proteinleri veya mikroRNA ekspresyonunu farklılaştırılmış adipositlerde manipüle etmeyi mümkün kılar. Bu ters transfeksiyon yöntemi, oligonükleotidleri fare 3T3-L1 adipositlerine geçirmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntem, adipositlere farklılaştırılmış insan preadipositlerine de uygulanabilir.Prosedürü gösteren melanie Gaudfrin, laboratuvarımızdan bir teknisyen. 3T3-L1 fibroblastlarını DMEM'de 100 milimetrelik yemeklerde piruvat, 25 milimolar glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan yetiştirin. Bulaşıkları 37 santigrat derecede ve yüzde yedi karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.Bir araya geldikten iki gün sonra, kültür ortamını değiştirin, yerine piruvatsız DMEM, 25 milimoler glikoz, % 10 FCS ve 0,25 milimoler IBMX, 0,25 mikromoler deksametazon, milimetre insülin başına beş mikrogram ve 10 mikromoler rosiglitazone ile desteklenmiş yüzde bir penisilin ve streptomisin kullanın. Bulaşıkları iki gün kuluçkaya yatır. İki gün sonra, kültür ortamını piruvatsız DMEM, 25 milimoler glikoz,% 10 FCS ve mililitre insülin başına beş mikrogram ve 10 mikromoler rosiglitazon ile desteklenmiş yüzde bir penisilin ve streptomisin ile değiştirin ve iki gün daha kuluçkaya yatırın.Hücreleri her iki günde bir dmem ile piruvatsız, 25 milimolar glikoz, %10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan besleyin ve hücreleri inkübatörde tutun. Transfeksiyondan bir gün veya birkaç saat önce, mililitre başına bir miligramda bir stok çözeltisinden% 30 etanolde mililitre başına 100 mikrogramda bir kolajen tipi I çözeltisi hazırlayın. 12 kuyu plakasının kuyusu başına 250 mikrolitre kollajen veya 24 kuyu plakasının kuyusu başına 125 mikrolitre ekleyin ve çözeltiyi kuyunun yüzeyine yayın.Kollajen kuruyana kadar plakayı kültür kaputunun altında kapaksız bırakın. Daha sonra D-PBS ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca karıştırmak ve kuluçkaya yatırmak için geliştirilmiş minimum esansiyel ortama sahip siRNA pipeti.Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş minimal esansiyel ortamı karıştırmak için siRNA ve pipete ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır. Daha sonra transfeksiyon karışımını kollajen kaplı plakanın her kuyusuna ekleyin.100 milimetre Petri kabındaki hücreleri D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5x tripsin ekleyin, tüm yüzeyi tripsinle kapladiğinizden emin olun. 30 saniye bekleyin ve tripsinleri dikkatlice çıkarın.Petri kabını inkübatörde 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika kuluçkaya bırakın. Ardından hücreleri ayırmak için çanağa dokunun ve hücre hasarını önlayın. Tripini nötralize etmek için piruvatsız 10 mililitre DMEM, 25 milimolar glikoz, % 10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisin ekleyin.Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı boruya takın. Bir Malassez sayım odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonu mililitre orta başına 0.625 milyon hücreye ayarlayın. 12 kuyulu bir plakanın kuyusu başına hücre süspansiyonunun 800 mikrolitresini veya transfeksiyon karışımını içeren 24 kuyulu bir plakanın kuyusu başına 400 mikrolitre hücre süspansiyonunu tohumlayın.Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatantı piruvat, 25 milimoler glikoz,% 10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan taze DMEM ile dikkatlice değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri verin. SiRNA veya miR teslimatından sonra hedef devirmeyi tespit etmek için tipik zaman noktaları mRNA için 24 ila 48 saat ve protein için 48 ila 96 saattir.İnsülin sinyali, glikoz alımı, adipokin salgılama, lipoliz ve lipogenez dahil olmak üzere transfected adipositler üzerinde fonksiyonel deneyler yapılabilir. Adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir. Transfeksiyondan iki gün sonra, adipositler transfected ve transfected olmayan adipositler arasında farklı olmayan lipid içeriğine sahip çok damarlı lipit damlacıkları sundular.Çeşitli farklılaşma belirteçlerinin mRNA ekspresyasyonu transfected hücrelerde transfected olmayan adipositlere kıyasla değişmedi. Ters transfeksiyon protokolü, adipositlerin %70'inden fazlası transkraklı olduğu için etkilidir. Perilipin-1'e karşı siRNA ile transfeksiyondan üç gün sonra Perilipin-1'in mRNA seviyesi %70, protein seviyesi ise %63 Perilipin-1 ekspresyonu transeksiyondan dört gün sonra floresan mikroskopi ile analiz edilmiş ve kontrol mezhebislerindeki ifadesine göre %92 oranında azaldığı tespit bulunmuştur.MiR-34a ekspresyonunu yukarı düzenlemek için mikroRNA taklit eden oligonükleotidler ile adipositlerin ters transfeksiyonları burada gösterilmiştir. MiR-34a'nın aşırı ekspresyonu VAMP2 protein ekspresyonunun %50 azalmasına yol açtı Perilipin-1'in 3T3-L1 adipositlerinde devrilmesi bazal lipolizde artışa yol açarken, miR-34a'nın aşırı ekspresyonu insülin kaynaklı protein kinaz B fosforilasyonunun ve glikoz alımının inhibisyonuna yol açtı. Yeni farklılaştırılmış adipositler üzerinde transfeksiyon gerçekleştirmek ve tripin ile adipositlerin tedavisini dikkatle izlemek için yüksek düzeyde adiposit farklılaşmasına ulaşmak önemlidir.Transfeksiyondan sonra, proteinlerin veya mikroRNA manipülasyonunun insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz üzerindeki etkisini incelemek için adipositler üzerinde fonksiyonel deneyler yapmak mümkündür.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...