Name: finite element modelling of a cellular electric microenvironment
Uploaded: 2021-05-18T12:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av det 4-årige Wellcome Trust PhD-programmet i kvantitativ og biofysisk biologi

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Den foreslåtte protokollen antyder en ensartet modelleringsløsning for naturlige og kunstige stillaser og fremhever behovet for å vurdere nanostrukturen til fibrøse stillaser når man inspiserer effekten av EF på celler frøet på slike materialer. Selv om en grov tilnærming til EF-intensiteten (elektrodepotensialforskjell delt på avstanden mellom elektrodene) ville føre til at vi forventet en feltstyrke på 100 mV/mm, forutsier simuleringer stasjonære feltstyrker opptil 30 % høyere i forskjellige områder av matten (figur 5). Dette resultatet bør være av interesse for ES-eksperimentdesign og datatolkning, da celledød kan skyldes for sterke EFer. Å eksponere det elektriske mikromiljøet vil muliggjøre en direkte sammenheng mellom ES og cellulær utvikling. Mens flere studier presenterer detaljert morfologianalyse av de brukte stillasene33,43,59, undersøker de ikke samspillet mellom strukturen, materialets elektriske egenskaper og EF. Denne protokollen kan aktivere denne koblingen, som parametere som fiberradius, belegglagtykkelse, avstand mellom fibre og elektriske egenskaper til komponentmaterialene kan endres i henhold til hvert eksperiment ved å endre globale definisjoner i trinn 1.2 og 1.3. Derfor kan tilpassede 3D-romlig løste ladnings- og nåværende tetthetsforutsigelser gjøres for både statiske og dynamiske ES-regimer.
Stillasdesignoptimalisering kan målrettes gjennom RNC- og RNCd-modellene med brede parameterområdeutforskninger, og skalerer de foreslåtte morfologiene eller delene av dem. Alternativt kan andre stillaskonfigurasjoner undersøkes med den foreslåtte protokollen ved å endre arraytypene fra lineær til tredimensjonal i avsnitt 1.6.5 og tilpasse stillasgeometri i avsnitt 1.6.2. Stillasoptimalisering kan imidlertid ikke gjøres uten mål. Mens for vevsteknikk er hovedfokuset celle skjebne, et klarere bilde på hvilke stimuli er dens viktigste determinanter er avgjørende hvis den pålitelige kontrollen er ønsket. Ladning og nåværende tetthet er gode beskrivelser av cellulære elektriske mikromiljø da de viser samspillet mellom EF og de elektriske egenskapene til de forskjellige komponentmaterialene til komplekse stillaser som ECM. Protokollen viser hvordan man beregner spådommer for disse beregningene gitt en nanofibrøs stillasgeometri og fremhever viktigheten av justeringsvinkelen til fibrene med EF. Spådommer om ladning og nåværende tetthet kan da knyttes til cellulær utvikling, og dermed kan stillas- og ES-regimer optimaliseres for spesifikke oppgaver.
Interessant nok viser en studie at EF-eksponering genererte mekanisk stress mer enn dobbelt i styrke i komposittfilmer med nanofiber vinkelrett på den eksterne EF sammenlignet med filmer med parallell justering60. Det rapporterte mekaniske stresset kan være et resultat av Coulomb-krefter som virker mellom ladede fibre, spådd av de grove modellsimuleringene (RC, RNC, RNCd) (Figur 6). Selv om disse simuleringene kan være nyttige for å undersøke denne hypotesen, må det bemerkes at de rapporterte eksperimentelle resultatene ble oppnådd i et system med kapasitiv kobling, og simuleringen presenterer direkte kobling. 
En begrensende faktor for fremtidig mulig bruk av protokollen for å estimere et mobilinngangssignal er parameterusikkerhet. Geometriske usikre parametere er belegglagtykkelse og avstand mellom fiberkjerner. Den første kan utledes ved å finne verdien som fører til en bulkimpedans som kan valideres eksperimentelt. Den andre kan trekkes ut fra høyoppløselige materialskanninger. Parametere som beskriver materialets fysiske egenskaper påvirkes også av usikkerhet. Imidlertid varierer den elektriske ledningsevnen og dielektriske konstanten til eksemplifiserte materialer langt mer enn eksperimentell målepresisjon (Tabell 2). De rapporterte effektene vil derfor opprettholdes til tross for moderate målefeil.
Resultatene viser hvordan ikke nok modellkompleksitet kan skjule relevant informasjon. Det er viktig å erkjenne at protokollen simulerer en forenklet versjon av det fysiske fenomenet som finner sted, da det ikke tar hensyn til den forskjellige arten av materialer som er involvert i prosesslederen (elektroder), halvleder (belegg), dielektriske (fiberkjerner) og elektrolytiske (omkringliggende substans) - som er i stand til å påvirke ladetransport. Dette problemet kan redegjøres for i fremtidige modellutvidelser ved å legge til energioverføringsforsinkelser ved grensesnittene (dvs. faradiske reaksjoner) og iontransportforsinkelser i elektrolytten. Å legge til kompleksitet bør imidlertid styres av eksperimentell validering, da en enkel modell som reproduserer det meste av det som observeres, er mer nyttig enn en bemerkelsesverdig nøyaktig en som tilfører lite mer informasjon, men som er dypt følsom for mange bestanddelers usikkerhet.
Som målet med vevsteknikk er å lage bioreaktorer som ikke bare etterligner ett eller to aspekter av in vivo-miljøer, men replikerer og kontrollerer alle cellulære utviklingssignaler61, elektromagnetiske og mekaniske i silicomodeller samt modeller for varmeoverføring mellom bioreaktorkomponenter må kombineres. I en etterfølgende modelleringsfase kan koblingsfenomener mellom disse interaksjonene som ohmisk oppvarming, elektrolytisk væskestrøm, morfologiske stillasdeformasjoner som svar på elektrisk stimulering60 og piezoelektrisitet62 også tilsettes. Modeller bør imidlertid bare slås sammen etter at hver enkelt er eksperimentelt validert. På denne måten kan vi få en bedre forståelse av hver komponents innflytelse i det cellulære mikromiljøet, og hvordan stimuli kan optimaliseres. 
Hvis den foreslåtte modellen er eksperimentelt validert, kan den kombineres med modeller av biologiske celler - figur 1. Ladetetthetsmønstre og moduleringer kan asymmetrisk påvirke spesifikke ionpumpers aktivitet, støtfeste til fiberen av proteiner som driver membranadhesjon63 og dermed lede migrasjon, spredningsmønstre og morfogenese64. Å utforske disse hypotesene er veien fremover for å forstå mekanismene som underbygger vev og celleresponser på ES.

