Name: microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions at JoVE.com

We danken mevrouw Seshmalini Srinivasan, de heer Stephen Butler en mevrouw Pamela Spellman voor experimentele hulp en mevrouw Dana Youssef voor het redigeren van het manuscript. De financieringssteun van USAMRDC wordt dankbaar erkend. De Geneva Foundation droeg bij aan dit werk en werd ondersteund door fondsen van het Military and Operational Medicine Research Area Directorate III via het US Army Research Office.
Disclaimer:
Materiaal is beoordeeld door het Walter Reed Army Institute of Research. Er is geen bezwaar tegen de presentatie en/of publicatie ervan. De meningen of beweringen die hierin zijn opgenomen, zijn de privé-opvattingen van de auteur en mogen niet worden opgevat als officieel, of als een weerspiegeling van ware opvattingen van het ministerie van het leger of het ministerie van Defensie. Onderzoek werd uitgevoerd onder een goedgekeurd protocol voor diergebruik in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit in overeenstemming met de Animal Welfare Act en andere federale statuten en voorschriften met betrekking tot dieren en experimenten met dieren en houdt zich aan de principes die zijn vermeld in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NRC-publicatie, editie 2011.

Dierbehandeling en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met Europese, nationale en institutionele richtlijnen voor dierverzorging. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het US Army Center for Environmental Health Research, nu Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) en uitgevoerd in een faciliteit die is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). OP...

<ol>
	<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Architecture+of+the+Mouse+Nervous+System.">Molecular Architecture of the Mouse Nervous System.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li><li>Ackerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Major Structures and Functions of the Brain. 2, (1992).</li><li>P, T. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2019).</li><li>Paramvir, T. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> StatPearls. , (2019).</li><li>Javed, K., Reddy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , (2020).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+neocortex:+a+perspective+from+developmental+biology.">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).</li><li>Fern&#225;ndez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+cortex+expansion+and+folding:+what+have+we+learned.">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li><li>Pessoa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+brain+networks+and+brain+organization.">Understanding brain networks and brain organization.</a> Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).</li><li>Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+Brain+Complexity+Using+Single-cell+Sequencing.">Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).</li><li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level.">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li><li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex.">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li><li>Winrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+anatomical+isolation+of+functional+sleep+circuits+exhibits+distinctive+regional+and+circadian+gene+transcriptional+profiles.">Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles.</a> Brain Research. 1271, 1-17 (2009).</li><li>Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Laser+Capture+Microscopy+Approach+for+the+Microdissection+of+Discrete+Mouse+Brain+Regions+for+Total+RNA+Isolation+and+Downstream+Next-Generation+Sequencing+and+Gene+Expression+Profiling.">Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).</li><li>Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+Frozen+Rodent+Brain+Regions+for+Downstream+Analyses.">Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).</li><li>Muhie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+transcriptome+profiles+in+mouse+model+simulating+features+of+post-traumatic+stress+disorder.">Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder.</a> Molecular Brain. 8, 14 (2015).</li><li>Hammamieh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+repeated+exposures+to+conspecific+trained+aggressors+simulates+features+of+post-traumatic+stress+disorder.">Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder.</a> Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , (2008).</li><li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Coronal Plates and Diagrams. , (2019).</li><li>Slotnick, B. M., Leonard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+atlas+of+the+albino+mouse+forebrain.+Rockville,+MD,+Alcohol,+Drug+Abuse+and+Mental+Health+Administration,+1975.">Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975.</a> Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).</li><li>Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie Du Syst&#232;me Nerveux de L'homme Et Des Vert&#233;br&#233;s. Anglais. , (1995).</li><li>Spijker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+Frozen+Rodent+Brain+Regions+for+Downstream+Analyses.">Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).</li><li>Sultan, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Different+Areas+from+Mouse+Hippocampus.">Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus.</a> Bio Protocols. 3 (21), (2013).</li><li>Chakraborty, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+stress+history+interplay+in+emergence+of+PTSD-like+features.">Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features.</a> Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+rat+brain+for+RNA+or+protein+extraction+from+specific+brain+region.">Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).</li><li>Rajmohan, V., Mohandas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbic+system.">The limbic system.</a> Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).</li></ol>

Het zoogdierbrein is een complex orgaan dat bestaat uit een reeks morfologisch verschillende en functioneel unieke cellen met diverse moleculaire handtekeningen en meerdere regio's die gespecialiseerde en discrete functies uitvoeren. De hier gerapporteerde dissectieprocedure kan meerdere doelen hebben, afhankelijk van de vereisten van het laboratorium. In ons lab beoordeelden we transcriptie in meerdere hersengebieden verzameld van muizen die werden blootgesteld aan PTSS zoals stress16 . We willen...

