Name: maximum isometric tetanic force measurement of the tibialis anterior muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat at JoVE.com

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke del National Institutes of Health con il premio Numero RO1 NS 102360. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC A334818).
1. Taratura del trasduttore di forza
<ol><li>Assicurarsi che il computer sia correttamente collegato al dispositivo daq (Multifunctional I/O Data Acquisition) USB-6009, che a sua volta deve essere collegato al trasduttore di forza. NOTA: Altri ceppi e specie di ratti possono richiedere un trasduttore di forza delle cellule di carico diverso,...

Questo protocollo descrive un metodo precedentemente convalidato per acquisire misurazioni ITF massime accurate del muscolo TA nel modello di ratto32. Il recupero della massima forza dopo trattamenti sperimentali di ricostruzione nervosa è di primario interesse nell'ambiente clinico in quanto dimostra che il nervo non solo si è rigenerato, ma ha anche fatto connessioni di lavoro con il muscolo bersaglio. L'ITF può essere utilizzato in un piccolo modello di nerve gap, come il ratto sciatico nerv...

La perdita della funzione motoria a seguito di lesioni traumatiche del nervo periferico ha un impatto significativo sulla qualità della vita e sullo statosocioeconomico dei pazienti 1,2,3. La prognosi di questa popolazione di pazienti rimane scarsa a causa di miglioramenti minimi nelle tecniche chirurgiche nel corso degli anni4. La riparazione epineurale diretta end-to-end senza tensione forma la ricostruzione chirurgica gold standard. Tuttavia, nei casi con intervalli nervosi estesi l'interposizione di un innesto nervoso autologo si è dimostratasuperiore a 5,6. La morbilità del sito donatore associato e la limitata disponibilità di innesti nervosi autologi hanno imposto la necessità di tecniche alternative7,8.
Modelli animali sperimentali sono stati utilizzati per chiarire il meccanismo di rigenerazione dei nervi periferici e per valutare i risultati di una varietà di opzioni di trattamento ricostruttivo efarmacologico 8,9. Il modello di nervo sciatico del ratto è il modello animale10 più frequentemente utilizzato. Le loro piccole dimensioni li rendono facili da maneggiare e ospitare. A causa del loro potenziale neuroregenerativo superlativo, il tempo ridotto tra l'intervento e la valutazione dei risultati può comportare costirelativamente inferiori 11,12. Altri vantaggi del suo uso includono somiglianze morfologiche con le fibre nervose umane e l'alto numero di studi comparativi / storici13. Sebbene questi ultimi debbano essere avvicinati con cautela, poiché un'ampia varietà di diverse misure di risultato tra gli studi rende difficile confrontarei risultati 14,15,16,17,18.
Le misure di risultato per valutare la rigenerazione nervosa vanno dall'elettrofisiologia all'istomorfometria, ma questi metodi implicano una correlazione ma non misurano necessariamente direttamente ilritorno della funzione motoria 14,15. Le fibre nervose rigeneranti potrebbero non creare connessioni appropriate che possono causare una sopravvalutazione del numero di connessioni funzionali14,15,19,20. La misurazione migliore e clinicamente più rilevante per dimostrare la corretta reinnervazione degli organi finali rimane la valutazione della funzionemuscolare 21,22,23. La creazione di strumenti di valutazione delle funzioni motorie per i modelli animali è, tuttavia, impegnativa. ha descritto per la prima volta l'analisi della pista da passeggio, che da allora è stato il metodo più frequentemente utilizzato per valutare il recupero funzionale negli studi sperimentali sui nervi periferici21,24,25, 26,27,28. L'analisi della pista da passeggio quantifica l'indice funzionale sciatico (SFI) sulla base delle misurazioni delle impronte delle zampe dei ratti checamminano 21,29. Le principali limitazioni dell'analisi dei sentieri, come le contratture, l'automutilazione, lo sbavatura della stampa e la scarsa correlazione con altre misure di reinnervazione, hanno reso necessario l'uso di altri parametri per la quantificazione delrecupero funzionale 30,31.
In precedenti studi su ratti Lewis32 e conigli neozelandesi33, abbiamo convalidato la misurazione della forza tetanica isometrica (ITF) per il muscolo tibiale anteriore (TA) e dimostrato la sua efficacia nella valutazione del recupero muscolare dopo diversi tipi diriparazione nervosa 34,35,36,37,38,39. Il muscolo TA è adatto a causa delle sue dimensioni relativamente grandi, innervazione da parte del ramo peroneale del nervo sciatico e proprietà biochimiche ben chiarite40,41,42,43. Quando la lunghezza muscolare (forza di precarico) e i parametri elettrici sono ottimizzati, l'ITF fornisce una variabilità side-to-side del 4,4% e del 7,5% rispettivamentenei ratti 32 e nei conigli 33.
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato della misurazione ITF nel modello del nervo sciatico del ratto, inclusa una descrizione approfondita della necessaria pianificazione pre-chirurgica, approccio chirurgico e dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare TA distale. Utilizzando valori predeterminati per l'intensità e la durata dello stimolo, verrà definita la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell'impulso di stimolo. Con questi quattro parametri, l'ITF può essere successivamente misurato in modo coerente e accurato.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>G130203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Kirshner wires</td>
			<td>Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Tissue Forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>MTK-6801226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar electrode cables</td>
			<td>Grass Instrument, Quincy, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar stimulator device</td>
			<td>Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tip Applicators</td>
			<td>Cardinal Health, Waukegan, IL, USA</td>
			<td>C15055-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Mosquito forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>MTK-1201112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer MDB-2.5</td>
			<td>Transducer Techniques, Temecula, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponges 4x4</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA, USA</td>
			<td>2733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ground cable</td>
			<td>Grass Instrument, Quincy, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ</td>
			<td>42023-115-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView Software</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical curved forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>JFA-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissors</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>SAS-15R-8-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical straight forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>JF-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>AG-124426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade No. 15</td>
			<td>Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA</td>
			<td>371115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Body Skin Stapler</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA, USA</td>
			<td>8886803512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subminiature electrode</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Nerve Stimulator</td>
			<td>Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA</td>
			<td>9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell Isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>H961J19A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testing platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetontomy Scissors</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>ASIM-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX</td>
			<td>779026-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Base Holder</td>
			<td>Noga Engineering &#38; Technology Ltd., Shlomi, Isreal</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Attached clamp is custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weight (10 g)</td>
			<td>Denver Instruments, Denver, CO, USA</td>
			<td>820010.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weight (20 g)</td>
			<td>Denver Instruments, Denver, CO, USA</td>
			<td>820020.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weight (50 g)</td>
			<td>Denver Instruments, Denver, CO, USA</td>
			<td>820050.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada</td>
			<td>1XYL002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maximum isometric tetanic force measurement of the tibialis anterior muscle in the rat