ES er bruk av EFer med sikte på å kontrollere biologiske celler og vev. Mekanismen er basert på den fysiske stimulansen som transduseres til cellen når biomolekylene inne og rundt den blir utsatt for en eksternt generert spenningsgradient. Ladede partikler er engasjert i en organisert bevegelse styrt av Coulombs lov, og genererer dragkrefter på de uladede partiklene. Den resulterende væskestrømningen og ladefordelingen endrer celleaktiviteter og funksjoner som vedheft, sammentrekning, migrasjon, orientering, differensiering og spredning1 når cellen forsøker å tilpasse seg endringen i mikromiljøet.
Siden EFer er kontrollerbare, ikke-invasive, ikke-farmakologiske og vist å ha en effektiv innvirkning på essensiell celleadferd, er ES et verdifullt verktøy for vevsteknikk og regenerativ medisin. Det har blitt brukt til å lede neural2, skjelett3, hjertemuskel4,bein5 og hud6 utvikling. Videre, da det forbedrer iontoforese7, brukes den som en alternativ eller komplementær behandling til konvensjonelle farmakologiske. Effektiviteten i smertebehandling er fortsatt debattert som høyere kvalitet kliniske studier er ventet8,9,10. Likevel ble det ikke rapportert noen bivirkninger, og det har potensial til å forbedre pasientvelferden11,12,13,14,15.
Mens bare kliniske studier kan gi en endelig dom for effekten av en prosedyre, er in vitro og i silicomodeller pålagt å informere utformingen av forutsigbar ES-behandling, da de gir sterkere kontroll over et bredere spekter av eksperimentelle forhold. Den undersøkte kliniske bruken av ES er benregenerering16,17, gjenoppretting av denerverte muskler18,19, axonal regenerering etter kirurgi20,21, smertelindring22, sårheling23,24,25 og iontohoretisk legemiddellevering26. For at ES-enheter skal bli mye introdusert på alle mulige målapplikasjoner, har kliniske studier ennå ikke etablert sterkere bevis for effektiv behandling. Selv i domener der både in vivo dyr og menneskelige studier konsekvent rapporterer positive resultater, det store antallet rapporterte metoder kombinert med for lite veiledning om hvordan du velger mellom dem og høy oppkjøpspris avskrekker klinikere fra å investere i ES-enheter27. For å overvinne dette kan ikke målvevet lenger behandles som en svart boks (grense for in vivo-eksperimenter), men må ses på som en kompleks synergi av flere delsystemer (figur 1).
Flere ES-eksperimenter har blitt utført in vitro gjennom årene28,29,30,31,32,33,34. De fleste av disse karakteriserer bare ES gjennom spenningsfallet mellom elektrodene delt på avstanden mellom dem - en grov tilnærming av den elektriske feltstørrelse. Imidlertid påvirker selve det elektriske feltet bare ladede partikler, ikke celler direkte. Også når flere materialer er interposed mellom enheten og cellene, kan det hende at den grove tilnærmingen ikke holder.
En bedre karakterisering av inngangssignalet krever et klart syn på hvordan stimulansen transduserer til cellen. Hovedmetoder for å levere ES er direkte, kapasitiv og induktiv kobling35,36. Enheter for hver metode varierer med elektrodetype (stang, planar eller vikling) og plassering i forhold til målvevet (i kontakt eller isolert)35. Enheter som brukes in vivo for lengre behandlinger må være bærbare, og dermed elektroder og de fleste ganger energikilden er enten implantert eller festet til huden som sår dressinger eller elektroaktive flekker. Den genererte spenningsgradienten fortrenger ladede partikler i behandlingsområdet.
Ettersom det påvirker den resulterende ladede partikkelstrømmen i nærheten av cellene, er stillasstruktur av største betydning i utformingen av ES-protokoller. Ulike ladetransportkonfigurasjoner oppstår hvis plattformmaterialet, synteseteknikken, strukturen eller orienteringen i forhold til spenningsgradientendringen. In vivo, tilgjengeligheten og bevegelsen av ladede partikler påvirkes ikke bare av celler, men også av kollagennettverket og interstitiell væske som komponerer den støttende ECM. Konstruerte stillaser brukes i økende grad til bedre å gjenskape naturlige cellemikromiljø in vitro1,35. Samtidig er ECM et komplekst naturlig stillas.
Kunstige stillaser er basert på metaller, ledende polymerer og karbon, konstruert med fokus på å balansere biokompatibilitet med elektrokjemisk ytelse og langsiktig stabilitet36. En allsidig stillastype er elektrospunfibrøs matte som tilbyr en kontrollerbar nanoskala topografi. Dette kan konstrueres for å ligne ECM, og dermed levere lignende mekaniske signaler som hjelper regenerering av et bredt spekter av vev37. For å påvirke ES betydelig, må mattene til en viss grad være ledende. Ledende polymerer er imidlertid vanskelige å elektrospinne og blanding med isolerende bærere begrenser ledningsevnen til de resulterende fibrene38. En løsning polymeriserer en ledende monomer på overflaten av en dielektrisk fiber, noe som resulterer i god mekanisk styrke og elektriske egenskaper til sluttproduktet38. Et eksempel er belegg silke elektrospunfibre med den semi ledende PEDOT-PSS39. Kombinasjonen av mekaniske og elektromagnetiske signaler akselererer nevrittvekstenbetydelig 40,41,42. Neurites følger stillasfibre justering, og forlenger mer etter eksponering for en EF parallelt med fibrene enn til en vertikal en43. På samme måte fremmer justering av fibrøse stillaser til EF også myogen modning33.