De hersenen, samen met het ruggenmerg en het netvlies, vormen het centrale zenuwstelsel dat complex gedrag uitvoert, gecontroleerd door gespecialiseerde, nauwkeurig gepositioneerde en interagerende celtypen in het hele lichaam1. De hersenen zijn een complex orgaan met miljarden onderling verbonden neuronen en glia met nauwkeurige circuits die tal van functies uitvoeren. Het is een bilaterale structuur met twee verschillende lobben en diverse cellulaire componenten2. Het ruggenmerg verbindt de hersenen met de buitenwereld en wordt beschermd door bot, hersenvliezen en hersenvocht en routeert berichten van en naar de hersenen 2,3,4. Het oppervlak van de hersenen, de hersenschors, is ongelijk en heeft verschillende plooien, gyri genaamd, en groeven, sulci genaamd, die de hersenen scheiden in functionele centra5. De cortex is glad bij zoogdieren met een klein brein 6,7. Het is belangrijk om de architectuur van het menselijk brein te karakteriseren en te bestuderen om de aandoeningen te begrijpen die verband houden met de verschillende hersengebieden, evenals de functionele circuits ervan. Neurowetenschappelijk onderzoek is de afgelopen jaren uitgebreid en er worden verschillende experimentele methoden gebruikt om de structuur en functie van de hersenen te bestuderen. Ontwikkelingen op het gebied van moleculaire en systeemniveau biologie hebben een nieuw tijdperk ingeluid van het onderzoeken van de complexe relatie tussen hersenstructuren en het functioneren van moleculen. Bovendien breiden moleculaire biologie, genetica en epigenetica zich snel uit, waardoor we onze kennis van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij het functioneren van systemen kunnen vergroten. Deze analyses kunnen op een veel meer gelokaliseerde basis worden uitgevoerd, om te helpen bij het onderzoeken en ontwikkelen van effectievere therapieën.
Het zoogdierbrein is structureel gedefinieerd in duidelijk identificeerbare discrete gebieden; de functionele en moleculaire complexiteit van deze discrete structuren zijn echter nog niet duidelijk begrepen. De multidimensionale en meerlagige aard van het hersenweefsel maakt dit landschap moeilijk te bestuderen op functioneel niveau. Bovendien bemoeilijkt het feit dat meerdere functies door dezelfde structuur worden uitgevoerd en vice versa het begrip van de hersenen verder8. Het is van vitaal belang dat de experimentele benadering die wordt uitgevoerd voor de structurele en functionele karakterisering van hersengebieden nauwkeurige onderzoeksmethoden gebruikt om consistentie te bereiken in bemonstering voor het correleren van neuroanatomische architectuur met functie. De complexiteit van de hersenen is onlangs verklaard met behulp van single cell sequencing 9,10, zoals de temporale gyrus van het menselijk brein die is samengesteld uit 75 verschillende celtypen11. Door deze gegevens te vergelijken met die uit een analoog gebied van het muizenbrein, onthult de studie niet alleen overeenkomsten in hun architectuur en celtypen, maar presenteert ook de verschillen. Om de complexe mechanismen te ontrafelen, is het daarom belangrijk om verschillende hersengebieden met volledige precisie te bestuderen. Geconserveerde structuren en functies tussen een menselijk en muisbrein maken het gebruik van een muis mogelijk als een voorlopig surrogaat voor het ophelderen van de menselijke hersenfunctie en gedragsuitkomsten.
Met de vooruitgang van systeembiologische benaderingen is het verkrijgen van informatie uit discrete hersengebieden bij knaagdieren een belangrijke procedure geworden in neurowetenschappelijk onderzoek. Hoewel sommige protocollen zoals laser capture microdissection12 duur kunnen zijn, zijn mechanische protocollen goedkoop en worden ze uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare tools13,14. We hebben meerdere hersengebieden gebruikt voor transcriptomische assays15 en hebben een hands-on en snelle procedure ontwikkeld om de hersengebieden van muizen die van belang zijn in korte tijd stap voor stap te ontleden. Eenmaal ontleed, kunnen deze monsters onmiddellijk in koude omstandigheden worden opgeslagen om de nucleïnezuren en eiwitten van deze weefsels te behouden. Onze aanpak kan sneller worden uitgevoerd, wat leidt tot een hoge efficiëntie en minder kans op weefselverslechtering mogelijk maakt. Dit verhoogt uiteindelijk de kans op het genereren van hoogwaardige, reproduceerbare experimenten met behulp van hersenweefsels.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td>5.5&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6763</td>
			<td>5.5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6703</td>
			<td>4.75&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td>4.75&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved Sharp/Sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula, radius and tapered flat ends</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stainless steel mirror finish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 6.5&#34;</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6846</td>
			<td>curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth 2mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur (optional)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8321 many styles to choose</td>
			<td>Lempert Rongeur 6.5&#34; 2X8mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super fine forceps Inox</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-4955</td>
			<td>tip size 0.025 X 0.005 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A magnification visor</td>
			<td>Penn Tool Col</td>
			<td>40-178-6</td>
			<td>2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection cold plate</td>
			<td>Cellpath.com</td>
			<td>JRI-0100-00A</td>
			<td>Iceberg cold plate &#38; base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps, full curve extra delicate</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5138</td>
			<td>0.5 mm Tip 4&#8221; (10 cm) long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843 (repeated above)</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades (especially #11)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11 (repeated above)</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>MS-SQRD9-4</td>
			<td>Double Ended Spatula Square AND Round End</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160 (repeated above)</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions

