Name: a culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells
Uploaded: 2021-05-17T13:00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Vi takker M. Haraguchi og S. Tamaki for teknisk støtte og laboratorieledelse og K. Shiroshita for å ha tatt bilder. HK ble delvis støttet av KAKENHI Grant fra MEXT/JSPS (tilskudd nr. 19K17847) og National Center for Global Health and Medicine. KT ble delvis støttet av KAKENHI Grants fra MEXT/JSPS (tilskuddsnr. 18H02845 og 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (grant nos. 26-001 og 19A2002), AMED (grant nos. JP18ck0106444, JP18ae0201014 og JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation og Takeda Science Foundation.

Protokollen følger retningslinjene fra National Center for Global Health and Medicine. Alle eksperimentelle prosedyrer utført på mus er godkjent av National Center for Global Health and Medicine animal experiment committee. MERK: En oversikt over protokollen er illustrert i figur 1.
1. Lipid forberedelse
<ol><li>Løs opp følgende lipider i metanol i glassrør ved de angitte konsentrasjonene: natriumpalpalitat, 16 mg / ml; natrium oleat, 30 mg / ml; kolesterol, 4 mg/ml. Oppbevar lipidoppløsningen ved -30 °C og tine prøven før bruk.</li>
	<li>Bland lipidløsningene som er tilberedt i trinn 1.1 i et friskt glassrør i de dosene som er nødvendige for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 100 μg / ml palmitat, 100 μg / ml oleat og 20 μg / ml kolesterol. For eksempel, når du forbereder 10 ml kulturmedier, bland 62,5 μL palmitateoppløsning, 33 μL oleatoppløsning og 50 μL kolesteroloppløsning i glassrøret.</li>
	<li>Fordamp metanol ved å sende nitrogengass gjennom lipidoppløsningen (Figur 2A og 2B). Hvis nitrogengass ikke er tilgjengelig, send luft gjennom løsningen ved hjelp av et pipettehjelpemiddel.</li>
	<li>Fordamp den gjenværende metanolen fullstendig ved å varme opp glassrøret i et vannbad ved 37 °C (Figur 2C). MERK: Bruk av en høy konsentrasjon av N2 gass i trangt rom er potensielt skadelig. Selv om volumet som brukes i protokollen for å fordampe metanol er begrenset og dermed anses som trygt, er ventilasjon av rommet tilstrekkelig og merking av områder med potensielt høye konsentrasjoner av N2-gass viktig dersom det skulle oppstå en uventet gasslekkasje.</li>
</ol>2. Middels forberedelse
<ol><li>Forbered Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM)/F12 medium (med HEPES og glutamin). Tilsett penicillin og streptomycinsulfat til mediet til den endelige konsentrasjonen på henholdsvis 50 enheter og 50 μg/ml. DMEM/F12 medium som inneholder antibiotika kan oppbevares ved 4 °C i minst 2 måneder.</li>
	<li>Tilsett 4 % m/v bovint serumalbumin (BSA) i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM)/F12 medium (med HEPES og glutamin).</li>
	<li>Juster pH-en til mediet til pH 7,4-7,8 ved hjelp av NaOH-oppløsning, vanligvis til pH 7,6.</li>
	<li>Legg mediet til glassrøret som er klargjort i trinn 1. For å oppnå en løsning med maksimal løselighet, anbefales det å legge til 3-15 ml medium.</li>
	<li>Oppløs lipidene helt ved sonikering (optimal: mer enn 20 min sonikering). Etter at BSA og lipider er oppløst, bør prøven lagres ved -80 °C og brukes innen 2 måneder. Tine umiddelbart før bruk.</li>
	<li>Tilsett 1/1000 av insulin-, transferrin-, natriumselenitt- og etanolaminblandingen (ITS-X) i DMEM/F12. Filtrer det blandede mediet ved hjelp av et filter på 0,22 μm (angitt som "kulturmedier"). Før bruk, tilsett human stamcellefaktor (SCF) og humant trombopoietin (TPO) i kulturmediene ved en endelig konsentrasjon på 3 ng/ml hver. Etter å ha tilsende cytokiner og ITS-X, kan mediet ikke lagres.</li>
	<li>Fargebuffer: Tilsett 10 % FCS i Ca- og Mg-fri fosfatbuffer (PBS). Denne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i 2 uker.</li>
	<li>Opptiningsmedier: Legg til 10 % FCS i DMEM/F12. Denne løsningen er engangsbruk.</li>
	<li>Cytokin lagerløsning: Løs opp hver menneskelig SCF eller menneskelig TPO i PBS (Ca- og Mg-fri) ved 20 μg/ml. Denne løsningen kan lagres ved -80 °C i minst ett år uten tap av aktivitet. Når den er tint, oppbevar lagerløsningen ved 4 °C og bruk innen 1 måned. MERK: Undersøk tomten etter hvert kjøp for å unngå variasjon i forurensningene i BSA. Kultur HSC samtidig med ulike partier av BSA og undersøke fenotypisk HSC nummer på dag 7 som beskrevet nedenfor. Hvis en BSA-gruppe viser et lavt antall eller frekvens for CD34+-celler (f.eks. mindre enn halvparten av antall inndataceller), bør du unngå å bruke denne bunken.</li>
