Name: a culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells
Uploaded: 2021-05-17T13:00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим М. Харагути и С. Тамаки за техническую поддержку и лабораторное управление, а также К. Широшиту за фотографирование. HK была частично поддержана грантом KAKENHI от MEXT/JSPS (грант No 19K17847) и Национальным центром глобального здравоохранения и медицины. КТ была частично поддержана грантами KAKENHI от MEXT/JSPS (грант No 18H02845 и 18K19570), Национальным центром глобального здравоохранения и медицины (грант No 26-001 и 19A2002), AMED (грант No. JP18ck0106444, JP18ae0201014 и JP20bm0704042), Фонд медицинских исследований Ono, Фонд медицинских исследований Кандавы и Научный фонд Такеды.

<ol>
	<li>Scala, S., Aiuti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+human+hematopoietic+stem+cells:+novel+concepts+and+future+directions.">In vivo dynamics of human hematopoietic stem cells: novel concepts and future directions.</a> Blood Advances. 3 (12), 1916-1924 (2019).</li><li>Trumpp, A., Essers, M., Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Awakening+dormant+haematopoietic+stem+cells.">Awakening dormant haematopoietic stem cells.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (3), 201-209 (2010).</li><li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 514 (7522), 322-327 (2014).</li><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Lee-Six, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+dynamics+of+normal+human+blood+inferred+from+somatic+mutations.">Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations.</a> Nature. 561 (7724), 473-478 (2018).</li><li>Osorio, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+Mutations+Reveal+Lineage+Relationships+and+Age-Related+Mutagenesis+in+Human+Hematopoiesis.">Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis.</a> Cell Reports. 25 (9), 2308-2316 (2018).</li><li>Rodriguez-Fraticelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+lineage+fate+in+native+haematopoiesis.">Clonal analysis of lineage fate in native haematopoiesis.</a> Nature. 553 (7687), 212-216 (2018).</li><li>Pineault, N., Abu-Khader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+umbilical+cord+blood+stem+cell+expansion+and+clinical+translation.">Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Wagner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft.">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li><li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation+using+single+UM171-expanded+cord+blood:+a+single-arm,+phase+1-2+safety+and+feasibility+study.">Hematopoietic stem cell transplantation using single UM171-expanded cord blood: a single-arm, phase 1-2 safety and feasibility study.</a> Lancet Haematology. 7 (2), 134-145 (2020).</li><li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells.">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li><li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells.">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li><li>Mendelson, A., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+niche+maintenance+during+homeostasis+and+regeneration.">Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration.</a> Nature Medicine. 20 (8), 833-846 (2014).</li><li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood.">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+targets+on+the+surface+of+CD34+CD38-+bone+marrow+cells+in+myelodysplastic+syndromes.">Detection of molecular targets on the surface of CD34+CD38- bone marrow cells in myelodysplastic syndromes.</a> Cytometry A. 77 (9), 840-848 (2010).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Bai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+primitive+human+hematopoietic+stem+cells+by+culture+in+a+zwitterionic+hydrogel.">Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel.</a> Nature Medicine. 25 (10), 1566-1575 (2019).</li><li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li><li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal.">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Optimization+Enables+Maintenance+of+Quiescent+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo.">Environmental Optimization Enables Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+human+SCID-repopulating+cells+under+hypoxic+conditions.">Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).</li><li>Kikushige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Flt3+is+expressed+at+the+hematopoietic+stem+cell+and+the+granulocyte/macrophage+progenitor+stages+to+maintain+cell+survival.">Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+All-Recombinant+Protein-Based+Culture+System+Specifically+Identifies+Hematopoietic+Stem+Cell+Maintenance+Factors.">An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов, связанного с этим исследованием.

