Name: maximum isometric tetanic force measurement of the tibialis anterior muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat at JoVE.com

A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número RO1 NS 102360. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os procedimentos animais foram realizados com aprovação do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC A334818).
1. Calibração do transdutor de força
<ol><li>Certifique-se de que o computador está devidamente conectado ao dispositivo de aquisição de dados de I/O multifuncional USB-6009 (DAQ), que por sua vez deve ser conectado ao transdutor de força. NOTA: Outras cepas de ratos e espécies podem exigir um transdutor de força de célula de carga diferente, po...

Este protocolo descreve um método previamente validado para a aquisição de medições máximas de ITF precisas do músculo TA no modelo de rato32. A recuperação da força máxima após tratamentos experimentais de reconstrução nervosa é de interesse primário no cenário clínico, pois prova que o nervo não só se regenerou, mas também fez conexões de trabalho com o músculo alvo. O ITF pode ser usado em um pequeno modelo de lacuna nervosa, como o modelo de nervo ciático de rato<sup cl...

A perda da função motora após lesão nervosa periférica traumática tem impacto significativo na qualidade de vida e no status socioeconômico dos pacientes1,2,3. O prognóstico dessa população de pacientes permanece ruim devido a melhorias mínimas nas técnicas cirúrgicas ao longo dos anos4. O reparo peridural direto sem tensão forma a reconstrução cirúrgica padrão-ouro. No entanto, nos casos com lacunas nervosas prolongadas, a interposição de um enxerto nervoso autólogo provou ser superior a5,6. A morbidade do local do doador associado e a limitada disponibilidade de enxertos nervosos autólogos impuseram a necessidade de técnicas alternativas7,8.
Modelos experimentais de animais têm sido utilizados para elucidar o mecanismo de regeneração nervosa periférica e avaliar os resultados de uma variedade de opções de tratamento reconstrutivo e farmacológico8,9. O modelo de nervo ciático de rato é o modelo animal10mais usado. Seu pequeno tamanho os torna fáceis de manusear e casa. Devido ao seu potencial neuroregenerativo superlativo, o tempo reduzido entre a intervenção e a avaliação dos desfechos pode resultar em custos relativamente menores11,12. Outras vantagens de seu uso incluem similaridades morfológicas às fibras nervosas humanas e o alto número de estudos comparativos/históricos13. Embora este último deva ser abordado com cautela, uma vez que uma ampla variedade de diferentes medidas de desfecho entre estudos dificulta a comparação dos resultados14,15,16,17,18.
As medidas de desfecho para avaliar a regeneração nervosa variam da eletrofisiologia à histomorfometria, mas esses métodos implicam uma correlação, mas não medem necessariamente diretamente o retorno da função motora14,15. A regeneração das fibras nervosas pode não fazer conexões adequadas que possam causar uma superestimação do número de conexões funcionais14,15,19,20. A melhor e clinicamente mais relevante medida para demonstrar a reinervação correta dos órgãos finais permanece a avaliação da função muscular21,22,23. Criar ferramentas de avaliação de funções motoras para modelos animais é, no entanto, desafiador. Medinaceli et al. descreveram pela primeira vez a análise da pista de caminhada, que desde então tem sido o método mais utilizado para avaliar a recuperação funcional em estudos experimentais de nervo periférico21,24,25,26,27,28. A análise da pista de caminhada quantifica o índice funcional ciático (SFI) com base em medidas de pegadas de ratos ambulantes21,29. Grandes limitações da análise da pista de caminhada, como contraturas de dedos, automutilação, mancha da impressão e má correlação com outras medidas de reinervação, necessitaram do uso de outros parâmetros para quantificação da recuperação funcional30,31.
Em estudos anteriores em ratos de Lewis32 e coelhos neozelandeses33, validamos a medida da força tetanica isométrica (ITF) para o músculo tibialis anterior (TA) e demonstramos sua eficácia na avaliação da recuperação muscular após diferentes tipos de reparação nervosa34,35,36,37,38,39. O músculo TA é bem adequado devido ao seu tamanho relativamente grande, inervação pelo ramo peroneal do nervo ciático e propriedades bioquímicas bem elucidadas40,41,42,43. Quando o comprimento muscular (força de pré-carga) e os parâmetros elétricos são otimizados, o ITF fornece uma variabilidade lado a lado de 4,4% e 7,5% nos ratos32 e coelhos33, respectivamente.
Este artigo fornece um protocolo detalhado da medição da ITF no modelo de nervo ciático de ratos, incluindo uma descrição completa do necessário planejamento pré-cirúrgico, abordagem cirúrgica e dissecção do nervo peronal comum e do tendão muscular distal. Utilizando valores predeterminados para a intensidade e duração do estímulo, será definido o comprimento e a frequência de pulso de estímulo ideal. Com esses quatro parâmetros, o ITF pode ser posteriormente medido de forma consistente e precisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA</td>
			<td>G130203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Kirshner wires</td>
			<td>Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Tissue Forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>MTK-6801226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar electrode cables</td>
			<td>Grass Instrument, Quincy, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bipolar stimulator device</td>
			<td>Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tip Applicators</td>
			<td>Cardinal Health, Waukegan, IL, USA</td>
			<td>C15055-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Mosquito forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>MTK-1201112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer MDB-2.5</td>
			<td>Transducer Techniques, Temecula, CA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponges 4x4</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA, USA</td>
			<td>2733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ground cable</td>
			<td>Grass Instrument, Quincy, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ</td>
			<td>42023-115-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView Software</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical curved forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>JFA-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissors</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>SAS-15R-8-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical straight forceps</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>JF-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>AG-124426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade No. 15</td>
			<td>Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA</td>
			<td>371115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Body Skin Stapler</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA, USA</td>
			<td>8886803512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subminiature electrode</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Nerve Stimulator</td>
			<td>Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA</td>
			<td>9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell Isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>H961J19A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testing platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetontomy Scissors</td>
			<td>ASSI, Westbury, NY, USA</td>
			<td>ASIM-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX</td>
			<td>779026-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Base Holder</td>
			<td>Noga Engineering &#38; Technology Ltd., Shlomi, Isreal</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Attached clamp is custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weight (10 g)</td>
			<td>Denver Instruments, Denver, CO, USA</td>
			<td>820010.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weight (20 g)</td>
			<td>Denver Instruments, Denver, CO, USA</td>
			<td>820020.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weight (50 g)</td>
			<td>Denver Instruments, Denver, CO, USA</td>
			<td>820050.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada</td>
			<td>1XYL002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maximum isometric tetanic force measurement of the tibialis anterior muscle in the rat

