Met CMOD Pack kunt u cellen met zeer hoge precisie patroon en ze in 2d of 3D kweken. Dit biedt mogelijkheden om cel-cel interacties en de morfogenese van motor nieuwe weefsels te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk is voor andere laboratoria om te adopteren, het vereist geen cleanroom, gespecialiseerde apparatuur of aangepaste gesynthetiseerde reagentia.
Begin met het laten vallen van kleine druppels van de positieve fotoweerstand op de aldehydeplaat, met behulp van een wegwerppipet. Draai de dia gedurende 30 seconden met 3000 RPM met behulp van de spincoder en plaats deze vervolgens gedurende 1,5 minuut op een hete plaat van 100 graden Celsius om de fotoweerstand te kruislinken. Verwijder de dia van de kookplaat en plaats een fotomasker met de gewenste functies bovenop de dia, verzwaard deze met een stuk glas en dek de hele opstelling af in een ondoorzichtige doos.
Stel de installatie gedurende twee minuten bloot met een UV-lamp, ontwikkel de dia door deze drie tot vijf minuten onder te dompelen in de ontwikkelaarsoplossing en spoel vervolgens overtollige ontwikkelaarsoplossing weg met water en droog deze onder een stroom lucht of stikstof. Observeer dit licht onder een microscoop om het succes van fotolithografie te bevestigen en bewaar het in het donker. Voeg een druppel van 20 micromolair amine gemodificeerde oligos-oplossing toe aan elk fotopatroongebied van de dia en verspreid de druppel voorzichtig over het hele gebied, gebruik een pipetpunt, zorg ervoor dat u niet aan de dia krabt, bak de dia in een oven van 65 graden Celsius totdat de DNA-oplossing volledig is opgedroogd, voer reductieve aminatie uit door de gebakken dia en een celkweekschaal van 15 centimeter in een zuurkast bovenop te plaatsen van een shaker.
Meng voorzichtig 100 milligram natriumboorhydride in 40 milliliter PBS en voeg het toe aan het gerecht. Zet vervolgens de shaker gedurende 15 minuten aan. Was deze dia na de reactie twee keer met 0,1% natriumdodecylsulfaat om niet-gereageerd DNA te verwijderen.
Was de glijbaan vervolgens drie keer met water. Rij deze glijbaan onder de stroom stikstof of lucht. Spoel het ten slotte af met aceton om de resterende fotoweerstand te verwijderen.
Bereid een vier micromolaire universele anker- en adapteroplossing voor zoals beschreven in het tekstmanuscript en bereid een 20 micromolaire universele co-ankeroplossing voor in PBS. Bereid de celsuspensie door de celkorrel opnieuw op te suspenderen in één milliliter ijskoude PBS of serumvrije media en breng één tot 3 miljoen cellen over naar een microcentrifugebuiscentrifuge van 1,5 milliliter. Centrifugeer vier minuten op 160 maal G.
Resuspend de verkregen celkorrel in 75 microliter ijskoude PBS- of serumvrije media en voeg 75 microliter van de voor micromolaire universele anker- en adapteroplossing bereide oplossing toe. Meng grondig en incubeer gedurende vijf minuten op ijs, voeg 15 microliter van de universele co-ankeroplossing toe aan de buis en meng grondig en incubeer het monster vervolgens gedurende vijf minuten op ijs. Om overtollige oligo's uit de celsuspensie te verwijderen, voegt u één milliliter ijskoude PBS of serumvrije media toe aan de buis en mengt u met een pipet.
Pellet de cellen door vier minuten lang bij vier graden Celsius op 160 keer G te centrifugeren en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap nog twee keer. Resuspend de cellen in ijscol PBS of serumvrije media om een celdichte oplossing van ten minste 25 miljoen cellen per milliliter te creëren, kantel de patroonschuif lichtjes en voeg vervolgens 25 microliter van deze celsuspensie toe aan de inlaat van elke stroomcel.
Verwijder de PBS- en 1%BSA-oplossing uit de uitlaat, zodat de celsuspensie de PDMs-stroomcel kan vullen. Incubeer op ijs of bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden, adem vijf microliter van de celsuspensie uit de uitlaat van de dia en voeg deze terug toe aan de inlaat. Herhaal dit 10 keer per stroomcel.
Pipetteer PBS of serumvrije media voorzichtig in de inlaat van elke stroomcel om de overtollige cellen uit te spoelen en de celsuspensie uit de uitlaat te verzamelen. Herhaal dit twee tot vier keer totdat er geen overtollige cellen op de dia achterblijven. Bereid voor 3D-kweek een hydrogelprecursoroplossing met 2% RNA's en voeg 50 microliter ervan toe aan de inlaat van elke stroomcel.
Adem de overtollige vloeistof uit de uitlaat op en drijf de hydrogeloplossing in de stroomcel. Incubeer de dia bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 45 minuten om de hydrogels te laten uitzetten en om de op DNA gebaseerde hechting tussen de cellen en het oppervlak te splitsen. Voeg 50 microliter hydrogelvoorloper toe aan een put van een twee putkamerschuif of een plaat met zes putten.
Pipetteer 10 microliter PBS aan weerszijden van elke stroomcel. Verdeel het over de volledige lengte van de stroomcel met behulp van een scheermes of zoek een puntpincet en til voorzichtig de zijkanten van de stroomcellen op zodat de PBS onder de hydrogel stroomt. Verplaats met behulp van een scheermes de stroomcel naar de rand van de dia door de dia om te keren en duw de stroomcel van de dia zodat deze bovenop het scheermes terechtkomt.
Pluk de flowcel van het scheermes met een gebogen tang. Keer de stroomcellen om zodat de cellen zich aan de onderkant bevinden en plaats ze bovenop de druppel hydrogelvoorloperoplossing. Incubeer gedurende ten minste 30 minuten, zodat de hydrogel die de patrooncellen bevat, zich kan binden aan de hydrogel-ondervloer, wat resulteert in de volledige inbedding van de patrooncellen.
Verwijder de stroomcel en dompel deze volledig onder in media. Duw de stroomcel voorzichtig met een gebogen tang totdat deze eraf springt en in het medium zweeft en gooi hem vervolgens weg. De kwantificering van de DNA-spot hechting aan CMO-gelabelde cellen, die toeneemt.
als functie van de GMO-concentratie wordt voorgesteld als de gemiddelde en standaardafwijking van drie experimenten. De DNA-patronen worden getoond in magenta en de aangekleefde CMO-gelabelde cellen in cyaan bij verschillende concentraties CMO. Een vergelijking van CMO-gelabelde huvecs en LMO-gelabelde huvecs die zich aan een lineair DNA-patroon houden, wordt hier getoond.
Enkele MDCKs patroon VSC MOD pack, en overgebracht in maitre gel waren in staat om te woekeren en polariseren na vijf dagen van cultuur. Meerlagige meercellige aggregaten werden gemaakt door afwisselende lagen cellen gelabeld met complementaire CMO's. Meerdere unieke celpopulaties kunnen met hoge precisie en zonder kruisbesmetting aan elkaar worden gemodelleerd.
Bij het proberen van dit protocol is het van cruciaal belang om een dichte celsuspensie te hebben terwijl de cellen aan de dia worden toegevoegd om de kansen voor de cellen om zich aan DNA-vlekken te hechten te maximaliseren.