De hersenen zijn het commandocentrum voor het zenuwstelsel van zoogdieren en een orgaan met een enorme structurele complexiteit. Beschermd in de schedel, bestaan de hersenen uit een buitenste bedekking van grijze stof over de hemisferen die bekend staat als de hersenschors. Onder deze laag bevinden zich vele andere gespecialiseerde structuren die essentieel zijn voor meerdere fenomenen die belangrijk zijn voor het bestaan. Het verkrijgen van monsters van specifieke grove hersengebieden vereist snelle en nauwkeurige dissectiestappen. Het is duidelijk dat er op microscopisch niveau veel subregio's bestaan en waarschijnlijk de willekeurige regionale grenzen overschrijden die we opleggen met het oog op deze dissectie.
Muismodellen worden routinematig gebruikt om menselijke hersenfuncties en ziekten te bestuderen. Veranderingen in genexpressiepatronen kunnen beperkt zijn tot specifieke hersengebieden die gericht zijn op een bepaald fenotype, afhankelijk van de zieke toestand. Het is dus van groot belang om de regulering van transcriptie te bestuderen met betrekking tot de goed gedefinieerde structurele organisatie. Een volledig begrip van de hersenen vereist het bestuderen van verschillende hersengebieden, het definiëren van verbindingen en het identificeren van belangrijke verschillen in de activiteiten van elk van deze hersengebieden. Een uitgebreider begrip van elk van deze verschillende regio's kan de weg vrijmaken voor nieuwe en verbeterde behandelingen op het gebied van neurowetenschappen. Hierin bespreken we een stapsgewijze methodologie voor het ontleden van het muizenbrein in zestien verschillende regio's. In deze procedure hebben we ons gericht op mannelijke muis C57Bl / 6J (6-8 weken oud) hersenverwijdering en dissectie in meerdere regio's met behulp van neuroanatomische oriëntatiepunten om discrete functioneel relevante en gedragsrelevante hersengebieden te identificeren en te bemonsteren. Dit werk zal helpen een sterke basis te leggen op het gebied van neurowetenschappen, wat leidt tot meer gerichte benaderingen in het diepere begrip van de hersenfunctie.