ECM består hovedsakelig av fibrøse formende proteiner44, av den kollagentypen er jeg den viktigste bestanddelen i alle dyrevev bortsett fra brusk (rik på kollagen type II)44. Tropocollagen (TC), trippel spiralformet konformasjon av polypeptidstrenger, er strukturmotivet til kollagenfibriler45. Transmisjonselektronmikroskopi- og atomkraftmikroskopibilder av kollagenfibriler viser et D-periodisk båndmønster46 forklart av Hodge &Petruska modell47 som vanlige matriser av TC-hull og overlapper45. Sener består av en justert kollagenaktig fibrillarmatrise skjermet av en ikke-kollagenisk svært hydrofil proteoglykanmatrise48,49. Dekorin er en liten leucinrik proteoglykan (SLRP) i stand til å binde gapområdene til kollagenfibriler og koble seg til andre SLRPer gjennom deres glykosaminoglykan (GAG) sidekjeder49. Studier gjort på sener viser at deres elektriske egenskaper endres betydelig når hydrert50,51, ladetransportmekanisme som endres fra protonisk til ionisk når hydreringsnivået øker51. Dette antyder at elektrisk ledning langs en kollagen type I fibril kan aktiveres av en Decorin-vannbelegg, med gap og overlapping regioner som har forskjellige elektriske ledningsevner og dielektriske konstanter.
Ettersom identisk rekreasjon av ECM av kunstige stillaser er usannsynlig, synes kunnskapen som produserer synergi mellom in vivo og in vitro aktivert av overførbare resultater å være i en blindvei. Ved silicomodellering muliggjør ikke bare oversettelse mellom de to, men gir også viktige fordeler ved å karakterisere de ukjente prosessene som er involvert i ES. Sammenligning av in vivo-observasjonene med in vitroen kan gi informasjon om koblingsstyrken mellom målvevet og resten av organismen, men avdekker ikke gjeldende kunnskapsgrenser. Det ukjente kan eksponeres ved å observere forskjellen mellom hva som forventes å skje basert på dagens kunnskap og hva som skjer. I silico eksperimenter basert på matematisk modellering tillater splitting prosessen i kjente og ukjente delprosesser. På denne måten kommer fenomener som ikke er gjort rede for i modellen, frem når i silico spådommer sammenlignes med in vitro- og in vivo-eksperimenter.
Forming og testing hypoteser om underliggende mekanisme(er) for hvordan celler og vev påvirkes av elektriske felt hindres av det store antallet parametere52 som må testes separat. Hvis du vil definere representative eksperimentelle forhold, må ES-prosessen deles i delprosesser (figur 1) og dominerende inndatasignaler som påvirker cellevirkemåten, må identifiseres. Modeller som representerer grunnleggende fysiske effekter av ES på celler beskriver domenet som parrer EF med cellen - som av ladede partikler53. Oppførselen til partikler utvendig til cellen avhenger av mikromiljøet og kan undersøkes separat fra cellen. Det dominerende inngangssignalet for cellen er delsettet av ES-enhetsutganger som forårsaker størst grad av variasjon i celleresponsen. Det minste delsettet av de fullstendige eksperimentelle parameterne som kan generere variasjoner i alle de dominerende celleinndatasignalene, kan brukes til å redusere parameterområdedimensjonen og antall testtilfeller.
Inngangen til den biologiske ES-målmodellen må være et delsett av utgangssignalene produsert av ES-enheten som er nyttige for å beskrive de fysiske effektene av ES på celler. En enkel bioreaktor med direkte kobling har samme struktur som elektrolytiske elektrokjemiske celler. Modeller av disse viser den primære (regnskap for løsningsmotstand), sekundær (også regnskap for faradiske reaksjoner) eller tertiær (også regnskap for iondiffusjon) nåværende tetthetsfordeling. Ettersom kompleksitet betyr beregningskostnader, er den enkleste modellen mest egnet for parameterromsutforskning. Simuleringer av fibrøse kompositter motivert av materialegenskaper54 fokuserer på bulkmaterialeegenskaper som følge av kompleks mikroarkitektur, og kan derfor ikke beskrive lokale effekter av EF-eksponering. Eksisterende i silicomodeller, motivert av ES, fokuserer på den biologiske prøven, det være seg en enkelt celle nedsenket i et homogent medium55,56,57eller komplekst vev med homogent ekstracellulært rom58. Lading og gjeldende tetthet (figur 2) kan fungere som grensesnittsignaler mellom modeller av ES-enheten og den biologiske prøven, eller mellom forskjellige komponenter i ES-enheten. Den foreslåtte FEM-baserte protokollen bruker ligningene beskrevet i figur 2 og ble brukt til å studere hvordan stillasavhengige parametere kan brukes til å modulere disse to signalene, uavhengig av EF generert av et direkte koblingsoppsett. Resultatene understreker at det er nødvendig å ta hensyn til stillas eller ECM elektriske egenskaper når man undersøker hvordan ES påvirker målceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Comsol multiphysics 5.2 AC/DC module</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td>-</td>
			<td>FEM modelling software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