</ol>3. Fremstilling av menneskelig benmarg CD34+ celler
<ol><li>Kjøp humane CD34+ benmargceller og oppbevar cellene i flytende nitrogen til bruk. Alternativt kan benmargsceller fra en sunn frivillig eller frisk ledning blodceller brukes ved godkjenning av instituttets etiske komité og donorsamtykke.</li>
	<li>Varm 10 ml opptiningsmedier i et 15 ml konisk rør i et 37 °C vannbad.</li>
	<li>Tine de frosne cellene i hetteglass i et 37 °C vannbad innen 2 minutter. Etter å ha tørket hetteglasset med 70% etanol for å fjerne forurensninger, overfør cellene til 15 ml konisk rør som inneholder det forvarmede mediet fra trinn 3.2.</li>
	<li>Sentrifuger 15 ml-røret ved 200 × g i 15 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten forsiktig for å holde pellet intakt (etterlater < 50 μL medium). Resuspend cellene med det gjenværende mediet og overfør dem til et 1,5 ml rør på is. MERK: Eksponering for menneskeskapte prøver direkte i slimhinnen, inkludert øyet eller såret vev, kan forårsake infeksjon av kjente eller ukjente patogener; Hansker og briller anbefales derfor ved håndtering av menneskeceller. Selv om de kjøpte CD34+ cellene tester negativt for hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV) og humant immunsviktvirus 1 (HIV1), bør nøye overvåking utføres i henhold til institusjonelle retningslinjer hvis en eksponeringsforekomst oppstår. Følg de institusjonelle retningslinjene ved avhending av materialer som er eksponert for menneskelige celler.</li>
</ol>4. Sortering av HSC-er
<ol><li>Merk cellene med fluorokromkonjugede antistoffer. Bland 50 μL fargebuffer pluss 10 μL anti-CD34-FITC, 2 μL anti-CD38-PerCP-Cy5,5, 5 μL anti-CD90-PE-Cy7 og 10 μL anti-CD45RA-PE. Resuspend cellepellet i antistoffblandingen. Inkuber cellene i 30 min ved 4 °C i mørket.</li>
	<li>Tilsett 1 ml fargingsbuffer for å vaske antistoffene. Sentrifuger rørene ved 340 × g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten.</li>
	<li>Resuspend cellepellet i 0,5 ml fargebuffer + 0,1% propidiumjodid. Overfør suspensjonen til et 5 ml rør ved hjelp av et 40 μm filter.</li>
	<li>Gate fenotypic HSC i PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- brøkdel ved hjelp av FACS Aria-IIIu og sortere cellene i et 1,5 ml rør fylt med 500 μL kulturmedier (Figur 3). Ved hjelp av gating-strategien som vises i figur 3, forventes ~ 10% av CD34+ celler å være fenotypiske HSC-er. Registrer det sorterte cellenummeret for å beregne volumet av medier for å resuspendere cellene i trinn 5.3. MERK: Gating-strategien utføres som beskrevet tidligere16 mens du utelater avstamningsmarkøren farging gitt det lave uttrykket av avstamningsmarkører i CD34 + CD38-fraksjonen fra friske individer17 .</li>
	<li>Sentrifuger de sorterte cellene ved 340 × g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten. Aspirer forsiktig supernatanten for å sikre at pelletsen forblir intakt.</li>
	<li>Oppbevar de sorterte cellene på is til kultur. MERK: Fluorescenskompensasjon av spektral overlapping bør utføres under det første eksperimentet.</li>
</ol>5. Cellekultur
<ol><li>Overfør 200 μL av kulturmediene som inneholder cytokiner utarbeidet i trinn 2 til flatbunnede 96-brønnsplater.</li>
	<li>For å unngå fordampning av mediet, fyll alle ubrukte brønner med 100-200 μL PBS.</li>
	<li>Resuspend de sorterte HSC-ene i kulturmedier uten cytokiner ved 60 celler /μL.</li>
	<li>Aliquot 600 HSC/brønn (10 μL cellesuspensjon) i hver brønn. Cellenummeret kan endres. Færre enn 300 celler vil føre til større teknisk variasjon, og dermed er det behov for flere brønner per tilstand for å oppdage biologiske forskjeller. Culturing mer enn 1000 celler i en enkelt brønn bør unngås på grunn av cytokin / næringsmangel eller akkumulering av ugunstige cytokiner / kjemokiner.</li>
	<li>Kultur cellene i en fuktet multi-gass inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 og 1% O2 atmosfære.</li>
	<li>For kulturer over 7 dager anbefales det å erstatte halvparten av medievolumet hver 3-4 dager. Aspirer forsiktig 100 μL medier ved pipettering og tilsett 100 μL nylagde kulturmedier som inneholder cytokiner til hver brønn. Kulturmediene skal forvarmes ved 37 °C.</li>
</ol>6. Analyse av markørfenotyper ved bruk av strømningscytometri
MERK: Selv om cellene skal analyseres etter 7 dager med kultur, kan kulturvarigheten endres.