В последнее время было зарегистрировано несколько методов расширения ГХК сминимальной дифференциацией 18,19,20,21. Хотя эти методы превосходны, HSCs вынуждены активировать свои клеточные циклы в присутствии высоких уровней цитокинов, что отличается от ситуации in vivo, в которой HSCs показывают минимальный цикл. Этот протокол полезен для поддержания HSCs как тихие, как наблюдается in vivo, путем повторения микроокноронности костного мозга.
Путем культивирования человеческих HSCs под низким содержанием цитокинов, богатых липидами и гипоксических условиях, HSCs показали минимальную езду на велосипеде, сохраняя при этом свои маркерные фенотипы. Критическим шагом в этом протоколе является подготовка среды, содержащей высокую концентрацию жирных кислот и холестерина и низкие концентрации цитокинов и культуры при гипоксии (Шаг 1, Шаг 2 и Шаг 4). Без холестерина и/или жирных кислот уровень содержания ВКС при низких концентрациях цитокинов снижаетсяна 22. Культивирование клеток в гипоксических условиях также важно, как сообщалось ранее23.
Условия культуры были аналогичны условиям, используемым для мурин HSCs, за исключением концентраций цитокинов. Murine HSCs выживают без TPO, в то время как человеческие HSCs требуют по крайней мере 2 нг/мл TPO с 3 нг/мл SCF22. Поскольку концентрация ТПО намного выше, чем в сыворотке крови человека (100 пг/мл), условия, используемые в этом протоколе, могут быть отсутствуют конкретные факторы для поддержки выживания человека HSCs. FLT3 выражается на человека HSCs24. Добавление его лиганд FLT3LG немного снижает потребность в TPO для поддержания HSCs22.
Человеческие ГКС требуют более высоких концентраций холестерина по сравнению с мурин HSCs, предположительно из-за неспособности вызвать выражение холестерина синтеза ферментов и восприимчивость к липопоксии при высоких концентрациях (> 400 мкг / мл) жирных кислот22. Хотя только сочетание пальмитических, олеитовых, линолевых и стеарный кислот был протестирован, которые в изобилии находятся в сыворотке крови человека, другие комбинации липидов должны быть оценены, чтобы уменьшить липоптоксичность и улучшить скорость поддержания функциональных HSCs.
Хотя активность перенаселения культурных человеческих HSCs у иммунодефицитных мышей после двух недель культуры былаподтверждена 22, эта система культуры не полностью резюмировать нишевые функции HSCs in vivo. Выражение CD45RA, как сообщается, увеличивается, и способность к перенаселению уступает свеже отсортированной HSCs22. Тем не менее, концентрации питательных веществ, таких как глюкоза, аминокислоты, пируват и инсулин, которые добавляются в среду на супрафизиологических уровнях, могут быть оптимизированы. Загрязнения в BSA также могут поставить под угрозу обслуживание HSCs18,25. Кроме того, некоторые культурные клетки подвергаются клеточной смерти, в то время как другие подвергаются клеточной деления; таким образом, содержание общего числа ячеев не может указывать на состояние тихие лампы каждой ячейки.
Несмотря на эти ограничения, культурные условия, описанные в протоколе, разработанном в данном исследовании, помогут продвинуть исследования и инженерные исследования ВКС, особенно в почти физиологических условиях. Культурные условия, которые поддерживают ГКС с минимальной дифференциацией и велосипедной активностью, были бы пригодны для тестирования биологических и химических соединений, специально действующих на ГКС, манипулирования ГКС с помощью лентивирусной трансдукции или редактирования генома без потери ствола, а также для выяснения первоначального этапа трансформации, вызванной генами, связанными с лейкемией.

