सेल चक्र क्विसेंस हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल की एक प्रमुख विशेषता है। यह प्रोटोकॉल निकट शारीरिक परिस्थितियों में विट्रो में शांत मानव एचएससी के व्यवहार को समझने में मदद करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, शोधकर्ता विभिन्न यौगिकों, पोषक तत्वों या प्रोटीन के प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं जो पशु मॉडल का उपयोग किए बिना सेल चक्र की स्थिति के साथ-साथ एचएससी के भेदभाव को स्केलेबल तरीके से विनियमित करते हैं।
कैंसर रोधी दवाओं का शांत एचएससी और साइकिलिंग जनकों के अस्तित्व पर अलग-अलग प्रभाव पड़ता है। यह प्रोटोकॉल उन एजेंटों को ढूंढना संभव बनाता है जो शांत एचएससी या एजेंटों को छोड़ देते हैं जो चुनिंदा ल्यूकेमिक स्टेम कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन हिरोशी कोबायाशी, ताकुबो प्रयोगशाला से एक वरिष्ठ अनुसंधान फेलो होगा ।
शुरू करने के लिए, 16 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर सोडियम पामिटेट, 30 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर सोडियम ओलेट, और ग्लास ट्यूबों में मेथनॉल में चार मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर कोलेस्ट्रॉल को भंग करें। लिपिड समाधानों को नकारात्मक 30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से पहले उन्हें गल लें। एक ताजा ग्लास ट्यूब में, लिपिड समाधान ों को मिलाकर 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पामिटेट, 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ओलेट, और 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर कोलेस्ट्रॉल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करें।
लिपिड समाधान के माध्यम से नाइट्रोजन गैस पारित करके मेथनॉल वाष्पित। 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में ग्लास ट्यूब को गर्म करके शेष मेथनॉल को पूरी तरह से वाष्पित कर दें। HEPES और ग्लूटामीन के साथ DMEM/F-12 माध्यम तैयार करें।
क्रमशः 50 इकाइयों और 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट जोड़ें। इस माध्यम को कम से कम दो महीने तक चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एचईपीईएस और ग्लूटामीन के साथ डीएमईएम/एफ-12 माध्यम में बीएसए का 4% जोड़ें, फिर सोडियम हाइड्रोक्साइड समाधान का उपयोग करके माध्यम के पीएच को 7.6 तक समायोजित करें।
लिपिड के साथ ग्लास ट्यूब में माध्यम जोड़ें। सोनीशन द्वारा लिपिड को पूरी तरह से भंग करें। यदि सोनीफिकेशन के बाद माध्यम अपारदर्शी है, तो सोनीफिकेशन समय का विस्तार करें।
जब बीएसए और लिपिड भंग हो जाते हैं, तो नमूनों को नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और दो महीने के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए। डीएमईएम/एफ-12 में इंसुलिन, ट्रांसफरिन, सोडियम सेलेनिट और इथेनॉल अमीन मिश्रण के 0.001X जोड़ें और फिर 0.22 माइक्रोमीटर फिल्टर का उपयोग करके मिश्रित माध्यम को फ़िल्टर करें। उपयोग से पहले, प्रत्येक मिलीलीटर प्रति तीन नैनोग्राम की अंतिम एकाग्रता पर संस्कृति मीडिया में मानव स्टेम सेल फैक्टर या एससीएफ और मानव थ्रोम्बोपोइटिन या टीपीओ जोड़ें।
पहले से तैयार संस्कृति मीडिया के 200 माइक्रोलीटर को साइटोकिन्स के साथ फ्लैट बॉटम 96-वेल प्लेट्स में स्थानांतरित करें। माध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए, पीबीएस के 100 से 200 माइक्रोलीटर के साथ सभी अप्रयुक्त कुओं को भरें। 60 कोशिकाओं प्रति माइक्रोलीटर पर साइटोकिन्स के बिना संस्कृति मीडिया में सॉर्ट किए गए हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल या एचएससी को फिर से खर्च करें।
अलीकोट प्रत्येक अच्छी तरह से 600 कोशिकाओं में। 300 से कम कोशिकाओं में बड़ी तकनीकी भिन्नता होगी और एक ही कुएं में 1, 000 से अधिक कोशिकाओं को पोषक तत्वों के अभाव या प्रतिकूल साइटोकिन्स या केमोकिन्स के संचय के कारण बचा जाना चाहिए। संस्कृति एक आर्द्रीकृत बहु गैस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 1% ऑक्सीजन वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
शुद्ध HSCs खेती के सात दिनों के बाद, कोशिकाओं के ८०% तक मार्कर CD34 सकारात्मक और CD38 नकारात्मक फेनोटाइप प्रदर्शित किया । कुल सेल संख्या साइटोकिन एकाग्रता पर निर्भर थी। एससीएफ और टीपीओ की उच्च सांद्रता ने सेल चक्र, प्रसार और भेदभाव में प्रवेश को प्रेरित किया।
मार्कर CD34 सकारात्मक, सीडी 38 नकारात्मक, सीडी 90 सकारात्मक और सीडी 45 आरए नकारात्मक फेनोटाइप की विशेषता फेनोटाइप एचएससी की संख्या एससीएफ या टीपीओ सांद्रता के अनुपात में बढ़ी जबकि कुल कोशिकाओं के बीच आवृत्ति में कमी आई। सुसंस्कृत वयस्क अस्थि मज्जा HSCs के प्रत्यारोपण के तीन महीने के बाद, पुनर्गठन मानव CD45 सकारात्मक murine, CD45 नकारात्मक Ter119 नकारात्मक कोशिकाओं के परिधीय रक्त में उनकी आवृत्ति के एक समारोह के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है । CD19 सकारात्मक बी कोशिकाओं, CD13 नकारात्मक, CD33 सकारात्मक myeloid कोशिकाओं, और सीडी 3 सकारात्मक टी कोशिकाओं सहित तीन वंश या तो हौसले से गल या सुसंस्कृत HSCs के साथ प्रत्यारोपित NOG चूहों में पुनर्गठन किया गया ।
संस्कृति के बाद, HSCs जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग जैसे वास्तविक समय पीसीआर और आरएनए अनुक्रमण के अधीन किया जा सकता है । प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों में प्रत्यारोपण का उपयोग करके कार्यात्मक सत्यापन भी किया जा सकता है। शोधकर्ता सीधे साइटोकिन सांद्रता को समायोजित करके परिभाषित परिस्थितियों में साइकिलिंग और शांत एचएससी की तुलना कर सकते हैं।
यह शांत एचएससी-विशिष्ट आत्म-नवीकरण कार्यक्रमों, तनाव प्रतिरोध तंत्र और मेटाबोलिक गुणों को समझने में मदद करेगा, जो वीवो सेटिंग्स में परीक्षण करना कठिन है।