<ol><li>Kast 170 μL av mediet ved hjelp av en 8-kanals pipette.</li>
	<li>Merk cellene med antistoffblandingen. Bland 0,5 μL anti-CD34-FITC, 0,1 μL anti-CD38-PerCP-Cy5,5, 0,25 μL anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL anti-CD45RA-PE og 9 μL fargebufring per brønn. Tilsett 10 μL av blandingen til 96-brønnsplaten og inkuber cellene i 30 min ved 4 °C i mørket.</li>
	<li>For å vaske antistoffene, tilsett 100 μL fargebuffer til brønnene og sentrifuger platene ved 400 × g i 5 min ved 4 °C ved lav akselerasjon og middels retardasjon.</li>
	<li>Aspirer forsiktig 100 μL av supernatanten for å opprettholde cellene på bunnen av brønnene, og resuspender deretter cellene i 200 μL fargebuffer + 0,1% v / v PI + 1% v / v fluorescerende mikrosfærer (f.eks. Flow-Check Fluorosfærer).</li>
	<li>Sett opp flowcytometriinstrumentet. Hent data for prøvene i hurtigmodus med blandet prøvemodus på og ta opp volumer på 100 μL.</li>
	<li>Eksporter dataene i FCS-format og analyser dem ved hjelp av programvare som FlowJo. Celletall kan bestemmes ved hjelp av fluorescerende mikrosfæreperletall. For eksempel, hvis forskeren legger til 2000 per brønn og perletallet er 700, multipliserer du cellenummeret for hver brøkdel med 2000/700 for å estimere det totale cellenummeret til brøken i brønnen. MERK: Fluorescerende mikrosfærer er giftige for dyrkede celler på grunn av tilstedeværelsen av formaldehyd. Dette kan indusere celledød under analyse. Minimer antall brønner (<50 brønner) kontinuerlig analysert for å unngå skjevheter.</li>
</ol>7. Transplantasjon av menneskelige HSC-er
MERK: Repopulation aktivitet av dyrkede celler er validert ved transplantasjon til immunodeficient mus. Alle prosedyrer må godkjennes av dyreforsøkskomiteer eller tilsvarende.
<ol><li>Som givere, forberede et tilstrekkelig antall 8-12-ukers immunodeficient NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) mus. Siden NOG-mus er svært utsatt for infeksjon, hold avlsburene så rene som mulig og mate musene med et sterilisert kosthold og vann.</li>
	<li>Kultur et tilstrekkelig antall HSC-er for transplantasjon som beskrevet i trinn 5. For eksempel, når 5000 HSC-er (dag 0 tilsvarende) transplanteres til 6 mottakermus, kultur 35.000-40.000 HSC-er i 40 brønner av en 96-brønns plate (200 μL kulturmedier per brønn) eller i 8 brønner av en 24-brønns plate (1 ml kulturmedier per brønn). Kultur cellene i 2 uker med halv-media endringer hver 3-4 dager i en fuktet multi-gass inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 1% O2. Kulturvarigheten kan endres.</li>
	<li>Bestråle NOG-mus ved 2,5 Gy ved 6-24 timer før transplantasjon.</li>
	<li>Samle de kultiverte HSC-ene i 1,5 ml rør. Sentrifuger rørene ved 340 ×g i 5 min ved 4 °C.</li>
	<li>Aspirer forsiktig supernatantene og resuspender cellene i steril iskald fargingsbuffer med en celletetthet på 5000 HSC-er (dag 0 tilsvarende) per 200 μL. Overfør denne suspensjonen til 3 ml polypropylenrør. For å sterilisere fargebufferen, filtrer den med et 0,22 μm filter.</li>
	<li>Før transplantasjon bedøves musene ved sevofluran eller isofluraninnånding.</li>
	<li>For å transplantere 5000 av dyrkede HSC-er (dag 0 tilsvarende), injiser 200 μL av cellefjæringen i halevenen eller retro orbital sinus av NOG-mus bestrålet i trinn 7.1 ved hjelp av en 1 ml sprøyte og 27-gauge nål. Nyisolerte eller tinte benmargs-HSC-er kan transplanteres som en kontroll. Hansker bør steriliseres med 70% v/v etanol mellom hver prosedyre.</li>
</ol>8. Analyse av hyppigheten av menneskeavledede celler i perifert blod
<ol><li>For å undersøke repopulation av menneskelige celler, samle perifert blod på 1, 2 og 3 måneder etter transplantasjon.</li>
	<li>Før du samler det perifere blodet, bedøv musene ved sevofluraninnånding.</li>
	<li>Samle 40-80 μL perifert blod fra retro-orbital sinus ved hjelp av hepariniserte glass kapillærrør og suspendere denne prøven i 1 ml PBS + heparin (1 U / ml) i 1,5 ml rør.</li>
	<li>Sentrifuger blodfjæringen ved 340 × g i 3 min ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspend pellet i 1 ml PBS + 1,2% m/v dextran (200 kDa) i 45 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Overfør supernatanten til et annet 1,5 ml rør og sentrifuger ved 340 × g i 3 minutter.</li>
	<li>For rødblodscellelys, resuspend cellene i 0,17 M NH4Cl i 5 min.</li>
	<li>Sentrifuger cellesuspensjonen 340 × g i 3 min ved 4 °C. Resuspend cellene i 50 μL av farging buffer som inneholder 0,3 μL anti-mus Fc-blokk. Inkuber denne prøven ved 4 °C i 5 minutter.</li>
