Cellcykel quiescence är en viktig egenskap hos hematopoetiska stamceller. Detta protokoll hjälper till att förstå beteendet hos quiescent mänskliga HSCs in vitro under nära fysiologiska förhållanden. Med hjälp av detta protokoll kan forskare testa effekten av olika föreningar, näringsämnen eller proteiner som reglerar cellcykelstatusen samt differentiering av HSCs på ett skalbart sätt utan att använda djurmodeller.
Läkemedel mot cancer har olika effekter på överlevnaden av quiescentA HSCs och cykel avkomma. Detta protokoll gör det möjligt att hitta medel som skonar quiescent HSCs eller medel som selektivt skadar quiescent leukemic stamceller. Hiroshi Kobayashi, en senior forskare från Takubolaboratoriet, kommer att demonstrera proceduren.
Till att börja med, lös upp 16 milligram per milliliter natriumpalmitat, 30 milligram per milliliter natriumoleat och fyra milligram per milliliter kolesterol i metanol i glasrör. Förvara lipidlösningarna på minus 30 grader Celsius och tina dem före användning. Blanda lipidlösningarna i ett färskt glasrör för att erhålla den slutliga koncentrationen på 100 mikrogram per milliliterpalmit, 100 mikrogram per milliliter oleat och 20 mikrogram per milliliterkolerolol.
Avdunsta metanolen genom att överföra kvävegas genom lipidlösningen. Avdunsta helt den återstående metanolen genom att värma glasröret i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Förbered DMEM/F-12 medium med HEPES och glutamin.
Tillsätt penicillin och streptomycinsulfat för en slutlig koncentration på 50 enheter respektive 50 mikrogram per milliliter. Mediet kan lagras vid fyra grader Celsius i minst två månader. Tillsätt 4 % av BSA till DMEM/F-12 medium med HEPES och glutamin och justera sedan pH-talet för mediet till 7,6 med natriumhydroxidlösning.
Tillsätt mediet i glasröret med lipiderna. Lös upp lipiderna helt genom ultraljudsbehandling. Om mediet är ogenomskinligt efter ultraljudsbehandling, förläng ultraljudsbehandlingstiden.
När BSA och lipider löses upp ska proverna förvaras vid minus 80 grader Celsius och användas inom två månader. Tillsätt 0,001X insulin, transferrin, natriumsyreit och etanolaminblandning till DMEM/F-12 och filtrera sedan det blandade mediet med ett 0,22 mikrometerfilter. Före användning, tillsätt human stamcellsfaktor eller SCF och humant trombopoietin eller TPO till odlingsmedierna vid en slutlig koncentration av tre nanogram per milliliter vardera.
Överför 200 mikroliter av det tidigare beredda odlingsmedierna med cytokiner till platt botten 96-brunnsplattor. För att undvika avdunstning av mediet, fyll alla oanvända brunnar med 100 till 200 mikroliter PBS. Återanvänd de sorterade hematopoetiska stamcellerna eller HSC:erna i odlingsmedier utan cytokiner vid 60 celler per mikroliter.
Aliquot 600 celler i varje brunn. Färre än 300 celler kommer att leda till större teknisk variation och odling av mer än 1 000 celler i en enda brunn bör undvikas på grund av näringsbrist eller ackumulering av ogynnsamma cytokiner eller kemokiner. Kultur cellerna i en fuktad multigasinkubator vid 37 grader Celsius i en 5%koldioxid och 1%syre atmosfär.
Efter sju dagar av odling av de renade HSCs visade upp till 80% av cellerna markör CD34 positiva och CD38 negativa fenotyper. Det totala cellnumret berodde på cytokinkoncentrationen. Högre koncentrationer av SCF och TPO inducerad inträde i cellcykeln, spridning och differentiering.
Antalet fenotypiska HSCs kännetecknas av markör CD34 positiva, CD38 negativa, CD90 positiva och CD45 RA negativa fenotyper ökade i proportion till SCF eller TPO koncentrationer medan frekvensen bland de totala cellerna minskade. Efter tre månader av transplantation av odlade vuxna benmärg HSCs, rekonstitution kan utvärderas som en funktion av deras frekvens i perifert blod av mänskliga CD45 positiva murin, CD45 negativa Ter119 negativa celler. Tre härstamningar inklusive CD19 positiva B celler, CD13 negativa, CD33 positiva myeloiska celler och CD3 positiva T celler rekonstituerades i NOG möss transplanteras med antingen ny tinade eller odlade HSCs.
Efter kultur kan HSCs utsättas för genuttryck profilering såsom realtid PCR och RNA sekvensering. Funktionell validering med transplantation till immunbrist möss kan också utföras. Forskare kan direkt jämföra cykling och quiescent HSCs under definierade förhållanden genom att justera cytokinkoncentrationer.
Detta hjälper till att förstå de quiescentA HSC-specifika självförnyelseprogrammen, stressresistensmekanismer och metaboliska egenskaper, som är svåra att testa in vivo-inställningar.