finite element modelling of a cellular electric microenvironment

Kliniske studier viser at elektrisk stimulering (ES) er en potensiell terapi for helbredelse og regenerering av ulike vev. Å forstå mekanismene for cellerespons når de utsettes for elektriske felt kan derfor lede optimaliseringen av kliniske applikasjoner. In vitro-eksperimenter tar sikte på å bidra til å avdekke disse, og tilbyr fordelen av bredere inngangs- og utgangsområder som kan vurderes etisk og effektivt. Fremskrittene i in vitro-eksperimenter er imidlertid vanskelige å reprodusere direkte i kliniske omgivelser. Hovedsakelig er det fordi ES-enhetene som brukes in vitro, skiller seg betydelig fra de som er egnet for pasientbruk, og banen fra elektrodene til de målrettede cellene er forskjellig. Det er derfor ikke enkelt å oversette in vitro-resultatene til in vivo-prosedyrer. Vi legger vekt på at det cellulære mikromiljøets struktur og fysiske egenskaper spiller en avgjørende rolle i de faktiske eksperimentelle testforholdene og antyder at tiltak for ladedistribusjon kan brukes til å bygge bro mellom in vitro og in vivo. Tatt i betraktning dette viser vi hvordan i silico endelig element modellering (FEM) kan brukes til å beskrive cellulær mikromiljø og endringene generert av elektrisk felt (EF) eksponering. Vi fremhever hvordan EF-parene med geometrisk struktur for å bestemme ladedistribusjon. Deretter viser vi effekten av tidsavhengige innganger på ladebevegelser. Til slutt demonstrerer vi relevansen av vår nye i silicomodellmetodikk ved hjelp av to casestudier: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-etylendioxythiophene) poly (styrenesulfonat) (PEDOT-PSS) stillaser og (ii) in vivo kollagen i ekstracellulær matrise (ECM).