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) и многопотентные клетки-предшественники (MPPs) координируют формирование резервуара для непрерывного пополнения дифференцированных клеток для поддержания гематопоэза на протяжении всейжизни у человека 1. Сотовый цикл quiescence является важной особенностью HSCs, отличая их от MPPs2. Условно, HSCs, как полагают, находятся на вершине иерархии гематопоэтической системы, производя все дифференцированные клетки крови. Эта иерархическая модель была в основном выведена из трансплантации экспериментов3. Тем не менее, последние исследования показали, что динамика HSCs отличаются в vivo по сравнению с теми, втрансплантации экспериментов 4,5,6,7. Эксперименты по отслеживанию линий с использованием нескольких систем штрих-кодирования показали, что фенотипические murine HSCs не являются уникальным типом клеток, который способствует устойчивому состоянию гематопоеза, и MPPs, которые отображают ограниченную активность самообнажения при трансплантации настройки, непрерывно поставлять зрелыеклетки крови 4,5,8. В отличие от этого, вклад HSCs в зрелые клетки усиливается после травмы костного мозга4. Это может быть связано с резкими изменениями в микроокниронии после абляции костного мозга, включая трансплантацию костного мозга. Хотя применение отслеживания линии murine клеток к клеткам человека трудно, филогенетический анализ, сочетающий одноклеточных полученных колонии изоляции и всего генома секвенирования показали аналогичное свойство гематопоэтического системы, в которой как HSCs и MPPs несут ответственность за ежедневное производство зрелыхклеток 7. Таким образом, хотя трансплантация имеет важное значение для изучения активности мурина или человека HSC, другие экспериментальные модели необходимы, чтобы понять поведение HSCs в физиологических условиях.
Методы культивирования для HSCs были изучены подробно, чтобы понять их клиническое применение и характеристики. Человеческие ГКС могут быть расширены в пробирке с помощью комбинации цитокинов, восстановления внеклеточных матриц, удаления антагонистов самооб обновления, совместной культуры с мезенхимальными или эндотелиальными клетками, добавления альбумин или его замены, трансдукции факторов самооб обновления транскрипции, а также добавления маломоглякулярныхсоединений 9,10. Некоторые из этих методов, в том числе добавление небольших соединений SR111 и UM17112, были протестированы в клинических испытаниях с многообещающими результатами9. Учитывая тихие характер HSCs in vivo, поддержание HSCs с минимальным циклом клеток имеет решающее значение для повторения поведения HSC в пробирке. Куйки и размножающиеся HSCs обладаютдифференциальным клеточным циклом вступления 13,метаболический статус 14, и толерантность против несколькихнапряжений 15 . Методы, используемые для поддержания миокции человеческих HSCs в пробирке ограничены.
Подражая микроокниронированию костного мозга (гипоксического и богатого липидами) и оптимизируя концентрацию цитокинов, ГКС человека могут поддерживаться недифференцированными и тихими в условиях культуры. Повторение тихие характер HSCs in vitro улучшит понимание устойчивых свойств состояния HSCs и позволит экспериментальные манипуляции HSCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human bone marrow CD34+ progenitor cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2M-101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/Shi-scid,IL-2R&#947;KO Jic</td>
			<td>In-Vivo Science Inc.</td>
			<td>https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD34-FITC (clone: 581)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 560942; RRID: AB_10562559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 551400; RRID: AB_394184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45RA-PE</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 555489; RRID: AB_395880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 561558; RRID: AB_10714644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD13-PE (clone: WM15)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 301703; RRID: AB_314179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD33-PE (clone: WM53)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 561816; RRID: AB_10896480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-APC (clone: SJ259)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 363005; RRID: AB_2564127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 561800; RRID: AB_10895381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 563880; RRID:AB_2744402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 103114; RRID: AB_312979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>Cat# 557853; RRID: AB_396898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 553142; RRID: AB_394657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>Cat# 14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>PGLD755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Meiji Seika</td>
			<td>SSDN1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>Cat# P0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>Cat# O0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>Cat# C0318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 017-2995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#65381;2Na</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 345-01865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparine Na</td>
			<td>MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO.,&#160;LTD.</td>
			<td>Cat# 224122557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>Cat# 193-17791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>Cat#&#160; 10927-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat# 300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat# 300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Flt3 ligand</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat# 300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow-Check Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# 7547053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria3u</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator)</td>
			<td>VELVO-CLEAR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas cylinder</td>
			<td>KOIKE SANSHO CO., LTD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulator</td>
			<td>Astec</td>
			<td>Cat# IM-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multigas incubator</td>
			<td>Astec</td>
			<td>Cat# SMA-30DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube, 16 mL</td>
			<td>Maruemu corporation</td>
			<td>N-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube, 50 mL</td>
			<td>Maruemu corporation</td>
			<td>NX-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells

Человеческие гематопоэтические стволовые клетки (ГСК), как и другие млекопитающие ВКС, поддерживают пожизненный гематопоэз в костном мозге. HSCs остаются тихими in vivo, в отличие от более дифференцированных прародителей, и вступают в клеточный цикл быстро после химиотерапии или облучения для лечения травмы костного мозга или культуры in vitro. Имитируя микрооквидение костного мозга в присутствии обильных жирных кислот, холестерина, низкой концентрации цитокинов и гипоксии, ГКС человека поддерживают кияние в пробирке. Здесь описан подробный протокол для поддержания функциональных HSCs в состоянии quiescent in vitro. Этот метод позволит изукомить поведение человека HSCs в физиологических условиях.