Lesões nervosas traumáticas resultam em perda funcional substancial e defeitos nervosos segmentais muitas vezes exigem o uso de enxertos nervosos de interposição autólogos. Devido à sua disponibilidade limitada e morbidade lateral associada, muitos estudos no campo da regeneração nervosa focam em técnicas alternativas para preencher uma lacuna nervosa segmental. A fim de investigar os resultados das opções de tratamento experimental cirúrgico ou farmacológico, o modelo de nervo ciático de ratos é frequentemente usado como um bioensaio. Há uma variedade de medidas de desfecho usadas em modelos de ratos para determinar a extensão da regeneração nervosa. A força máxima de saída do músculo alvo continua sendo o resultado mais relevante para a tradução clínica de terapias experimentais. A medição da força isométrica da contração muscular tetanica foi descrita anteriormente como uma técnica reprodutível e válida para avaliar a recuperação motora após lesão nervosa ou reparo em modelos de ratos e coelhos. Neste vídeo, forneceremos uma instrução passo-a-passo deste procedimento inestimável para avaliação da recuperação funcional do músculo tibialis anterior em um modelo de defeito no nervo ciático de rato usando parâmetros otimizados. Descreveremos as preparações pré-cirúrgicas necessárias, além da abordagem cirúrgica e dissecção do nervo peronal comum e do tendão muscular anterior tíibal. A técnica de medição da força tetanica isométrica será detalhada. A determinação do comprimento muscular ideal e da frequência de pulso de estímulo é explicada e a medição da contração muscular tetanica máxima é demonstrada.

Cinco parâmetros são usados para medir a medição itf. Estes incluem tensão muscular (força de pré-carga), intensidade de estímulo (tensão), frequência de pulso de estímulo, duração de estímulo de 0,4 ms e um atraso de 2 ms. Antes de medir o ITF, a tensão muscular ideal deve ser determinada usando duas contrações musculares de contração única a uma intensidade de 2 V durante o teste do parâmetro. Esses estímulos causam dorsiflexão da pata e produzem um sinal de saída no gráfico no VI (<strong clas...