Ons begrip van de complexe hersenstructuur en -functie evolueert en verbetert snel. De hersenen bevatten meerdere verschillende regio's en het bouwen van een moleculaire kaart kan ons helpen beter te begrijpen hoe de hersenen werken. In dit method paper hebben we de dissectie van het muizenbrein in meerdere verschillende regio's besproken (tabel 1). In dit protocol worden de structuren geïdentificeerd op basis van de kritieke oriëntatiepunten en wordt bereikt door het weefsel vochtig te houden met een ...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions at JoVE.com

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.

Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Het bestuderen van verschillende hersengebieden is een opstap naar het begrijpen van de moleculaire en structurele complexiteit van de hersenen. Dit protocol beschrijft een systematische dissectie van muizenhersenen om verschillende hersengebieden te isoleren. In het perspectief van de hersenanatomie is het een top-down benadering die gemakkelijk kan worden gereproduceerd.De voordelen van dit protocol zijn tweeledig. Ten eerste biedt deze benadering een kans om de moleculaire onderbouwing van kleine, maar kritieke hersengebieden te begrijpen. Ten tweede is dit hele dissectieproces voldoende kort om het behoud van moleculaire integriteit te garanderen, een kritieke voorwaarde voor rug- en moleculaire assays.Deze procedure omvat oefening en delicate behandeling. De timing is hier zeer cruciaal om de structurele oriëntatiepunten te behouden en kan worden bereikt met de juiste training en oefening. De procedure van het verwijderen van muizenhersenen zal worden aangetoond door Seid Muhie, een onderzoekschemicus en bio-informaticus uit ons laboratorium.Verdere demonstratie van de procedure van hersendissectie bij muizen is James Meyerhoff, een neurowetenschapper uit ons laboratorium. Om te beginnen, reinig en verwijder de huid voor een goede grip. Klem de maxilla van de onthoofde kop vast met een hemostat en gebruik een gaasje om de hoofdhuid rostrale te reflecteren.Steek de fijne gebogen schaar in het foramen magnum om de klevende hersenvliezen te scheiden. Plaats vervolgens de schaar in de opening van de schedelbasis waar het ruggenmerg passeert met het mes verticaal gericht, maar parallel aan en drukkend tegen het binnenoppervlak van het basale plaatbot, waarbij het blad 45 graden naar de linkerkant en vervolgens naar de rechterkant wordt gedraaid. Verwijder het achterhoofdsbot in het intrapariëtale bot om het cerebellum bloot te leggen.Beweeg de schaar rostrale langs de middelste sagittale hechting tot aan de bregma en knip deze door omhoog te tillen om scheuring van cerebrale cortices te voorkomen. Terwijl de pariëtale botten worden opgetild, identificeert en snijdt u de resterende meningeale aanhechtingen. Maak twee parallelle sneden in het sagittale vlak en verwijder de fragmenten van het frontale bot, vermijd het scheuren van het hersenoppervlak.Terwijl u meningeale aanhechtingen en hersenzenuwen snijdt, keert u de schedel om om de zwaartekracht toe te staan om te helpen bij het verwijderen van de hersenen in een kleine beker die vooraf is gevuld met zoutoplossing. Houd auditieve bulla intact zodat de hypofyseanatomie identificeerbaar is. Maak een extreem kleine parasaggitale snede aan beide zijden in de rand van de membraantent die de hypofyse op zijn plaats houdt en til de achterkwab van de hypofyse op met een ultrafijne tang.Maak een sagittale snede tussen de laterale randen van de voorkwab van de hypofyse in de dichtstbijzijnde trigeminuszenuw en til vervolgens de voorkwab van de hypofyse op. Richt de bron van wit licht over het weefsel. Plaats de hersenen op een voorgekoeld roestvrijstalen blok en houd het blok koud door het te omringen met ijs in een ijskoude zoutoplossing.Bevochtig het weefsel periodiek met ijskoude zoutoplossing om de structuren te behouden. Plaats de hersenen zo dat de cerebrale cortices naar boven zijn gericht. Verwijder met behulp van kleine gebogen tangen het cerebellum.Gebruik de dorsale benadering om de gesloten bladen van een kleine gebogen tang onder het corpus callosum te laten glijden en deze voorzichtig te verspreiden om de neocortex bilateraal in te trekken om de kritisch