После 7 дней культивирования очищенных HSCs, до 80% клеток отображаютсямаркер фенотипы CD34 и CD38- ( Рисунок 4A). Общее количество клеток зависело от концентрации цитокинов(рисунок 4B). Более высокие концентрации SCF и TPO индуцированных вступления в клеточный цикл, пролиферации и дифференциации (рисунок 4B). Количество фенотипических ГСК, характеризующихся маркерными фенотипамиCD34и CD38 - CD90иCD45RA -увеличилось пропорционально концентрациям SCF или TPO(рисунок 4B), в товремя как частота среди общих клеток уменьшилась(рисунок 4C). Общее число ячеек было равным в комбинациях SCF 1,5 нг/мл и 4 нг/мл TPO и 3 ng/mL SCF 3 и 2 ng/mL TPO, что свидетельствует о том, что HSCs являются тихими при минимальной активации клеточного цикла. Учитывая индивидуальные различия, цитокины titration рекомендуется для каждого донора костного мозга.
После 3 месяцев трансплантации культурных взрослых костного мозга HSCs, восстановление может быть оценена как их частота в периферической крови человека CD45 "мурин CD45- Ter119-клеток. Три линии, включая CD19 "В-клеток, CD13/CD33" миелоидных клеток, и CD3 "Т-клеток были восстановлены в NOG мышей пересажены либо только что оттаяли HSCs или культурных HSCs (Рисунок 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig01.jpg"> Рисунок 1. Обзор процедуры. Графическое резюме процедуры включало сортировку, культивирование и анализ гематопоэтических стволовых клеток человека (HSCs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig02.jpg"> Рисунок 2. Процедура испарения метанола из липидного раствора. A) Газовый баллон с газовым регулятором. B) Процедура передачи азотного газа через липидный раствор, растворенный в метаноле. C) Липиды, прилипающие к нижней части стеклянной трубки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig03.jpg"> Рисунок 3. Стратегия Гэтинга для сортировки HSCs. Сюжеты показывают закрытые CD34иCD38-CD90иCD45RA- ячейки. Приблизительно 10% клеток CD34были фенотипическими HSCs. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig03large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig04.jpg"> Рисунок 4. Представитель номера клеток после 7 дней культивирования. A) Представитель флуоресценции активированных клеток сортировки участка после культивирования HSCs в SCF (3 нг/мл) и TPO (2 нг/мл). Фракция 1 была обогащена для живых клеток, фракция 2 была обогащена для мертвых клеток, и фракция 3 была обогащена для мусора. Числа, окрашенные в розовый цвет, указывают на частоту (%) закрытой фракции. B) Количество всех HSCs,CD34и CD38- клетки, и CD34- CD38 - CD90иCD45RA -клетки после культивирования 600 HSCs в указанных условиях цитокинов. Красные пунктичные линии указывают на начальное количество входных ячеек. С: СКФ, Т: ТПО. Среднее ± стандартное отклонение, n No 4. Цифры, следующие за S и T, указывают на концентрацию (нг/мл) каждого цитокина. C) Частота CD34иCD38 - и CD34- CD38 - CD90-CD45RA- клетки в условиях указанного цитокина. С: СКФ, Т: ТПО. Среднее ± стандартное отклонение, n No 4. Бары ошибок для ячеек, обучтено в SCF (1 нг/мл) и TPO (0 нг/мл), были опущены из-за их высоких значений (37,7 и 47,9 соответственно). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig05.jpg"> Рисунок 5. Представитель FACS участки донорских мышей после 3 месяцев трансплантации. В общей сложности 5000 свежеоттая (верхние панели) и 2-недельные культурные HSCs (3 нг/мл SCF и 3 нг/мл TPO; нижние панели) были пересажены в NOG мышей. hCD19 отмечает клетки B человека, hCD13 и hCD33 отмечают человеческие миелоидные клетки, а hCD3 отмечает Т-клетки человека. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig05large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Этот протокол позволяет поддержание тихие человеческие гематопоэтические стволовые клетки в пробирке, имитируя микрооквидение костного мозга с использованием обильных жирных кислот, холестерина, более низкие концентрации цитокинов, и гипоксии.

Метод культуры для поддержания тихие человеческие гематопоэтические стволовые клетки