Le lesioni nervose traumatiche si traducono in una sostanziale perdita funzionale e difetti nervosi segmentali spesso richiedono l'uso di innesti nervosi di interposizione autologa. A causa della loro limitata disponibilità e della morbilità laterale associata del donatore, molti studi nel campo della rigenerazione nervosa si concentrano su tecniche alternative per colmare un gap nervoso segmentale. Al fine di indagare i risultati delle opzioni di trattamento sperimentale chirurgico o farmacologico, il modello di nervo sciatico del ratto è spesso usato come saggio biologico. Esistono una varietà di misurazioni dei risultati utilizzate nei modelli di ratto per determinare l'estensione della rigenerazione nervosa. La forza massima di uscita del muscolo bersaglio rimane il risultato più rilevante per la traduzione clinica di terapie sperimentali. La misurazione isometrica della forza della contrazione muscolare tetanica è stata precedentemente descritta come una tecnica riproducibile e valida per valutare il recupero motorio dopo la lesione nervosa o la riparazione sia nei modelli di ratto che di coniglio. In questo video, forniremo un'istruzione passo-passo di questa procedura inestimabile per la valutazione del recupero funzionale del muscolo anteriore tibiale in un modello di difetto del nervo sciatico del ratto utilizzando parametri ottimizzati. Descriveremo i necessari preparati pre-chirurgici oltre all'approccio chirurgico e alla dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare anteriore tibialis. La tecnica di misurazione della forza tetanica isometrica sarà dettagliata. Viene spiegato determinare la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell'impulso di stimolo e misurare la massima contrazione muscolare tetanica.

Cinque parametri vengono utilizzati per misurare la misurazione ITF. Questi includono tensione muscolare (forza di precarico), intensità di stimolo (tensione), frequenza dell'impulso di stimolo, durata dello stimolo di 0,4 ms e un ritardo di 2 ms. Prima di misurare l'ITF, la tensione muscolare ottimale deve essere determinata utilizzando due contrazioni muscolari a contrazione singola ad un'intensità di 2 V durante il test dei parametri. Questi stimoli causano la dorsiflessione della zampa e producono un segnale di usc...

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Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat

La valutazione del recupero motorio rimane la misura di risultato di riferimento negli studi sperimentali sui nervi periferici. La misurazione della forza tetanica isometrica del muscolo tibiale anteriore nel ratto è uno strumento inestimabile per valutare gli esiti funzionali dopo la ricostruzione dei difetti nervosi sciatici. I metodi e le sfumature sono dettagliati in questo articolo.