	<li>Tilsett følgende antistoffer for overflatemarkørfarging: 0,3 μL mus CD45-PE-Cy7, 0,3 μL mus Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL menneskelig CD45-BV421, 0,3 μL menneskelig CD13-PE, 1,2 μL menneskelig CD33-PE, 0,3 μL menneskelig CD19-APC, 0,3 μL menneskelig CD3-APC-Cy7. Inkuber cellene ved 4 °C i 15 minutter.</li>
	<li>Vask en gang med 1 ml fargingsbuffer og sentrifuge ved 340 × g i 5 min ved 4 °C.</li>
	<li>Kast supernatanten og resuspend cellene i 200 μL fargebuffer + 0,1% v / v av PI.</li>
	<li>Overfør cellefjæringen til en 96-brønns flatbunnsplate og samle inn data ved hjelp av strømningscytometeret i rask modus med blandingsprøvemodus på og et opptaksvolum på 100 μL.</li>
	<li>Eksporter dataene i FCS-format for analyse ved hjelp av programvare som FlowJo.</li>
	<li>Sett opp strømningscytometeret. Samle inn data for prøvene i hurtigmodus med mix-prøvemodus på og et opptaksvolum på 100 μL.</li>
	<li>Eksporter dataene i FCS-format for analyse ved hjelp av programvare som FlowJo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Scala, S., Aiuti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+human+hematopoietic+stem+cells:+novel+concepts+and+future+directions.">In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions.</a> Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).</li><li>Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Awakening+dormant+haematopoietic+stem+cells.">Awakening dormant haematopoietic stem cells.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).</li><li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).</li><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).</li><li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).</li><li>Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+lineage+fate+in+native+haematopoiesis.">Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis.</a> Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).</li><li>Pineault, N., Abu-Khader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+umbilical+cord+blood+stem+cell+expansion+and+clinical+translation.">Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation+using+single+UM171-expanded+cord+blood:+a+single-arm,+phase+1-2+safety+and+feasibility+study.">Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study.</a> Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).</li><li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells.">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Mendelson, A., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+niche+maintenance+during+homeostasis+and+regeneration.">Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration.</a> Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).</li><li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood.">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+targets+on+the+surface+of+CD34+CD38-+bone+marrow+cells+in+myelodysplastic+syndromes.">Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes.</a> Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Bai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+primitive+human+hematopoietic+stem+cells+by+culture+in+a+zwitterionic+hydrogel.">Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel.</a> Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Optimization+Enables+Maintenance+of+Quiescent+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo.">Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+human+SCID-repopulating+cells+under+hypoxic+conditions.">Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).</li><li>Kikushige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Flt3+is+expressed+at+the+hematopoietic+stem+cell+and+the+granulocyte/macrophage+progenitor+stages+to+maintain+cell+survival.">Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+All-Recombinant+Protein-Based+Culture+System+Specifically+Identifies+Hematopoietic+Stem+Cell+Maintenance+Factors.">An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt knyttet til denne studien.

Nylig har flere metoder for å utvide HSC-er med minimal differensiering blitt rapportert18,19,20,21. Selv om disse metodene er gode, er HSC-er tvunget til å aktivere cellesyklusene sine i nærvær av høye nivåer av cytokiner, som er forskjellig fra in vivo-situasjonen der HSC-er viser minimal sykling. Denne protokollen er nyttig for å opprettholde HSC-er som passivitet, som observert in vivo, ved å rekapitlere benmargsmikromiljøet.