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Клеточный цикл quiescence является ключевой особенностью гематопоэтических стволовых клеток. Этот протокол помогает понять поведение тихие человеческие HSCs in vitro вблизи физиологических условий. Используя этот протокол, исследователи могут проверить влияние различных соединений, питательных веществ или белков, которые регулируют состояние клеточного цикла, а также дифференциацию ГКС в масштабируемой манере без использования моделей животных.Противоопухоляющие препараты имеют различное влияние на выживание тихие HSCs и велосипедных прародителей. Этот протокол позволяет найти агенты, которые щадят тихие HSCs или агентов, которые избирательно повреждения тихие лейкемические стволовые клетки. Демонстрацией процедуры будет Хироси Кобаяси, старший научный сотрудник лаборатории Такубо.Для начала растворите 16 миллиграммов на миллилитр натрия пальмитата, 30 миллиграммов на миллилитр олеата натрия и четыре миллиграмма на миллилитр холестерина в метаноле в стеклянных трубках. Храните липидные растворы при отрицательном 30 градусов по Цельсию и оттаивать их перед использованием. В свежей стеклянной трубке смешайте липидные растворы, чтобы получить окончательную концентрацию 100 микрограммов на миллилитр пальмитата, 100 микрограммов на миллилитр олеата и 20 микрограмм на миллилитр холестерина.Испарить метанол, передав азотный газ через липидный раствор. Полностью испарить оставшийся метанол, нагревая стеклянную трубку в водяной бане при 37 градусах цельсия. Подготовка DMEM/F-12 среды с HEPES и глутамин.Добавьте пенициллин и стрептомицин сульфат для окончательной концентрации 50 единиц и 50 микрограмм на миллилитр соответственно. Среда может храниться при четырех градусах по Цельсию в течение не менее двух месяцев. Добавьте 4% BSA в среду DMEM/F-12 с HEPES и глутамином, затем отрегулируйте рН среднего до 7,6 с использованием гидроксида натрия.Добавьте среду в стеклянную трубку с липидами. Полностью растворите липиды с помощью звуковой данных. Если среда непрозрачна после звукового око, продлите время звукового окония.Когда BSA и липиды растворяются, образцы должны храниться при отрицательном 80 градусов по Цельсию и использоваться в течение двух месяцев. Добавьте 0,001X инсулина, трансферрина, натрия населита и этанола амина смеси DMEM/F-12, а затем фильтровать смешанную среду с помощью 0,22 микрометрового фильтра. Перед использованием добавьте фактор стволовых клеток человека или СКФ и тромбопоэтин человека или ТПО в культурные средства массовой информации при конечной концентрации в три нанограмма на миллилитр каждый.Перенесите 200 микролитров ранее подготовленных культурных медиа с цитокинами на плоские нижние 96-колодецные пластины. Чтобы избежать испарения среды, заполните все неиспользованные скважины 100-200 микролитров PBS. Resuspend отсортированы гематопоэтические стволовые клетки или HSCs в культурных средствах массовой информации без цитокинов на 60 клеток на микролитер.Aliquot 600 клеток в каждой хорошо. Менее 300 клеток приведет к более крупным техническим изменениям и культивирования более 1000 клеток в одном колодец следует избегать из-за лишения питательных веществ или накопления неблагоприятных цитокинов или хемокиных. Культура клеток в увлажненной многоясной инкубатор при 37 градусах цельсия в 5%углекислого газа и 1%кислородной атмосфере.После семи дней культивирования очищенных ГКС, до 80% клеток отображаются маркер CD34 положительные и CD38 отрицательных фенотипов. Общее количество клеток зависело от концентрации цитокинов. Более высокие концентрации СКФ и ТПО индуцируют вступление в клеточный цикл, пролиферацию и дифференциацию.Количество фенотипических ГХК, характеризующихся маркером CD34 положительные, CD38 отрицательные, CD90 положительные и CD45 RA отрицательные фенотипы увеличились пропорционально концентрации SCF или TPO в то время как частота среди общих клеток снизилась. После трех месяцев трансплантации культурных взрослых ВКС костного мозга, восстановление может быть оценено как функция их частоты в периферической крови человека CD45 положительный мурин, CD45 отрицательных Тер119 отрицательных клеток. Три линии, включая CD19 положительные В-клетки, CD13 отрицательный, CD33 положительные миелоидные клетки, и CD3 положительные Т-клетки были восстановлены в NOG мышей пересажены либо только что оттаяли или культурных HSCs.Следуя культуре, ГКС могут подвергаться профилированию экспрессии генов, таким как ПЦР в реальном времени и секвенирование РНК. Функциональная проверка с использованием трансплантации в иммунной дефицит мышей также может быть выполнена. Исследователи могут напрямую сравнить велосипедные и тихие HSCs в определенных условиях путем корректировки концентраций цитокинов.Это поможет понять, что такое тихие программы самообувещения HSC, механизмы стрессоустойчивости и метаболические свойства, которые трудно проверить в настройках vivo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Использование прав Периваскулярная стволовых клеток для регенерации костной

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Заказ отдельных клеток и Single зародышами в 3D конфайнмента: Новое устройство для высокого содержания скрининга

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Оптимизация пристрастие к мезенхимальных стволовых клеток человека на поли (ε-капролактон) Electrospun пряжи

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Культура человека плюрипотентных стволовых клеток на поливинилового спирта Co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости Xeno свободных условиях

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Протокол для передачи микроРНК в взрослого костного мозга-производные гемопоэтических стволовых клеток для включения клеточной инженерии, в сочетании с магнитной ориентации

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Изоляция взрослых человека дермальных фибробластов от кожи брюшной полости и поколение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием неинтегрирующего метода

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...