Den foreslåtte modellen beskriver egenskapene til en komposittmatte med parallelle fibre, nedsenket i et ledende stoff og utsatt for en eksternt generert elektrisk potensiell gradient. Simuleringer viser at det å ta hensyn til de ulike komponentene i et stillas er viktig på en mikroskala og utforske hvordan endring i justeringsvinkel (inngangssignal) av fibrene til EF kan generere variasjon i strøm og ladetetthet (utgangssignaler) i nærheten av fibrene.
Fem forskjellige geometriske kompleksitetsstadier presenteres, som hver har en effekt på simuleringsresultatet: glatt ledende plate (SC), glatt plate med ikke-ledende innebygde fibre (SNC), grov ledende kompositt (RC), grovkompositt med ikke-ledende innebygde fibre (RNC), grov kompositt med ikke-ledende innebygde fibre og to typer periodisk belegg (RNCd) (Figur 3). Del 1.5 i protokollen presenterer trinnene for import av geometriene i et prosjekt, og del 1.6 viser hvordan du bygger disse trinnvis. De to første modellene tar ikke hensyn til overflatemorfologi. SC og RC tar ikke hensyn til de dielektriske egenskapene til fiberkjernen. RNC er den foreslåtte modellen for nanofibrøs kunstige stillaser, mens RNCd er den foreslåtte modellen for et ECM-segment.
Minimering av beregningskostnader ble oppnådd ved å redusere ES-enhetsgeometrien til et modellenhetsvolum som representerer mikromiljøet. Mens en ES-enhet og stillas bredde og lengde lett kan være i størrelsesorden noen få centimeter, er diameteren til de inneholdende fibrene vanligvis lavere enn en mikron. Her bruker vi et stillaskutt som kan sammenlignes med fiberdiameteren for å redusere beregningskostnadene forårsaket av størrelsesforholdet og markere effekten av stillasets fibrøse natur på det elektriske mikromiljøet. Resten av ES-enheten er erstattet med elektriske potensielle grensebetingelser valgt, slik at en grov tilnærming for størrelsen på det elektriske feltet er 100 V / m, en ofte rapportert stimuleringsparameter. Videre antas et enhetsvolum med fem parallelle fibre - som den som brukes i simuleringer, presentert i figur 3 - å være representativ for en hel planar fibrøs matte. Tre typer fibre kan skille seg ut i en 1D-matrise: innvendig sentral (med stillasets langsgående symmetriplan som deler dem i halvparten), innvendig forbigående (med lateral overflate omgitt av andre fibre, men med asymmetriske sider) og eksteriør (på kanten av stillaset). Fem er det minste antallet fibre som kreves for å inkludere alle de tre definerte typene.
Størrelsen på modellnettelementet krever spesiell oppmerksomhet, da det kan påvirke simuleringsresultatene og dermed ikke utsette viktige effekter ( Figur4). Dette er en generell regel for elementmetoden og en implikasjon av Nyquist-Shannon-prøvetakingteoremet. Jo raskere de essensielle simuleringssignalene svinger i rommet, jo mindre må maskeelementene være for å produsere en lojal representasjon av fenomenet. På den annen side, jo mindre elementet er, desto større er det totale antallet modellbyggeblokker og beregningskostnaden. Den adaptive nettforbedringen som er satt opp i pkt. 2.1, er en god og facile-metode for å balansere disse motstridende målene ved å redusere elementstørrelsen bare der og så lenge denne operasjonen gir en betydelig endring.
En modell som er for forenklet, kan mislykkes i å presentere viktige effekter (Figur 5,6). Simuleringer viser at det å ta høyde for overflatemorfologi og stillaskomponentens elektriske egenskaper ikke er overflødig i å forutsi elektriske mikromiljø. Mens overflatemorfologi har en direkte innvirkning på den stasjonære EF (sammenlign SC og SNC med RC, RNC og RNCd), viser en sammenligning mellom RC- og RNC-spådommer at ikke-konduktive fiberkjerner forsterker denne effekten. Fra modellteknologiske mikromiljø på nanofibrøse stillaser er SC-, SNC- og RC-modellene dermed sub-optimale. Det er imidlertid god praksis å øke kompleksiteten trinnvis, ettersom sammenligninger mellom de ulike stadiene bidrar til å indikere hvilke funksjoner som gir opphav til bestemte effekter.
Modellkompleksitet påvirker strøm- og ladetetthetsendring med fiberjustering til EF. Den foreslåtte protokollen bidrar til å markere effekten (Figur 5,6). Mens SC-modellen ikke viser noen variasjon i de foreslåtte beregningene når justeringen til den elektriske potensielle gradienten endres, spår RNC-modellsimuleringene en kraftig kontrast mellom matteenheten med fibre justert til EF og den med fibre vinkelrett (Figur 7). Når de ikke-ledende kjernene kommer i veien for den nåværende strømmen, danner de periodiske dammer som fører til vekslende områder med høy og lav ladetetthet.
Dynamiske ES-regimer kan simuleres med tidsavhengige studier. Videoer i supplerende filer viser spådommer laget for en sinusformet inngangsspenning på en full kunstig stillasmodell (RNC), med fibre parallelt eller vinkelrett på den elektriske potensielle gradienten. Små strømmer langs fibrene vinkelrett på EF vises når ladningen frigjøres fra stillaset når EF-størrelsen avtar. Dette viser at stimulering kan skje ikke bare mens den eksterne EF er til stede, men også rett etter at den er koblet fra - Se tilleggsfiler for videoer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61928/61928fig01.jpg"> Figur 1: Hierarkisk blokkdiagram over modellering - fordeler og begrensninger ved modellering med in vivo og i silicomodeller. Blokker fargemerker blokker på samme hierarkiske nivå. Lavere rangeringsblokker er inkludert i høyere rangering. Blokker slagfargemerker muligheten til å inkludere blokken i en bestemt type modell - kobling med andre systemblokker har ikke gul i strøket, da de ikke er komponenter for in vitro-modeller. Kuler fungerer som ventiler og betyr kontrollerbarhet av blokken. Når