Ved å dyrke menneskelige HSC-er under lave cytokin-, lipidrike og hypoksiske forhold, viste HSC minimal sykling samtidig som de opprettholdt sine markørfenotyper. Det kritiske trinnet i denne protokollen er utarbeidelsen av medium som inneholder en høy konsentrasjon av fettsyrer og kolesterol og lave cytokinkonsentrasjoner og kultur under hypoksi (trinn 1, trinn 2 og trinn 4). Uten kolesterol og / eller fettsyrer reduseres vedlikeholdshastigheten til HSC-er under lave cytokinkonsentrasjoner22. Culturing av celler under hypoksiske forhold er også viktig, som rapportert tidligere23.
Kulturforholdene var lik de som ble brukt til murine HSC-er, bortsett fra cytokinkonsentrasjonene. Murine HSC overlever uten TPO, mens menneskelige HSC-er krever minst 2 ng/ml TPO med 3 ng/ml SCF22. Siden konsentrasjonen av TPO er mye høyere enn i humant serum (~ 100 pg / ml), kan forholdene som brukes i denne protokollen mangle spesifikke faktorer for å støtte overlevelsen til menneskelige HSC-er. FLT3 uttrykkes på menneskelige HSC24. Tillegg av sin ligand FLT3LG reduserer litt kravet om at TPO skal opprettholde HSC22.
Menneskelige HSC-er krever høyere konsentrasjoner av kolesterol sammenlignet med murine HSC-er, antagelig på grunn av manglende evne til å indusere uttrykket av kolesterolsyntetiserende enzymer og følsomhet for lipotoksisitet under høye konsentrasjoner (>400 μg / ml) av fettsyrer22. Selv om bare kombinasjonen av palmittiske, oljesyrer, linolsyrer og stearinsyrer ble testet, som er rikelig funnet i det menneskelige serumet, bør andre kombinasjoner av lipider evalueres for å redusere lipotoksisitet og forbedre hastigheten på å opprettholde funksjonelle HSC-er.
Selv om repopulation aktiviteten til kultiverte menneskelige HSC-er i immunodeficient mus etter to uker med kultur er bekreftet22, dette kultursystemet ikke fullt ut rekapitulere nisjefunksjonene til HSC in vivo. Uttrykket av CD45RA har blitt rapportert å øke og repopulation kapasiteten er dårligere enn for nysorterte HSC22. Imidlertid kan konsentrasjonene av næringsstoffer, som glukose, aminosyre, pyruvat og insulin, som legges til mediet ved suprafysiologiske nivåer, optimaliseres. Forurensninger i BSA kan også kompromittere vedlikeholdet av HSC18,25. I tillegg gjennomgår noen dyrkede celler celledød, mens andre gjennomgår celledeling; Vedlikehold av det totale cellenummeret kan derfor ikke indikere passivstatusen til hver celle.
Til tross for disse begrensningene vil kulturforholdene som er beskrevet i protokollen utviklet i denne studien bidra til å fremme forskning og prosjektering av HSC-er, spesielt under nesten fysiologiske forhold. Kulturforhold som opprettholder HSC-er med minimal differensierings- og sykkelaktivitet, vil være egnet for testing av biologiske og kjemiske forbindelser som spesifikt virker på HSC-er, manipulere HSC via lentivirustransduksjon eller genomredigering uten tap av stemness, og belyse det første trinnet i transformasjon indusert av leukemi-assosierte gener.

Hematopoietiske stamceller (HSC) og multipotente stamceller (MPPer) danner koordinat et reservoar for kontinuerlig etterfylling av differensierte celler for å opprettholde hematopoiesis gjennom livet hos mennesker1. Cellesyklus passivisens er et fremtredende trekk ved HSC-er, og skiller dem fra MPPer2. Konvensjonelt antas HSC å ligge på toppen av hierarkiet i det hematopoietiske systemet, og produserer alle differensierte blodlegemer. Denne hierarkiske modellen ble for det meste utledet fra transplantasjonsforsøk3. Nyere studier indikerte imidlertid at dynamikken i HSC-er varierer in vivo sammenlignet med de i transplantasjonsforsøk4,5,6,7. Lineage tracing eksperimenter ved hjelp av flere barkodingssystemer avslørte at fenotypisk murine HSC-er ikke er en unik celletype som bidrar til steady-state hematopoiesis, og MPPer, som viser begrenset selvfornyelsesaktivitet ved transplantasjonsinnstillinger, leverer kontinuerlig modne blodlegemer4,5,8. Derimot forbedres bidraget fra HSC til modne celler etter benmargsskade4. Dette kan tilskrives drastiske endringer i mikromiljøet etter benmargsablasjon, inkludert benmargstransplantasjon. Selv om det er vanskelig å bruke avstamningssporing av murine celler på menneskelige celler, avslørte fylogenetisk analyse som kombinerer encellet koloniisolasjon og hele genomsekvensering en lignende egenskap av det hematopoietiske systemet, der både HSC og MPPer er ansvarlige for den daglige produksjonen av modne celler7. Således, selv om transplantasjon er avgjørende for å undersøke murin eller menneskelig HSC-aktivitet, er det nødvendig med andre eksperimentelle modeller for å forstå oppførselen til HSC under fysiologiske forhold.