Misurazione massima della forza tetanica isometrica del muscolo anteriore tibiale nel ratto

Traumatic nerve injuries result in substantial functional loss and segmental nerve defects often necessitate the use of autologous interposition nerve ...

L'obiettivo generale di questo video è quello di fornire un'istruzione passo-passo su come misurare la forza tetanica isometrica del muscolo tibiale anteriore nel ratto, un metodo riproducibile e convalidato per valutare il recupero funzionale dopo la lesione del nervo sciatico o la ricostruzione. Il modello di difetto del nervo sciatico del ratto viene spesso utilizzato per valutare le opzioni di trattamento sperimentale per la lesione del nervo periferico. Al fine di replicare il trattamento gold standard per i difetti nervosi segmentali nei ratti, di solito un segmento di 10 millimetri del nervo sciatico viene asportato invertito in posizione come autoinnesto di interposizione.Nei trattamenti sperimentali, il gap nervoso può essere ricostruito usando altre tecniche, come un allografto nervoso o un condotto. Per la traduzione clinica di queste tecniche sperimentali, è importante misurare l'estensione del recupero della funzione motoria nel muscolo bersaglio. In questo video, descriveremo come farlo per il muscolo anteriore tibiale stimolando il comune nervo peroneico.Avviare la procedura calibrando il trasduttore di forza. Posizionare la piattaforma di prova, che contiene due blocchi di legno sul tavolo della procedura. Assicurarsi che il computer sia collegato a un dispositivo di acquisizione dati, che a sua volta deve essere collegato al trasduttore di forza.Collegare verticalmente il trasduttore di forza alla piattaforma di prova utilizzando la sua base sottovuoto. Fissare l'anello al morsetto per i pesi di calibrazione. Aprire il software ed eseguire lo strumento virtuale per la misurazione della forza tetanica isometrica e selezionare una nuova calibrazione.La calibrazione inizia con peso zero sul loop. Consecutivamente, con 10, 20, 30 e 50 grammi di peso e raccogliere i dati tra ogni misurazione del peso. Seleziona il processo una volta raccolte tutte e cinque le misurazioni del peso.In caso di calibrazione riuscita, il grafico dovrebbe rappresentare una curva lineare positiva, accettare i valori per continuare. Rimuovere il loop e i pesi dal morsetto e riposizionare il trasduttore di forza orizzontalmente sulla piattaforma di prova. Selezionare zero per completare il processo di calibrazione.Dopo aver introdotto l'anestesia usando una camera isoflurana, radersi gli arti posteriori e posizionare il topo su una pastiglia riscaldante a 37 gradi. Anestetizzato profondamente il topo con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail di chetamina e xiazina e somministrare da cinque a sei millilitri di salina sottocutaneamente per mantenere un adeguato stato di idratazione durante l'intera procedura. Posizionare il topo su un lato e creare un'incisione posterolaterale della coscia da 2 a 3 centimetri, parallela al femore.Al fine di esporre il ramo nervoso peroneale del nervo sciatico, separare il muscolo bicipite femoris dal gluteo massimo e dal muscolo vastus lateralis sezionando il piano fasciale tra questi muscoli. Posizionare il riavvolgitore tra i muscoli separati per avere un migliore accesso al nervo sciatico. Identificare la triforcazione del nervo sciatico nel nervo peroneale, nel nervo tibiale e nel nervo surale.Utilizzare una forcep curva per sezionare il ramo nervoso peroneale dal tessuto circostante. In caso di incertezza, pizzicare delicatamente il nervo e osservare se la risposta motoria è dorsiflessione della zampa posteriore. Per esporre il muscolo tibiale anteriore, posizionare il topo sulla schiena e incidere l'aspetto anterolaterale dell'arto inferiore, partendo dall'articolazione del ginocchio e scendendo sul lato mediodorsale della zampa.Isolare il tendine muscolare anteriore distatale tibiale dal tessuto circostante. Usa unazanza per sezionare senza mezzi termini il tendine fino al suo inserimento e tagliare il tendine nel punto di inserimento. Il primo passo nel processo di misurazione della forza tetanica isometrica è l'ottimizzazione della lunghezza muscolare, nota anche come test dei parametri.Trasferire il topo insieme alla pastiglia di riscaldamento sulla piattaforma di prova utilizzare due fili k da 1 millimetro per fissare l'arto posteriore al blocco di legno. Praticare il primo k-wire attraverso il femore distale e il secondo attraverso la caviglia. Attaccare il supporto per l'elettrodo di sottominiatura alla piattaforma di prova e posizionare il morsetto intorno