en ventil er PÅ, kan signal passere gjennom alle pilbaner i de underordnede delsystemene som har fargen på ventilen i strøket. Tolkning av diagrammet: ES-prosessen består av stimuleringsanordningen og biologisk mål, hver med flere sammenkoblede deterministiske eller stokastiske delprosesser som ikke kan skilles in vivo eller in vitro, og dermed har de ingen rød eller gul ventil. Stokastiske prosesser griper også inn i grensesnittet mellom simuleringsenheten og den biologiske prøven når de begge stimuleres. En in vitro-modell decouples systemet av interesse (dvs. hudsegment) fra resten av organismen. Dermed kan bare iboende prosesser i interessesystemet toppet av stokastiske prosesser av forskjellig natur observeres. De ulike iboende prosessene som er involvert, kan imidlertid ikke stimuleres og identifiseres separat. De i silico-modellene er parametriske for kjente komponenter - deres oppførsel forventes å være av en viss form - og ikke-parametrisk for det ukjente - da det ikke er noen mekanistisk grunn til å gi troverdighet til en viss ekstrapolering. Alle in silico-komponenter kan simuleres separat eller i forskjellige kombinasjoner, slik at skildringen av forskjellig hypotese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/61928fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61928/61928fig02.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> Figur 2: (A) Coulombs lov (B) Elektrisk potensielt felt- og mobilsondelading (C) Elektrisk strøm (D) Ladetetthet (E) Gjeldende tetthet (F) Kontinuitetsligning (G) Charge conservation law. (A) Elektrisk ladede stasjonære partikler q og Q samhandler elektrostatisk gjennom Coulombs kraft <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq01.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> . (B1) Hver ladede partikkel Q genererer et skalarfelt kalt elektrisk potensial i alle posisjoner <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq02.jpg" style="margin-bottom: -5px;"> i rommet: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq03.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> . Det maksimale arbeidet som kreves for å flytte en annen ladet partikkel q fra sin posisjon <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq04.jpg" style="margin-bottom: -5px;"> er produktet mellom ladningen q og det elektriske potensialet generert av Q i posisjon <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq04.jpg" style="margin-bottom: -5px;"> . Det elektriske potensialfeltet generert av flere partikler er summen av feltene som genereres av hver enkelt partikkel. (B2) Et stasjonært felt med faste generatorpartikler q og Q, virker med en <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq05.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> på en sondepartikkel med positiv ladning qp. Som svar beveger qp seg for å minimere posisjonens elektriske potensial. For å beskrive bevegelsen til qp, kan man utlede <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq05.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> og det elektriske feltet fra det elektriske <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq06.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> potensialfeltet: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq07.jpg" style="margin-bottom: -15px;"> . (C) Flere mobile positivt ladede sondepartikler som er jevnt frigjort i et stasjonært elektrisk felt, følger en organisert bevegelse. For å spore ladekonfigurasjonen uten å spore hver partikkel, kan man spesifisere på hvert øyeblikk: (D) hvordan rommet er okkupert av partikler, tildele en ladetetthet <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq08.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> til hvert uendelig volum, i henhold til Gauss lov, og (E) hvordan partikler passerer gjennom grenseflatene mellom nærliggende uendelige volumer, og tildeler en nåværende tetthet <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq09.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> til hver grense i henhold til Ohms lov. (F) Ladning og nåværende tetthet utvikler seg koavhengig i henhold til kontinuitetsligningen, da ikke-jevn partikkelforskyvning fører til enten akkumulering eller tap av partikler i et bestemt volum. (G) Innenfor et isolert system hersker charge bevaringsloven, og det er ingen tilsig eller utstrømning av ladede partikler. Notasjoner som brukes:- q, Q, qp ladning og navn på den ladede partikkelen; <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq10.jpg" style="margin-bottom: -10px;"> - Euklidisk norm for posisjonsvektoren; k - Coulombs konstante; <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61928/61928eq11.jpg" style="margin-bottom: -5px;"> - gradient operator, εen - absolutt tillattheten av medium; σ - ledningsevne av medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/61928fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61928/61928fig03.jpg"> Figur 3: Fem forskjellige nivåer av kompleksitet for en fibrøst matte. SC- glatt med ledende innebygde fibre, den enkleste modellen, som ikke står for overflatemorfologi eller forskjellige egenskaper til de bestanddelene; SNC- glatt med ikke-ledende innebygde fibre; RC- grov med ledende innebygde fibre, som står for overflatemorfologi, men ikke for forskjellige komponentegenskaper; RNC- grov med ikke-ledende innebygde fibre, full foreslått modell av nanofibrøs kunstige stillaser; RNCd- grov med ikke-ledende innebygde fibre belagt med to forskjellige materialer, full foreslått modell for et ark med kollagenfibre. Lengdeenhet brukt: nanometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/61928fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61928/61928fig04.jpg"> Figur 