Culturing metoder for HSC har blitt studert i detalj for å forstå deres kliniske anvendelser og egenskaper. Menneskelige HSC-er kan utvides in vitro ved hjelp av en kombinasjon av cytokiner, rekonstituering av ekstracellulære matriser, fjerning av selvfornyelsesantagonister, samkultur med mesenchymale eller endotelceller, tillegg av albumin eller erstatning, transduksjon av selvfornyelsestranskripsjonsfaktorer og tilsetning av småmolekylforbindelser9,10. Noen av disse metodene, inkludert tilsetning av små forbindelser SR111 og UM17112, har blitt testet i kliniske studier med lovende resultater9. Tatt i betraktning den passive naturen til HSC-er in vivo, er vedlikehold av HSC-er med minimal cellesykling avgjørende for å rekapitulere HSC-oppførsel in vitro. Passiv og prolifererende HSC-er viser differensialcellesyklusoppføring13, metabolsk status14og toleranse mot flere påkjenninger15 . Metodene som brukes for å opprettholde passivheten til menneskelige HSC-er in vitro er begrenset.
Ved å etterligne mikromiljøet i benmargen (hypoksisk og rik på lipider) og optimalisere konsentrasjonen av cytokiner, kan menneskelige HSC-er opprettholdes uavklart og passivisert under kultur. Recapitulating den passiv karakter av HSC in vitro vil forbedre forståelsen av steady state egenskaper av HSC og muliggjør eksperimentell manipulering av HSC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human bone marrow CD34+ progenitor cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2M-101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/Shi-scid,IL-2R&#947;KO Jic</td>
			<td>In-Vivo Science Inc.</td>
			<td>https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD34-FITC (clone: 581)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 560942; RRID: AB_10562559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 551400; RRID: AB_394184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45RA-PE</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 555489; RRID: AB_395880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 561558; RRID: AB_10714644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD13-PE (clone: WM15)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 301703; RRID: AB_314179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD33-PE (clone: WM53)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 561816; RRID: AB_10896480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-APC (clone: SJ259)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 363005; RRID: AB_2564127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 561800; RRID: AB_10895381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 563880; RRID:AB_2744402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103114; RRID: AB_312979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 557853; RRID: AB_396898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 553142; RRID: AB_394657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>Cat# 14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>PGLD755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>SSDN1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>Cat# P0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>Cat# O0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>Cat# C0318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 017-2995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#65381;2Na</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 345-01865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparine Na</td>
			<td>MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO.,&#160;LTD.</td>
			<td>Cat# 224122557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 193-17791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>Cat#&#160; 10927-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat# 300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat# 300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Flt3 ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat# 300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow-Check Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# 7547053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria3u</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator)</td>
			<td>VELVO-CLEAR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas cylinder</td>
			<td>KOIKE SANSHO CO., LTD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulator</td>
			<td>Astec</td>
			<td>Cat# IM-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multigas incubator</td>
			<td>Astec</td>
			<td>Cat# SMA-30DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube, 16 mL</td>
			<td>Maruemu corporation</td>
			<td>N-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube, 50 mL</td>
			<td>Maruemu corporation</td>
			<td>NX-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells

Humane hematopoietiske stamceller (HSC), som andre pattedyr HSC, opprettholder livslang hematopoiesis i benmargen. HSC-er forblir passiv in vivo, i motsetning til mer differensierte forfedre, og går raskt inn i cellesyklusen etter kjemoterapi eller bestråling for å behandle benmargsskade eller in vitrokultur. Ved å etterligne benmargsmikromiljøet i nærvær av rikelige fettsyrer, kolesterol, lav konsentrasjon av cytokiner og hypoksi, opprettholder menneskelige HSC-er passivence in vitro. Her beskrives en detaljert protokoll for vedlikehold av funksjonelle HSC-er i passiv tilstand in vitro. Denne metoden vil muliggjøre studier av oppførselen til menneskelige HSC-er under fysiologiske forhold.