opvallende middellijnoriëntatiepunten te behouden. Uiteindelijk zouden structuren zoals optische chiasme, hypothalamus, olfactorische bollen, medulla oblongata, hypofyse en pontinebrug zichtbaar zijn. Probeer de hemisferen te scheiden.Draai de ventrale plaats van de hersenen omhoog en maak een mid-sagittale snede vanaf de dorsum tussen de olfactorische bollen in de hersenhelften. Verwijder medulla en scheid vervolgens voorzichtig de twee hemisferen. Maak vervolgens een coronale snede aan de binnenrand van de vijvers om de achterhersenen te verkrijgen en scheid de medulla aan de achterste rand van de vijvers.Draai het hersenweefsel om voor een zorgvuldige scheiding van de twee hersenhelften. Verwijder de olfactorische lamp bij deze stap. Maak een coronale snede een millimeter voor de genu van het corpus callosum en verwijder de accessoire olfactorische bollen, gevolgd door het scheiden van de mediale en laterale prefrontale cortex.Snijd gedeeltelijk horizontaal of coronaal door het transversale deel van de voorste commissure vanaf de middellijn onder de voorste hoorn van de laterale ventrikel om de septumkern dorsaal en het ventrale striatum ventraal te bevrijden. Verwijder de kleine hoeveelheid cortex van het laterale oppervlak om de nucleus sucbence en olfactorische tuberkel te verwijderen. Scheid het rostrale deel van het corpus striatum van de bovenliggende cortex via een gebogen scalpelsnede net buiten de externe capsule.Identificeer de septumkernen of septum en isoleer ze uit deze sectie. Maak een gebogen snede om de hypothalamus bij deze stap te scheiden. Dit zal gebeuren met behulp van een gedeeltelijke coronale snede na de mammillaire lichamen die zich slechts zijdelings uitstrekt als de hypothalamische sulcus.Bevrijd vervolgens de doorsnede van de hypothalamus met een parasagittale snede langs de lengte van de hypothalamussulfcus. Evert de laterale ventrikel om extra intralimbische verbindingen in de resterende limbische systeemcomponenten te onthullen. Aan de binnenkant van de interne cortex wordt een waaierachtige structuur waargenomen na het openen van de ventrikel.Gebruik de waaierachtige structuur in de entorhinale cortex om de marges te definiëren voor dissectie, identificeer en verwijder vervolgens de amygdala, entorhinale cortex, posterieure cingulate cortex en hippocampus. Bevestig de identificatie van de thalamus door visualisatie van de stria medullaris op het dorsale oppervlak dat zich uitstrekt in het midline rostrale corticale vlak. Scheid de thalamus volledig van de middenhersenen door een coronale snede.Dit protocol kan worden gebruikt voor onmiddellijke verwijdering van de hersenen uit de schedel, gevolgd door dissectie. De ontleedde weefsels kunnen later worden bewaard en verwerkt, afhankelijk van de vereisten van het onderzoek. Geëxtraheerd RNA uit meerdere ontleedde weefsels kan worden getest op genexpressie.De representatieve resultaten werden verkregen met behulp van geoogste hersenen die enkele maanden vóór de RNA-extractie bij min 80 graden Celsius werden opgeslagen. Verschillende hersengebieden samen met gewichtsgegevens werden verzameld onder de studie agressor blootgestelde sociale stress model van PTSS. RNA-concentraties en spectrofotometrische metingen worden hier weergegeven.Zorg er bij het volgen van dit protocol voor dat de weefsels te allen tijde worden gekoeld door de hersenen op een ijskoud stalen blok te houden en het weefsel periodiek te overgieten met ijszoutoplossing. Zodra weefsels zijn verzameld en onmiddellijk zijn ingevroren, kunnen ze op een later tijdstip worden gebruikt voor testen zoals transcriptomics, metabolomics en proteomics.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Anatomy of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Mapping Cortical Dynamics Using Simultaneous MEG/EEG and Anatomically-constrained Minimum-norm Estimates: an Auditory Attention Example

Het in kaart brengen Corticale Dynamics Met Gelijktijdige MEG / EEG en Anatomisch beperkt Minimum-norm Schattingen: een auditieve aandacht Voorbeeld

Magneto- and electroencephalography (MEG/EEG) are neuroimaging techniques that provide a high temporal resolution particularly suitable to investigate the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...