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Maximum Isometric Tetanic Force Measurement of the Tibialis Anterior Muscle in the Rat

A avaliação da recuperação motora continua sendo a medida de desfecho de referência em estudos experimentais de nervos periféricos. A medição da força tetanica isométrica do músculo tibialis anterior no rato é uma ferramenta inestimável para avaliar os resultados funcionais após a reconstrução de defeitos do nervo ciático. Os métodos e nuances estão detalhados neste artigo.

Medição máxima da Força Tetanica Isométrica do Músculo Tibialis Anterior no Rato

Traumatic nerve injuries result in substantial functional loss and segmental nerve defects often necessitate the use of autologous interposition nerve ...

O objetivo geral deste vídeo é fornecer uma instrução passo-a-passo sobre como medir a força tetanica isométrica do músculo tibialis anterior no rato, um método reprodutível e validado para avaliar a recuperação funcional após lesão ou reconstrução do nervo ciático. O modelo de defeito do nervo ciático do rato é frequentemente usado para avaliar opções de tratamento experimental para lesão nervosa periférica. A fim de replicar o tratamento padrão-ouro para defeitos nervosos segmentais em ratos, geralmente um segmento de 10 milímetros do nervo ciático é excisado invertido no lugar como um autoenxerto de interposição.Em tratamentos experimentais, a lacuna nervosa pode ser reconstruída usando outras técnicas, como um aoenxerto nervoso ou conduíte. Para a tradução clínica dessas técnicas experimentais, é importante medir a extensão da recuperação da função motora no músculo alvo. Neste vídeo, descreveremos como fazer isso para o músculo tibialis anterior estimulando o nervo peroneal comum.Inicie o procedimento calibrando o transdutor de força. Posicione a plataforma de teste, que contém dois blocos de madeira na mesa de procedimento. Certifique-se de que o computador está conectado a um dispositivo de aquisição de dados, que por sua vez deve ser conectado ao transdutor de força.Conecte o transdutor de força verticalmente à plataforma de teste usando sua base de vácuo. Aperte a alça ao grampo para os pesos de calibração. Abra o software e execute o instrumento virtual para medição de força tetanica isométrica e selecione nova calibração.A calibração começa com zero peso na alça. Consecutivamente, com 10, 20, 30 e 50 gramas de peso e coletar os dados entre cada medição de peso. Selecione o processo uma vez que todas as cinco medidas de peso são coletadas.Em caso de uma calibração bem sucedida, o gráfico deve retratar uma curva linear positiva, aceitar os valores para continuar. Remova o laço e os pesos do grampo e reposicione o transdutor de força horizontalmente na plataforma de teste. Selecione zero para terminar o processo de calibração.Depois de induzir anestesia usando uma câmara de isoflurano, raspe um traseiro e coloque o rato em uma almofada de aquecimento de 37 graus. Anestinado profundamente o rato com uma injeção intraperitoneal de um coquetel de cetamina e xilazina e administrar cinco a seis mililitros de soro fisiológico subcutâneamente para manter um estado adequado de hidratação durante todo o procedimento. Coloque o rato de lado e crie uma incisão de coxa de 2 a 3 centímetros, paralela ao fêmur.A fim de expor o ramo nervoso peronal do nervo ciático, separe o músculo bíceps femoral do glúteo máximo e vasto músculo lateralis dissecando o plano fascial entre esses músculos. Coloque o retrátil entre os músculos separados para ter melhor acesso ao nervo ciático. Identifique a trifurcação do nervo ciático no nervo peroneal, no nervo tibialis e no nervo sural.Use um fórceps curvo para dissecar o ramo nervoso peronal do tecido circundante. Em caso de incerteza, aperte suavemente o nervo e observe se a resposta motora é dorsiflexão da pata traseira. Para expor o músculo tibialis anterior, coloque o rato em suas costas e incisee o aspecto anterolateral do membro inferior, começando na articulação do joelho e descendo para o lado mediodorsal da pata.Isole o tendão muscular anterior distal tibialis do tecido circundante. Use um fórceps de mosquito para dissecar sem rodeios o tendão até sua inserção e cortar o tendão no ponto de inserção. O primeiro passo no processo de medição da força tetanica isométrica é a otimização do comprimento muscular, também conhecido como teste de parâmetro.Transfira o rato juntamente com a almofada de aquecimento para a plataforma de teste use dois fios k