Etter 7 dager med dyrking av rensede HSC-er, viste opptil 80% av cellene markørfenotyper av CD34+CD38- (Figur 4A). Det totale celletallet var avhengig av cytokinkonsentrasjonen (figur 4B). Høyere konsentrasjoner av SCF og TPO induserte inntreden i cellesyklusen, spredning og differensiering (figur 4B). Antall fenotypiske HSC-er preget av markørfenotyper av CD34+CD38-CD90+CD45RA- økte i forhold til SCF- eller TPO-konsentrasjonene (figur 4B), mens frekvensen blant de totale cellene ble redusert (figur 4C). Totale celletall var like i 1,5 ng/ml SCF og 4 ng/ml TPO og 3 ng/ml SCF 3 og 2 ng/ml TPO-kombinasjoner, noe som tyder på at HSC-er er passivisert under minimal cellesyklusaktivering. Gitt de individuelle forskjellene, anbefales cytokintitrering for hver benmargsdonor.
Etter 3 måneder med transplantasjon av dyrket voksen benmarg HSC, rekonstituering kan evalueres som deres frekvens i perifert blod av menneskelig CD45 + murine CD45- Ter119-celler. Tre avstamninger, inkludert CD19+ B-celler, CD13/CD33+ myeloide celler og CD3+ T-celler, ble rekonstituert i NOG-mus transplantert med enten nyoppussede HSC-er eller dyrkede HSC-er (figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig01.jpg"> Figur 1. Oversikt over prosedyren. Grafisk oppsummering av prosedyren innebar sortering, dyrking og analyse av humane hematopoietiske stamceller (HSC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig02.jpg"> Figur 2. Prosedyre for å fordampe metanol fra lipidoppløsningen. A) Nitrogen gassflaske med gassregulator. B) Prosedyre for å sende nitrogengass gjennom lipidoppløsningen oppløst i metanol. C) Lipider som holder seg til bunnen av glassrøret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig03.jpg"> Figur 3. Gating strategi for sortering av HSC-er. Plottene viser inngjerdede CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler. Omtrent 10% av CD34+ cellene var fenotypiske HSC-er. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig04.jpg"> Figur 4. Representative cellenumre etter 7 dager med dyrking. A) Representativ fluorescensaktivert cellesorteringsplott etter å ha dyrket HSC-ene i SCF (3 ng/ml) og TPO (2 ng/ml). Fraksjon 1 ble beriket for levende celler, brøkdel 2 ble beriket for døde celler, og brøkdel 3 ble beriket for rusk. Tall farget i rosa angir frekvensen (%) av den inngjerdede brøkdelen. B) Antall av alle HSC-er, CD34+CD38- celler og CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler etter å ha dyrket 600 HSCer under de angitte cytokinforholdene. Røde stiplede linjer angir det første antallet inndataceller. S: SCF, T: TPO. Gjennomsnittlig ± standardavvik, n = 4. Tall etter S og T indikerer konsentrasjonen (ng/ml) for hver cytokin. C) Frekvens av CD34+CD38- og CD34+CD38-CD90+CD45RA- celler under de angitte cytokinforholdene. S: SCF, T: TPO. Gjennomsnittlig ± standardavvik, n = 4. Feilfeltene for celler som ble dyrket i SCF (1 ng/ml) og TPO (0 ng/ml) ble utelatt på grunn av deres høye verdier (henholdsvis 37,7 og 47,9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig05.jpg"> Figur 5. Representative FACS-plott av donormus etter 3 måneder med transplantasjon. Totalt 5000 nytintede (øvre paneler) og 2-ukers kultiverte HSC-er (3 ng/ml SCF og 3 ng/ml TPO; nedre paneler) ble transplantert til NOG-mus. hCD19 markerer humane B-celler, hCD13 og hCD33 markerer humane myeloide celler, og hCD3 markerer humane T-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig05large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Denne protokollen gjør det mulig å opprettholde quiescent human hematopoietiske stamceller in vitro ved å etterligne benmargsmikromiljøet ved hjelp av rikelig fettsyre, kolesterol, lavere konsentrasjoner av cytokiner og hypoksi.