alla posizione del nervo peroneale.Inserire il cavo di terra nei muscoli circostanti e riposizionare il riavvolgitore per l'accesso al nervo peroneale. Attaccare i cavi dell'elettrodo bipolare all'elettrodo della sottominiatura e agganciare l'elettrodo attorno al nervo peroneale utilizzando le forcep curve. Utilizzare il morsetto sul supporto per fissare la posizione dell'elettrodo della sottominiatura.Bloccare il tendine muscolare anteriore distatale tibiale al morsetto che è attaccato al trasduttore di forza. Per una misurazione accurata, è importante che il trasduttore di forza sia posizionato parallelamente al decorso del muscolo anteriore tibiale. Assicurarsi che il cavo di riferimento del ratto sia posizionato distale sull'elettrodo della sottominiatura e sul cavo dell'elettrodo attivo nero prossimale.Collegare entrambi questi cavi e il cavo di terra a un dispositivo di stimolatore bipolare. Per l'ottimizzazione della lunghezza muscolare, regolare le impostazioni dello stimolatore bipolare con un ritardo di due millisecondi di durata di 0,4 millisecondi e un'intensità di stimolo di 2 volt. Una volta che tutto è ben collegato, impostare il software sul test dei parametri e premere la raccolta trigger.Aumentare la lunghezza muscolare, nota anche come precarico, spostando il braccio della leva attaccato al trasduttore di forza. Il precarico è il grande kit sopra il grafico sullo schermo. Inizia da un precarico da 10 grammi e dai due singole contrazioni premendo il pulsante di stimolo sul simulatore bipolare verso il basso.L'uscita sarà visibile sul grafico come due forze di uscita di picco e il ratto dovrebbe mostrare la dorsiflessione della zampa. Premi di nuovo la raccolta dei trigger per misurare questi due picchi. Di solito, il programma rileva automaticamente i picchi.In tal caso, la stampa accetta di continuare. Se il software, tuttavia, non riconosce i picchi, fare clic sul declino e selezionare manualmente i picchi. Le due forze di uscita saranno mediate in una forza di uscita di picco media, che verrà presentata sul lato destro del grafico.La forza muscolare attiva può quindi essere calcolata sottraendo il precarico da questa forza media di uscita di picco. Utilizzare incrementi di 10 grammi di precaricamento fino a quando non viene identificato il precarico che risulta nella massima forza muscolare attiva. Ogni misurazione di precaricamento deve essere effettuata allo stesso modo premendo il pulsante di stimolo sul simulatore bipolare due volte verso il basso.Per rendere più facile questo processo, annotare la forza muscolare attiva per ogni precarico e interrompere l'aumento del precarico non appena la forza muscolare attiva scende. In questo esempio, la forza muscolare attiva massima è l'interruttore a un precarico di 20 grammi. Il precarico che produce la più alta forza muscolare attiva, in altre parole, la lunghezza muscolare ottimale, verrà utilizzato per misurare la forza tetanica isometrica.Rilasciare la tensione sul muscolo e idratare il muscolo con salina riscaldata. Attendere cinque minuti prima di iniziare la misurazione della forza tetanica isometrica. Durante l'attesa, regolare l'intensità dello stimolo a 10 volt, condurre la durata su 0,4 millisecondi e il ritardo su due millisecondi.La forza tetanica isometrica sarà misurata usando frequenze crescenti, a partire da 30 Hertz. Passare dal test dei parametri al test di frequenza sul software e spostare il trasduttore di forza alla lunghezza ottimale predeterminata del muscolo. Ora indurre la stimolazione tetanica premendo il pulsante di stimolo sul simulatore bipolare verso l'alto per un massimo di cinque secondi o fino a quando non viene chiaramente osservato un picco di forza.La curva tetanica ottimale aumenta bruscamente, quindi ha una fase di plateau in lenta diminuzione seguita da una forte diminuzione. Documentare il picco di forza per ogni frequenza di stimolo. Lasciare riposare il muscolo a zero precaricare per cinque minuti e idratare il muscolo con salina riscaldata tra ogni misura.Usa incrementi di 30 Hertz e una risoluzione di 10 Hertz fino a quando non si osserva l'altopiano massimo della forza. Questa sarà la forza tetanica isometrica. Utilizzare graffette o suture per chiudere la pelle e ripetere l'intera procedura all'arto posteriore contralto.Eutanasia dell'animale dopo aver terminato la misurazione sul lato contralaterale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare in modo riproducibile la forza muscolare tetanica isometrica nei ratti che hanno subito la ricostruzione del nervo sciatico.

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