4: Eksempelresultater av adaptiv nettingforbedring og den resulterende ladetettheten etter simuleringen. (Venstre) Automatisk generert nett med ekstra grove tetraedrale elementer; (Høyre) Innledende nett adaptivt raffinert under stasjonær studie; Mindre elementer er nødvendig for et nøyaktig resultat i områdene der simulerte signaler har brå romlige endringer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/61928fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61928/61928fig05.jpg"> Figur 5: Fiberjusteringsvinkel til elektrisk potensiell gradient påvirker EF-styrken i omkringliggende cellekulturmedier når det redegjøres for nok kompleksitet. SC, SNC, RC, RNC og RNCd er de forskjellige kompleksitetsnivåene for den fibrøse mattemodellen presentert i figur 3. Vertikal akse markerer justeringsvinkelen til fibrene til den elektriske potensielle gradienten. Abstrakte elektroder omtalt - nederste side med høyt elektrisk potensial og overside med lavt elektrisk potensial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/61928fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61928/61928fig06.jpg"> Figur 6: Fiberjusteringsvinkel til elektrisk potensiell gradering påvirker plassladningstettheten i omkringliggende cellekulturmedier når nok kompleksitet er gjort rede for. SC, SNC, RC, RNC og RNCd er de forskjellige kompleksitetsnivåene for den fibrøse mattemodellen presentert i figur 3. Vertikal akse markerer justeringsvinkelen til fibrene til den elektriske potensielle gradienten. Abstrakte elektroder omtalt-nederste side med høyt elektrisk potensial og overside med lavt elektrisk potensial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/61928fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61928/61928fig07.jpg"> Figur 7: Ladebevegelsen påvirkes av stillasfiberjustering i forhold til EF. Begge panelene illustrerer steady state RNC-modellforutsigelser. På venstre side er fibrene parallelle med EF, mens de på høyre side er vinkelrette. Det lyse røde til blå fargevolumet markerer ladetettheten, mens pilvolumet markerer gjeldende tetthetsretning. Fargen på pilene tilsvarer gjeldende tetthetsnorm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/61928fig07large.jpg" target="_blank"></a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Navn</td>
			<td>Uttrykk</td>
			<td>Beskrivelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ws</td>
			<td>10*Rc*med_ratio</td>
			<td>Bredde på stillas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ls</td>
			<td>10*Rc*med_ratio</td>
			<td>Lengde på stillas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hs</td>
			<td>2*Rf</td>
			<td>Høyde på stillas</td>
		</tr>
<tr>
<td>med_ratio</td>
			<td>1.5</td>
			<td>Forholde cellekulturmedier til stillas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rc</td>
			<td>278.5[nm]</td>
			<td>Radius for fiberkjerne</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>1.5</td>
			<td>Fiberkjerne-til-frakk-forhold</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rf</td>
			<td>Rc*r</td>
			<td>Fiber med frakkradius</td>
		</tr>
<tr>
<td>Theta</td>
			<td>90[deg]</td>
			<td>Vinkel på fiberretning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lf</td>
			<td>1.3*(Ls*cos(theta)+Ws*sin(theta))</td>
			<td>Fiber lengde</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tes</td>
			<td>1</td>
			<td>Forholde fiberkjerneradiusen til avstanden mellom fibrene</td>
		</tr>
<tr>
<td>n_1</td>
			<td>2*(fix((Ws/(2*cos(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(cos(theta)!=0)+1*(cos(theta)==0)</td>
			<td>Maksimalt antall fibre hvis theta<=45</td>
		</tr>
<tr>
<td>n_2</td>
			<td>2*(fix((Ls/(2*sin(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(sin(theta)!=0)+1*(sin(theta)==0)</td>
			<td>Maksimalt antall fibre hvis theta>45</td>
		</tr>
<tr>
<td>overmål</td>
			<td>1.2+0.3*abs(synd(2*theta))</td>
			<td>Første fiber relative offset fra stillas</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>Hvis/5</td>
			<td>Belagt periodicitet</td>
		</tr>
<tr>
<td>rekvisitt</td>
			<td>0.46</td>
			<td>Lengde på første strøk i forhold til periodicitet D</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>100[mV/mm]</td>
			<td>Elektrisk feltstørrelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>V0</td>
			<td>E*Ls*med_ratio</td>
			<td>Terminal spenning</td>
		</tr>
<tr>
<td>omega</td>
			<td>500[Hz]</td>
			<td>Tidsavhengig studie Spenningsfrekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td>p_sigma</td>
			<td>0.5</td>
			<td>Andre belegg relativ ledningsevne</td>
		</tr>
<tr>
<td>p_eps</td>
			<td>1.5</td>
			<td>Andre belegg relativ dielektrisk konstant</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Parametere som brukes til simulering
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Kulturmedier</td>
			<td>PEDOT:PSS 1</td>
			<td>PEDOT:PSS 2</td>
			<td>Kollagen hydrert 1</td>
			<td>Kollagen hydrert 2</td>
			<td>Silke Fibroin</td>
			<td>Kollagen Tørr</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elektrisk ledningsevne (S/m)</td>
			<td>1.7014</td>
			<td>1.00E-01</td>
			<td>p_sigma * 0,1</td>
			<td>2.00E-05</td>
			<td>p_sigma * 2e-5</td>
			<td>1.00E-08</td>
			<td>2.50E-08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Relativ tillatelse</td>
			<td>80.1</td>
			<td>2.2</td>
			<td>p_eps * 2,2</td>
			<td>9.89</td>
			<td>p_eps * 9,89</td>
			<td>7.81E+00</td>
			<td>4.97</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Materialegenskaper brukt i simulering
Tilleggsfiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61928/supplemental%20files.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment at JoVE.com