En kulturmetode for å opprettholde quiescent humane hematopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Cellesyklus passivcens er et sentralt trekk ved hematopoietiske stamceller. Denne protokollen bidrar til å forstå oppførselen til passiv menneskelige HSC-er in vitro under nær fysiologiske forhold. Ved hjelp av denne protokollen kan forskere teste effekten av ulike forbindelser, næringsstoffer eller proteiner som regulerer cellesyklusstatusen, samt differensiering av HSC-er på en skalerbar måte uten å bruke dyremodeller.Anti-kreft medisiner har varierende effekter på overlevelsen av passiv HSC og sykling forfedre. Denne protokollen gjør det mulig å finne agenter som sparer passiv HSC eller midler som selektivt skader passiv leukemiske stamceller. Hiroshi Kobayashi, seniorforsker fra Takubo Laboratory, demonstrerer prosedyren.Til å begynne med oppløses 16 milligram per milliliter natriumpalnitt, 30 milligram per milliliter natrium oleat og fire milligram per milliliter kolesterol i metanol i glassrør. Oppbevar lipidløsningene ved negative 30 grader Celsius og tine dem før bruk. I et friskt glassrør blander du lipidløsningene for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 100 mikrogram per milliliter palmitat, 100 mikrogram per milliliter oleat og 20 mikrogram per milliliter kolesterol.Fordamp metanol ved å sende nitrogengass gjennom lipidoppløsningen. Fullstendig fordampe gjenværende metanol ved å varme glassrøret i et vannbad ved 37 grader Celsius. Forbered DMEM/F-12 medium med HEPES og glutamin.Tilsett penicillin og streptomycinsulfat for en endelig konsentrasjon på henholdsvis 50 enheter og 50 mikrogram per milliliter. Mediet kan lagres ved fire grader Celsius i minst to måneder. Tilsett 4 % av BSA til DMEM/F-12 medium med HEPES og glutamin, og juster deretter pH i mediet til 7,6 ved hjelp av natriumhydroksidoppløsning.Legg mediet til glassrøret med lipidene. Fullstendig oppløse lipidene ved sonikering. Hvis mediet er ugjennomsiktig etter sonikering, forlenger du sonikeringstiden.Når BSA og lipider oppløses, bør prøvene lagres ved negative 80 grader Celsius og brukes innen to måneder. Tilsett 0,001X insulin, transferrin, natriumselenitt og etanolaminblanding til DMEM/F-12, og filtrer deretter det blandede mediet ved hjelp av et 0,22 mikrometer filter. Før bruk, tilsett menneskelig stamcellefaktor eller SCF og human trombopoietin eller TPO til kulturmediene ved en endelig konsentrasjon på tre nanogram per milliliter hver.Overfør 200 mikroliter av de tidligere forberedte kulturmediene med cytokiner til flate bunnplater på 96 brønner. For å unngå fordampning av mediet, fyll alle ubrukte brønner med 100 til 200 mikroliter PBS. Resuspend de sorterte hematopoietiske stamcellene eller HSC-ene i kulturmedier uten cytokiner ved 60 celler per mikroliter.Aliquot 600 celler i hver brønn. Færre enn 300 celler vil føre til større teknisk variasjon og dyrking av mer enn 1000 celler i en enkelt brønn bør unngås på grunn av næringsmangel eller akkumulering av ugunstige cytokiner eller kjemokiner. Kultur cellene i en fuktet multi-gass inkubator ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksid og 1% oksygen atmosfære.Etter syv dager med dyrking av rensede HSC-er, viste opptil 80% av cellene markør CD34 positive og CD38 negative fenotyper. Det totale celletallet var avhengig av cytokinkonsentrasjonen. Høyere konsentrasjoner av SCF og TPO induserte inntreden i cellesyklusen, spredning og differensiering.Antall fenotypiske HSC-er preget av merket CD34 positiv, CD38 negativ, CD90 positiv og CD45 RA negative fenotyper økte i forhold til SCF- eller TPO-konsentrasjonene, mens frekvensen blant de totale cellene gikk ned. Etter tre måneder med transplantasjon av dyrket voksen benmarg HSC, rekonstituering kan evalueres som en funksjon av deres frekvens i perifert blod av menneskelig CD45 positiv murine, CD45 negative Ter119 negative celler. Tre avstamninger, inkludert CD19 positive B-celler, CD13-negative, CD33-positive myeloide celler og CD3-positive T-celler, ble rekonstituert i NOG-mus transplantert med enten nytintede eller kultiverte HSC-er.Etter kultur kan HSC-er bli utsatt for genuttrykksprofilering som PCR- og RNA-sekvensering i sanntid. Funksjonell validering ved hjelp av transplantasjon til immundefektende mus kan også utføres. Forskere kan direkte sammenligne sykling og passiv HSC under definerte forhold ved å justere cytokinkonsentrasjoner.Dette vil bidra til å forstå de passive HSC-spesifikke selvfornyelsesprogrammene, stressmotstandsmekanismene og metabolske egenskaper, som er vanskelige å teste in vivo-innstillinger.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Bruk av menneskelige perivaskulær stamceller for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestilling av enkeltceller og enkelt Embryoet i 3D Confinement: En ny enhet for høyt innhold Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimalisere Vedlegg of Human stamceller på Poly (ε-kaprolakton) elektrospunnede Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Menneskelige Pluripotent stamceller kultur på polyvinylacetat alkohol-Co-Itaconic syre Hydrogels med varierende stivhet Under Xeno-gratis forhold

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering av voksen Human dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering av indusert Pluripotent stamceller ved hjelp av en ikke-integrering metode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...