de 1 milímetro para fixar a plataforma traseira para o bloco de madeira. Perfurar o primeiro fio K através do fêmur distal e o segundo através do tornozelo. Conecte o suporte do eletrodo de subminatura à plataforma de teste e posicione o grampo ao redor da localização do nervo peroneal.Insira o cabo moído nos músculos circundantes e coloque de volta o retrátil para ter acesso ao nervo peroneal. Conecte os cabos de eletrodo bipolar ao eletrodo de subminatura e gancho o eletrodo ao redor do nervo peroneal usando os fórceps curvos. Use o grampo no suporte para fixar a posição do eletrodo de subminatura.Fixar o tendão muscular anterior distal tibialis ao grampo que está ligado ao transdutor de força. Para uma medição precisa, é importante que o transdutor de força esteja posicionado paralelamente ao curso do músculo tibialis anterior. Certifique-se de que o cabo de referência do rato está colocado distal no eletrodo de subminatura e no cabo eletrodo ativo preto proximal.Conecte esses cabos e o cabo de terra a um dispositivo estimulador bipolar. Para otimização do comprimento muscular, ajuste as configurações do estimulador bipolar a um atraso de dois milissegundos de duração de 0,4 milissegundos e uma intensidade de estímulo de 2 volts. Uma vez que tudo esteja bem conectado, defina o software no teste do parâmetro e pressione a coleta de gatilho.Aumente o comprimento muscular, também conhecido como pré-carga, movendo o braço da alavanca preso ao transdutor de força. A pré-carga é o grande kit em cima do gráfico na tela. Comece com um pré-carregamento de 10 gramas e dê dois contrações únicas pressionando o botão de estímulo no simulador bipolar para baixo.A saída será visível no gráfico como duas forças de saída de pico e o rato deve mostrar dorsiflexão da pata. Pressione a coleta de gatilho novamente para medir esses dois picos. Normalmente, o programa detecta automaticamente os picos.Nesse caso, a imprensa aceita continuar. Se o software, no entanto, não reconhecer os picos, clique no declínio e selecione manualmente os picos. As duas forças de saída serão mediadas para uma força média de saída de pico, que será apresentada no lado direito do gráfico.A força muscular ativa pode então ser calculada subtraindo a pré-carga desta força média de saída de pico. Use incrementos de 10 gramas de pré-carga até que a pré-carga que resulte na força muscular ativa máxima seja identificada. Cada medição de pré-carga deve ser conduzida da mesma forma pressionando o botão de estímulo no simulador bipolar duas vezes para baixo.Para facilitar esse processo, anote a força muscular ativa para cada pré-carga e pare de aumentar a pré-carga assim que a força muscular ativa cair. Neste exemplo, a força muscular ativa máxima é a troca a uma pré-carga de 20 gramas. A pré-carga que produz a maior força muscular ativa, ou seja, o comprimento muscular ideal, será usada para medir a força tetanica isométrica.Libere a tensão no músculo e hidrate o músculo com soro fisiológico aquecido. Espere cinco minutos antes de iniciar a medição da força tetanica isométrica. Enquanto espera, ajuste a intensidade de estímulo para 10 volts, leve a duração em 0,4 milissegundos e o atraso em dois milissegundos.A força tetanica isométrica será medida usando frequências crescentes, começando em 30 Hertz. Mude do teste do parâmetro para o teste de frequência no software e mova o transdutor de força para o comprimento muscular ideal pré-determinado. Agora induza a estimulação tetanica pressionando o botão de estímulo no simulador bipolar para cima por um máximo de cinco segundos ou até que um pico de força seja claramente observado.A curva tetanic ideal aumenta acentuadamente, em seguida, tem uma fase de planalto lentamente diminuindo seguido de uma diminuição acentuada. Documente o pico de força para cada frequência de estímulo. Deixe o músculo descansar a zero de pré-carga por cinco minutos e hidratar o músculo com soro fisiológico aquecido entre cada medição.Use incrementos de 30 Hertz e uma resolução de 10 Hertz até que o plano de força máxima seja observado. Esta será a força tetanica isométrica. Use grampos ou suturas para fechar a pele e repetir todo o procedimento ao retrocesso contralateral.Eutanize o animal após terminar a medição no lado contralateral. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir reproduibavelmente a força muscular tetanica isométrica em ratos que passaram por reconstrução do nervo ciático.

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