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Dette dokumentet presenterer en strategi for å bygge endelige elementmodeller av fibrøse ledende materialer utsatt for et elektrisk felt (EF). Modellene kan brukes til å estimere den elektriske inngangen som celler frø i slike materialer mottar og vurdere virkningen av å endre stillasets bestanddeler materialegenskaper, struktur eller orientering.

Endelig elementmodellering av et cellulært elektrisk mikromiljø

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Denne metoden bidrar til å forutsi det elektriske mikromiljøet til en celle som sitter på et fiberstillas, for eksempel den ekstracellulære matrisen. Det er to hovedfordeler som oppstår fra insilico modellering. Prediksjonen av eksperimentelle forhold er 3D, mens optimalisering er aktivert av enkel parameterendring.Elektrisk stimulering hjelper regenerering av flere vev. Denne modellen i lignende insilicomodeller vil hjelpe optimalisering av stimuleringsparametrene. For å begynne, åpne COMSOL-programvaren og velg tom modell.I modellbygger høyreklikker du på globale definisjoner, velger parametere og legger til parametere i henhold til tabell én i tekstmanuskriptet. Du kan legge dem til én etter én, eller laste dem inn fra en tekstfil. Høyreklikk materiale i modellbyggeren under globale definisjoner, og velg tomt materiale for å legge til materialer.For å legge til materialegenskaper, gå til innstillingene til det nylig tilsatte materialet, utvid deretter materialegenskaper og velg elektrisk ledningsevne fra grunnleggende egenskaper. Trykk plusssymbolet for å legge til egenskap. Gjenta denne prosessen for relativ tillatelse.Fyll ut gjeldende materialegenskaper, i henhold til tabell to fra tekstmanuskriptet. Deretter venstreklikker du på legg til komponent fra hjemfanen og velger 3D for å legge til en ny komponentnode i modellbyggeren. Igjen, høyreklikk på geometri, venstreklikk på innsettingssekvens.Dobbeltklikk deretter på hele modellen og velg riktig sekvens. Høyreklikk materialer under gjeldende komponentnode i modellbyggeren, og velg materialkobling. Tilknytt materialer for hver komponent i denne rekkefølgen, omkringliggende substans, strøk og kjerner.Utvid valglisten i kategorien Innstillinger for det omkringliggende stoffet for å velge medievalg. Utvid koblingsinnstillingene og velg riktig materiale, for eksempel kulturmedier, fra rullegardinlisten. Hvis du vil se domenene i kulturmedieblokken, aktiverer du gjennomsiktighetsknappen i grafikkfanen.Konfigurer de andre materialkoblingene på samme måte. I modellbyggeren, venstreklikk gjeldende komponent, velg legg til fysikk, utvid deretter AC / DC-modulen for å velge den elektriske strømmodulen og klikk legg til i komponenten. Hvis du vil definere grensebetingelser, velger du XY-visningen i grafikkfanen.Gå til modellbyggeren igjen, høyreklikk på den elektriske strømnoden og velg bakken. Deretter holder du valgbryteren for grensevalget aktiv. Venstreklikk på det høyeste omkringliggende stoffet parallelt med XZ-planet og legg til grense fem i grensevalgboksen.I modellbyggeren høyreklikker du på den elektriske strømnoden og velger terminal. Hold grensevalget aktivt, venstreklikk på det laveste omkringliggende stoffet parallelt med XZ-planet og legg til grense også i grensevalgboksen. Deretter velger du en spenning i rullegardinlisten terminaltype ved å utvide terminalvalget og fylle ut V null for spenning.Under globale definisjoner i modellbygger, venstreklikk parametere og endre parameteren theta til fiber orientering vinkel ønsket for simulering. Utvid komponentnoden for hver komponent i modellbyggeren, høyreklikk deretter på geometri og velg bygg alle. Venstreklikk på modellrotnoden i modellbyggeren, og åpne fanen Legg til undersøkelse.Velg stasjonær studie, og høyreklikk legg til studie. Under studien som nylig er lagt til, venstreklikk på trinn én, utvid studieutvidelser, sjekk den adaptive nettforbedringsboksen og klikk på beregn for å få det raffinerte nettet. Venstreklikk på modellrotnoden i modellbyggeren og åpne fanen legg til studie, velg stasjonær studie og høyreklikk legg til studie.Under studien som nylig er lagt til, venstreklikk på trinn én, utvid maskevalg og velg nettet som genereres i den adaptive maskeforbedringsstudien. Fortsett ved å høyreklikke på beregningsknappen. Høyreklikk på resultatnoden i modellbyggeren, og velg 3D-tegnegruppe for å redigere innstillinger.Endre etiketten for å lade tettheten, og velg det parametriske studiedatasettet ved å utvide datasettet fra rullegardinlisten. Merk deretter av for Vis forklaringer i fargeforklaringen, og vis maksimums- og minimumsverdier. Høyreklikk ladet tetthet under resultatnoden for å velge volum og fortsette med å redigere innstillingsfanen.Utvid datafanen, velg deretter fra overordnet og fyll ut EC. RHOQ i uttrykksboksen. Merk av for det manuelle fargeområdet fra områdekategorien, og sett henholdsvis minimum og maksimum til minus 0,3 og 0,3. Utvid fargelegging og stil, og angi fargelegging til fargetabell og fargetabell for å bølge.Merk av i fargeforklaringsboksen og fargeområdet for symmetrier. Høyreklikk volum og modellbygger, og velg filter. Gå til innstillingsfanen, og fyll ut det logiske uttrykket for inkludering.Venstreklikk på tegneknappen for å visualisere resultatene i grafikkvinduet. I denne analysen vises fem forskjellige geometriske kompleksitetsstadier som påvirket simuleringsresultatet. Et nett som er for grovt, kan skjule relevant informasjon.Ved hjelp av adaptiv maskeforbedring oppnås et nett med mindre elementer, da det kreves for nøyaktige resultater. På ulike nivåer av kompleksitet for den fibrøse matte modellen ble styrken til det elektriske feltet påvirket av justeringen av fibrene med hensyn til den potensielle gradienten. I tillegg påvirker fiberjusteringen vinklet til elektrisk potensiell gradient den plassladede tettheten i omkringliggende cellekulturmedier.I stillas fiber orientering studien, studien tilstand RNC modell spådommer ble illustrert når fibre var parallelle eller vinkelrett på det elektriske feltet. Ladetettheten og den nåværende tettheten ble påvirket av stillasfiberjustering i forhold til det elektriske feltet. Denne protokollen kan brukes til å undersøke virkningen av parameterendringer på ladetettheten rundt et fiber stillassegment.Det er viktig å huske at ved å endre modellparametere, for eksempel data eller materialegenskaper, kan det resulterende ladetetthetsområdet endres betydelig. For best visualisering må området optimaliseres slik at maksimal variasjon i den ladede tettheten kan observeres.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Electric Charges and Fields

SCIENTISTS IN ACTION

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Uttak for Målrettet Stabil isotopfortynning Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

Tissue Engineering av Tumor stromal mikromiljøet med Søknad til Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

A Coupled Experiment-finite Element Modeling Methodology for Assessing High Strain Rate Mechanical Response of Soft Biomaterials

En Sammen Experiment-Finite Element Modeling Methodology for Assessing Høy Strain Rate Mekanisk Response av Soft biomaterialer

This study offers a combined experimental and finite element (FE) simulation approach for examining the mechanical behavior of soft biomaterials (e.g. ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentell og Finite Element-protokollen for å undersøke Transport av nøytrale og siktet Oppløste stoffer over Leddbrusk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer av primære gliacellene for In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

Å skape et strukturelt realistisk Finite Element geometriske modell av en Cardiomyocyte å studere rollen til mobilnettet arkitektur i Cardiomyocyte Systems Biology

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabrikasjon av en multiplex kunstig mobilnettet MicroEnvironment matrise

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: En kraftig, Noninvasive tilnærming til undersøke Cellular energi metabolisme

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Autofluorescence Imaging for å evaluere cellulær metabolisme

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...